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세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

Neuroscience
 

Summary

이 비디오 프로토콜은 신경 식민지 - 형성 세포 분석을 사용하여 신경 전구체 세포의 혼합 인구의 타고난 신경 줄기 세포를 차별하고 열거하는 방법을 보여줍니다.

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Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639, doi:10.3791/2639 (2011).

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Abstract

neurosphere 분석 (NSA)은 분리 확장하고 또한 신경 줄기 세포 (NSCs)의 주파수를 계산하기 위해 가장 자주 사용되는 방법 중 하나입니다. 또한,이 혈청이없는 문화 시스템은 또한 줄기 세포를 확장하고 종양과 정상 조직의 다양한 그들의 주파수를 결정하기 위해 채용되었습니다. 이것은 일대일 관계가 neurosphere 형성과 NSCs 사이에 존재하지 않는다는 것을 최근에 표시되었습니다. 이것은 NSA와 같은 현재 적용가 배아와 성인 포유류의 뇌 모두에서 분리된 신경 전구체 세포의 혼합 인구 NSCs의 빈도를 과대 평가하는 것이 좋습니다. 이 비디오는 거의 세미 솔리드 분석을 기반으로 소설 콜라겐을 보여, 신경 식민지 따라서 자신의 장기 proliferative 가능성에 따라 전구 세포에서 줄기를 차별하는 능력을 가지고 있으며, 세포 분석 (N - CFCA)를 형성하는 방법을 제공합니다 NSC 주파수를 열거할 수 있습니다. 식민지가 <2mm가 progenitors에서 파생하는 동안 N - CFCA에서 직경 식민지 ≥ 2mm는 NSC의 모든 기능 기준을 만족하는 세포에서 파생됩니다. N - CFCA 절차는 기본 및 교양 성인이나 배아 마우스 CNS 세포를 포함하여 서로 다른 소스에서 준비 전지에 사용될 수 있습니다. 여기 통로에서 N - CFCA을 수행하기 위해 배아 일 14 쥐 두뇌에서 발생 한 neurospheres을 준비 세포를 사용합니다. 문화는 도금 세포들이 전체 proliferative 잠재력을 전시 있도록하고 신경 시조와 타고난 신경 줄기 세포의 빈도가 <2mm 아르 콜로니의 수를 계산하여 각각 계산 확산 매체로 삼 주 동안 매일 7 일 보충함 아르 그리고 ≥ 2mm 처음 도금되었습니다 세포의 개수에 대한 언급 손님.

Protocol

1. 전지 도금을하기 전에 준비를해야 항목 :

  1. 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다.
  2. 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 매체의 나누어지는가 해동됩니다.
  3. 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다.
  4. 표피 성장 인자 (EGF), 10 μg / 0.2 %에서 ML과 헤파린의 농도에서 기본 fibroblastic 성장 인자 (B - FGF)의 주식 솔루션은 미리 준비가되어 있습니다.
  5. 실험의 크기에 따라 여러 35mm 조직 문화 요리 판 세포 하나 150-200cm 플라스틱 페트리 접시도 중복 35mm 요리를 개최하는 데 필요한 물을 위해 제 3 35mm 접시 필요합니다.

2. 셀 준비 :

실험에 따라 세포는 성인이나 배아 소스 (주 dissociated 조직 또는 dissociated neurospheres)에서 준비하실 수 있습니다. 성인 / 마우스 배아 중추 신경계 (CNS)에서 조직을 해부하다 또는 다음 1,2 앞에 설명한 배아 - 유래 / 성인 neurospheres을 떼어 놓다 :

  1. 단일 세포 현탁액은 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 전달되도록 같은 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거합니다.
  2. 세포 현탁액의 10μl는 셀 카운트를 수행하는 Trypan 파랑의 90μl와 혼합됩니다 참고 :. 기타 적절한 세포 dilutions도 사용할 수 있습니다.
  3. 기본 배아 또는 성인 파생된 신경 세포를 사용하는 경우, 전체 NSC 매체 6.5 X 10 5 세포 / ML의 농도로 세포 현탁액을 희석. 성인이나 배아 신경 세포에서 파생된 dissociated neurospheres의 세포를 사용하는 경우, 전체 NSC 매체에서 2.2 × 10 5 세포 / ML의 농도로 세포 현탁액을 희석.

3. 세미 솔리드 N - CFCA 매체에 도금 셀 :

  1. 다음과 같은 구성 요소의 적절한 볼륨 복제의 숫자에 따라 순서에 혼합됩니다. 여기 복제 두 필요한 금액을 혼합하거나 요리를 중복. 복제의 추가 숫자, 표 1을 참조하십시오.
    • 크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 매체의 1.7 ML
    • NeuroCult NSC 확산 보조 식품의 330 μL
    • EGF의 6.6 μL (10μg/mL)
    • 페니실린 / 스트렙토 마이신의 32 μL
    • B - FGF (10μg/mL)의 3.3 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다.
    • 헤파린 (0.2 %)의 3.3 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다.
    • 세포 현탁액의 25μL (dissociated neurospheres 또는 6.5 X 10 5 셀 / dissociated CNS 조직에서 ML 기본 세포에서 2.2 X 10 5 셀 / ML 세포) 참고 :. 도금 최종 셀 번호는 35mm 문화 요리 당 2500에 대한 셀해야합니다 neurosphere 파생된 세포 및 기본 세포 35mm 문화 요리 당 7,500 전지. 어떤 경우에는, 최종 세포 도금 밀도는 셀 적정 실험을 수행하여 조정되어야한다. 150 식민지 - 통계 분석을 위해, 문화, 21 일 후에 감지된 식민지의 총 개수는 적어도 50의 범위 내에서하여야한다.
  2. 세포를 포함하는 매체는 추운 콜라겐 솔루션의 1.3 ML이 세포 현탁액에 전송하고 거품을 도입 피하기 위해 부드러운 pipetting으로 잘 혼합됩니다 부드럽게 그리고 혼합이다.
  3. 혼합 솔루션은 각각 35mm 문화 요리 (~ 1.5 ML / 요리)의 중심에 적절하고 요리는 부드럽게 혼합이 접시의 표면 위에 균일하게 분산하도록 원형 운동을 사용하여 밀고있다. .
  4. 중복 35mm 문화 요리는 100mm 페트리 접시에 게재됩니다. 새로운 35mm 요리의 뚜껑을 제거하고 열려있는 요리도 동일한 100mm 페트리 접시에 배치됩니다. 멸균 물이 부화 기간 동안 최적의 습도를 유지하기 위해이 열려 35mm 요리에 추가됩니다. 스퀘어 bioassay 판 (245mm)가 더 많은 복제 35mm 요리가 설정되었을 때 사용됩니다. 다시, 2 또는 멸균 물이 들어있는 3 열 35mm 요리를 포함합니다.
  5. 번호판이 37 보육 세트에 전송 ° C 5 % CO2와 95 %의 습도. 증가 온도 및 겔 형성하여 콜라겐 확대해는 약 한 시간 이내 발생합니다. 문화는이 시간 동안 방해해서는 안됩니다.
  6. 교양 세포 21일 (식민지의 크기의 차이가 명확하게 21일 후 구분할 수)에 incubated 수 있습니다.

4. 보충 매체를 준비하고 문화를 먹이 :

N - CFCA 문화는 시간 (21 일)의 기간 동안 incubated이므로, 문화는 적절한 전체 NeuroCult와 공급한다 보충 매체는 다음과 같이 신선한 준비 :

  • NeuroCult NSC 기초 중형 4.5 ML은 0.5 m로 혼합NeuroCult NSC 확산 보조 식품 후 성장 요인 L이 추가됩니다
  • 10μg/mL EGF 250 μL (0.5 μg / ML EGF의 최종 농도를 제공)
  • 10μg/mL B - FGF (0.25μg/mL B - FGF의 최종 농도를 주다) 125 μL는 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다.
  • 0.2 % 헤파린 125 μL은 culturing 세포가 신경 세포를 성인에서 파생된 경우에만 필요합니다.
  • 적절한 전체 NeuroCult의 보충 매체 (배아 또는 성인 전지)의 60 μL가 전체 NCFC 분석 문화 보육 (21 일) 동안 매 7 일마다 한 각 NCFC 분석 접시의 중앙에 추가됩니다.

5. N - CFC 분석 유래 식민지를 채점하고 타고난 NSCs 및 신경 전구 세포의 빈도를 계산 :

  • 각 35mm 문화 요리는 2.0 mm X 2.0 mm의 격자 크기 gridded 점수 요리에 위치하고 양쪽 요리는 현미경 스테이지에 표시됩니다.
  • 객관 렌즈, 각각의 요리가 스캔되고 식민지가 자신의 크기에 따라 점수 아르 - 낮은 전력을 (배 2.5X)를 사용.
  • 식민지는 두 가지 주요 범주로 분류됩니다 :
    1. 이하 2mm 직경
    2. ≥ 2mm 직경

6. 대표 결과 :

칠일 도금 후 (그림 1) - neurosphere 분석에서와 마찬가지로, N - CFC 분석에 도금 세포 3 이내에 세포의 작은 식민지를 분아 따위에 의해 번식하고되기 시작한다. 2 주 시간에서 다양한 크기의 식민지가 구별하실 수 있습니다. 식민지의 대부분의 14 일 후에 성장을 중지하는 경향이 있지만, 일부 식민지는 크기가 증가되고 있습니다. 1mm 직경, 3) 1 - - 2mm 직경 4) ≥ 2mm 직경 미만 0.5 mm 직경, 2) 0.5 1) : 일 21에 의해 식민지는 4 가지 범주 중 하나에 분류 될 수 있습니다. 실제로, 시조가 파생된로 2mm 직경보다 작은 식민지가라고합니다 (그림 2)와 NSC는 (그림 3)과 같은 파생 식민지는 직경 ≥ 2mm가라고합니다. 도금 총 세포마다 직경 식민지 ≥ 2mm의 숫자는, 장기적인 자기 갱신과 다중 잠재적인 기능을 갖춘 실제 타고난 신경 줄기 세포의 빈도를 나타냅니다. 병렬 NSA 실험에서 7~8일 후 특정 세포 인구의 주파수를 형성 총 neurosphere은 N - CFCA 실험 21 일 후 같은 세포 인구의 주파수를 형성 전체 식민지와 유사한 것으로 추산되었습니다. N - CFCA 그러나, 각 세포는 전체 proliferative 가능성을 보여 줄 수 있도록 같은 더 허용 조건을 제공합니다.

구성 요소 2 복제 3 복제 4 복제
크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 중간 1700 2550 3400
NeuroCult NSC 확산 보조 식품 330 495 660
EGF (10 μg / ML) 6.6 9.9 13.2
성인용 전지 bFGF (10 μg / ML) 3.3 4.95 6.6
성인용 세포에 대한 헤파린 솔루션 (0.2 %), 3.3 4.95 6.6
페니실린 / 스트렙토 마이신 (1:100) 32 48 64
:에서 셀
2.2 X 10 5 교양 세포 / ML 또는
6.5 X 10 5 일차 전지 / ML
25 37.5 50
콜라겐 솔루션 1300 1950 2600

표 1. 완벽한 N - CFC 분석 문화의 구성 요소.

그림 1
1. 통로 하나 E14 마우스 NSCs의 N - CFCA 문화의 대표 식민지 칠일 도금 후 그림. 식민지 다른 형태와 크기를 표시 수도 있습니다. 원본 확대, 4X

그림 2
그림 2. 통과 N - CFCA 문화에서 다른 크기 21일 도금 후에도 E14 마우스 NSCs 대표 시조 파생 식민지. 그림과 같이, 식민지는 다른 형태가 있지만 모든 크기가 적은 2mm입니다. 원본 확대, 4X

그림 3
그림 3. 대표 타고난 줄기 세포는 21일 도금 후 통과 한 E14 마우스 NSCs을의 N - CFCA 문화 식민지를 파생. 줄기 세포 유래 식민지는 (보고 서로 다른 형태를 표시할 수 있습니다비디오)하지만, 모두가 직경 ≥ 2mm입니다. 원본 확대, 4X

Discussion

neurosphere 검정 3,1,2은 성인과 배아 CNS 조직과 같은 다양한 소스로부터 신경 줄기 세포를 분리하고 확장하는 가장 일반적인 방법이지만, 정확하게 신경 전구체 세포의 혼합 인구 NSC 주파수를 측정할 수 없다 (줄기와 progenitors) neurospheres의 수와 타고난 줄기 세포 4의 사이의 숫자 1-1 관계가 아니므로. 이 제한을 해결하려면, 원본 NSA는 신경 줄기와 progenitors은 5-7 삼 주 동안 그들의 전체 확산 용량 성장할 수 있도록처럼 맞게되었습니다. 반 고체 콜라겐 매트릭스가 식민지의 한 도금 세포 및 집계의 마이 그 레이션을 방지 등 액체 NSA 달리, N - CFCA의 식민지 실제로 clonally, 파생됩니다. 이 분석과 일치의 결과를 얻으려면 우리는 좋습니다

  1. 원래 세포 현탁액에서 단일 세포 현탁액을 보장합니다. 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거하는만큼 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 하나의 세포 현탁액 패스.
  2. 얼음 또는 4 ° C 냉장고에있는 콜라겐 솔루션을 유지. 콜라겐은 온도 증가에 의해 확대해으로 세포 현탁액의 혼합에 추가할 수있는 마지막 항목입니다.
  3. 매주 문화를 공급하는 것을 잊지 마십시오. 매 7 일마다 한 성장 인자 (들)을 포함하는 보충 미디어를 추가하면 세포가 확장 문화 기간 동안 세포 분열 따위에 의해 번식을 계속하실 수 있습니다.
  4. 최종 셀 도금 밀도는 중 기본 또는 교양 신경 세포에서 유래 세포에 최적화된되었습니다 있도록 문화 21 일 후에 감지된 식민지의 총 개수 NCFC - A는 적어도 50의 범위 이내 - 200 식민지. 통계 분석에 대한 식민지의 충분한 숫자를 제공함과 동시에이 범위는 샘플의 직경에있는 희귀 NSC 파생 식민지> 2mm의 검색이 가능합니다. 시작 셀 소스에 따라 크게 적은 (<50)과 식민지의 높은 숫자가 (> 250) 때로는 얻을 수 있습니다. 너무 많은 식민지가 정확 콜로니 계수의 결과로 성장 매체 구성 요소의 인구 과잉 anddepletion집니다 동안 부족 식민지는 직경이 검출 수준 아래되고있는 식민지> 2mm가 발생합니다. 따라서 세포 도금 밀도 (즉, 세포 도금의 총 수를 늘리거나 감소) 따라서 조정해야합니다

Disclosures

저자 중 하나, 샤론 A. 루이스는 StemCell Technologies의 병원, 본 연구에서 사용되는 몇 가지 시약의 제작자와 제휴합니다.

Acknowledgements

이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701
NeuroCult NCFC medium Medium Stem Cell Technologies 05720
0.05% trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
Collagen Reagent Stem Cell Technologies 04902
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
35 mm culture dishes Culture ware Stem Cell Technologies 27100
Gridded scoring dishes Culture ware Stem Cell Technologies 27500

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References

  1. Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. (2010).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. (2011).
  3. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  4. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  5. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. (2008).
  6. Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
  7. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).

Comments

4 Comments

  1. Please email me at azari.hassan@gmail.com if you have any questions regarding this assay.

    Reply
    Posted by: Hassan A.
    May 13, 2011 - 6:57 PM
  2. it is really a good video to discriminate the neural stem cell & progenitor cell,i am really impressed to watch this video & i have learned some points also from this. thanks a lot

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 3:57 AM
  3. Hi
    this video demonstration is awesome. I want to know how many times we can do subculture. Coz I did three subcultures. Each time I am dissociating with Neurocult (stem cell) dissociation kit. For the first three subcultres it is forming neurspheres. After three times it is not forming neurospheres. Is it the same case with you. If not why it is not forming neurospheres after three subcultres.

    thank you in advance
    Regards
    Ramesh

    Reply
    Posted by: Ramesh K.
    August 17, 2012 - 10:03 AM
  4. Dear Ramesh,

    Our NeuroCult product scientist alerted us to your inquiry and remarks.

    Could you please contact us at techsupport@stemcell.com and we can troubleshoot what might be occurring. Please put "Culturing NeuroSpheres - Case: 0003303²" in the subject line.

    As well, could you please include some details about your cell source as well as culture conditions?
    Any photos you might be able to provide might also help.

    As well, please let us know if you have any other questions or concerns.

    Thank you

    Reply
    Posted by: Stemcell T.
    August 17, 2012 - 5:17 PM

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