Invitrogen NuPage Novex बीआईएस Tris MiniGels का प्रयोग पश्चिमी सोख्ता

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

यह तकनीकी लेख एक मानक पश्चिमी सोख्ता Invitrogen से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NuPAGE वैद्युतकणसंचलन मिनी जेल प्रणाली का उपयोग कर प्रक्रिया का वर्णन करता है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels. J. Vis. Exp. (7), e264, doi:10.3791/264 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

पश्चिमी सोख्ता (या immunoblotting) के जांचकर्ताओं को एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए अनुमति देता है एक मानक प्रयोगशाला प्रक्रिया है, विभिन्न नमूनों में मौजूद प्रोटीन के रिश्तेदार राशि निर्धारित करते हैं, और सह immunoprecipitation प्रयोगों के परिणामों का विश्लेषण. इस विधि में, एक लक्ष्य प्रोटीन ऊतक homogenate या निकालने के किसी नमूने में एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पाया है. प्रोटीन आणविक भार अनुसार जुदाई एसडीएस पृष्ठ denaturing का उपयोग करने के लिए हासिल की है. एक झिल्ली को स्थानांतरण के बाद, लक्ष्य प्रोटीन एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच है और chemiluminescence द्वारा पता लगाया.

अपनी पहली वर्णन के बाद से, पश्चिमी सोख्ता तकनीक पूर्व डाली जैल और उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण सहित कई सुधार आया है. हमारी प्रयोगशाला में, हम Invitrogen से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NuPAGE वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करने के लिए चुना है. यह एक अभिनव तटस्थ पीएच, असंतत एसडीएस PAGE, पूर्व डाली मिनी जेल प्रणाली है. I) 8 महीने से लेकर 1 वर्ष पूर्व डाली जैल की एक लंबी शैल्फ जीवन, ii) 1 से 400 केडीए के लिए आणविक वजन का एक व्यापक रेंज जुदाई प्रकार के आधार: इस प्रणाली सहित पारंपरिक Laemmli तकनीक से अधिक कई फायदे प्रस्तुत की जेल इस्तेमाल किया, और iii) अधिक से अधिक बहुमुखी प्रतिभा (acrylamide प्रतिशत, जेल के प्रकार, और चल रहे बफर के ईओण संरचना की सीमा).

इस वीडियो आलेख में वर्णित प्रक्रिया 4-12% बीआईएस Tris ढाल जैल और एमईएस बफर कैसे एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन करने के लिए Invitrogen NuPAGE वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग का एक उदाहरण के रूप में चल रहा है के साथ बीआईएस Tris असंतत बफर प्रणाली का इस्तेमाल करता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम विभिन्न जैव रासायनिक इस पश्चिमी सोख्ता पद्धति का उपयोग करके अनुप्रयोगों के लिए अच्छा है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त किया है.

Protocol

जेल वैद्युतकणसंचलन

तकनीकी नोट: प्रक्रिया शुरू करने से पहले, अपने प्रोटीन के नमूने तैयार है .

इस दिशा में पहला कदम के दौरान, नमूना में प्रोटीन उनके आणविक denaturing polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) का उपयोग कर वजन के अनुसार अलग कर रहे हैं. NuPAGE ® LDS नमूना बफर लिथियम Dodecyl सल्फेट (LDS) के साथ भरी हुई एक विकृत राज्य में polypeptides कहना है एक बार प्रोटीन नमूना 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया है. माध्यमिक और तृतीयक संरचना (डीटीटी डाइसल्फ़ाइड बंधन तोड़) को हटाने के एक मजबूत कम करने एजेंट संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, प्रोटीन नमूना नकारात्मक आरोप लगाया LDS में शामिल हो जाते हैं और इसलिए सकारात्मक आरोप लगाया इलेक्ट्रोड की ओर जेल के acrylamide जाल के माध्यम से कदम. यह आण्विक वजन (किलो Daltons, केडीए) मापा के अनुसार उनकी जुदाई देता.

नमूना तैयार करने और PAGE प्रक्रिया के लिए विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल Invitrogen 2 वेबसाइट पर पाया जा सकता है, या NuPAGE तकनीकी गाइड में 3.

तकनीकी सुझावों

  1. I) (अधिक से अधिक acrylamide कम की बेहतर संकल्प में जिसके परिणामस्वरूप एकाग्रता के साथ जेल के acrylamid एकाग्रता: Invitrogen NuPAGE बीआईएस Tris discontinous बफर सिस्टम में, प्रोटीन और जेल के बाद जुदाई रेंज के electrophoretic गतिशीलता दो कारकों पर निर्भर है आणविक भार प्रोटीन) और ii) चल रहा है बफर, MOPS या एमईएस के बढ़ते आयन. जुदाई रेंज है कि आप प्राप्त करना चाहते हैं के लिए उपयुक्त संयोजन का चयन करने के लिए, जेल प्रवासन एक चार्ट देखें. जेल और कुओं की संख्या की मोटाई मात्रा और नमूने है कि आप लोड करने के लिए, क्रमशः योजना की मात्रा पर निर्भर करेगा.
  2. जब आप जेल के कुओं में अपने नमूनों को लोड करते हैं, तो कम से कम एक लेन में एक आणविक वजन मार्कर (या सीढ़ी) के लिए आरक्षित है. ये प्रोटीन मानकों वाणिज्यिक कई कंपनियों से उपलब्ध हैं और आम तौर पर दाग परिभाषित आणविक भार वाले प्रोटीन का एक मिश्रण से मिलकर बनता है, तो के रूप में दिखाई बैंड है कि आप प्रवास प्रगति का पालन करने की अनुमति के रूप में करने के लिए. आणविक भार है कि अपने जेल के संकल्प के साथ संगत है एक सीमा उठाओ.
  3. एक अच्छा और भी प्रवास पैटर्न को प्राप्त करने के लिए हम नमूना या 1X LDS नमूना बफर का एक समान मात्रा के साथ अपने जेल के सभी कुओं लोड करने की सलाह देते हैं.

स्थानांतरण

तकनीकी नोट: हस्तांतरण कदम की शुरुआत से पहले, हस्तांतरण (1X के साथ 10% मेथनॉल) बफर और 4 करने के लिए पूर्व शांत डिग्री सेल्सियस एक ठंडे कमरे में तैयार है.

आदेश में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सुलभ प्रोटीन बनाने के लिए, वे एक nitrocellulose झिल्ली पर जेल से electroblotting द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं. प्रोटीन बंधन hydrophobic बातचीत, झिल्ली और प्रोटीन के बीच के रूप में अच्छी तरह से चार्ज बातचीत पर आधारित है.

(Polyvinylidene फ्लोराइड झिल्ली (PVDF) भी एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस मामले में, PVDF झिल्ली मेथनॉल में पूर्व गीला उपयोग करने से पहले कम से कम 30 सेकंड की जरूरत है.)

हस्तांतरण की प्रक्रिया का एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल 4 संदर्भ में पाया जा सकता है अगर आप जैव रेड मिनी ट्रांस ब्लाट electrophoretic स्थानांतरण सेल, या 2-3 संदर्भ का उपयोग करें यदि आपके प्रयोगशाला Invitrogen XCell द्वितीय के साथ सुसज्जित है ™ मॉड्यूल ब्लाट.

इस प्रक्रिया का एक परिणाम के के रूप में, प्रोटीन एक पतली सतह परत पर उजागर कर रहे हैं और पता लगाने के लिए तैयार है. जेल से प्रोटीन की झिल्ली को हस्तांतरण की एकरूपता और समग्र प्रभाव पलटवाँ एस काकरेज़ी रंग डाई झिल्ली धुंधला द्वारा जाँच की जा सकती है.

काकरेज़ी रंग एस धुंधला प्रक्रिया (वैकल्पिक):

  1. प्रोटीन स्थानांतरित करने के बाद, एक ऊष्मायन ट्रे में झिल्ली जगह (प्रोटीन सामना करना पड़ रहा).
  2. पर्याप्त झिल्ली को कवर और कोमल आंदोलन के साथ कम से कम 30 सेकंड सेते एस काकरेज़ी रंग धुंधला जोड़ें.
  3. आसुत जल के साथ झिल्ली कुल्ला जब तक पृष्ठभूमि स्पष्ट है.
  4. 2-3 मिनट के लिए आसुत जल चल के साथ झिल्ली Destain.
  5. अवरुद्ध समाधान में झिल्ली (नीचे देखें) रखें.

तकनीकी सुझाव:

  1. हम अपने झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण से पहले एक पेंसिल के साथ लेबलिंग क्रम में पक्ष जो प्रोटीन में अवगत कराया गया और अपने नमूने के उन्मुखीकरण को निरूपित करने की सलाह देते हैं.
  2. दोनों एस काकरेज़ी रंग धुंधला हो जाना और वजन आणविक मार्करों के लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ जिसके परिणामस्वरूप भागों की जांच करने के लिए स्थानांतरण के बाद झिल्ली में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

Immunodetection:

तकनीकी नोट: यह immunodetection प्रक्रिया केवल एक दिशानिर्देश के रूप में प्रदान की जाती है. अनुकूलन प्रत्येक चींटी के लिए आवश्यक हो सकता हैibody, विशिष्ट जानकारी के सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के डेटा पत्रक (उदाहरण के लिए, कमजोर पड़ने, ऊष्मायन समय, आदि के काम) में पाया जा सकता है है.

इस अंतिम प्रक्रिया के दौरान, लक्ष्य प्रोटीन एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जाएगा और फिल्म पर एक बैंड के रूप में दिखाई देगा. लक्ष्य प्रोटीन की आणविक भार के बैंड की स्थिति निर्भर है, जबकि बैंड तीव्रता लक्ष्य प्रोटीन वर्तमान की मात्रा पर निर्भर करता है.

आमतौर पर, इस तीन substeps के बाद हासिल की है:

  1. अवरुद्ध: झिल्ली (झिल्ली पर अतिरिक्त अंतरिक्ष एक सामान्य प्रोटीन का एक कमजोर समाधान के साथ कवर किया जाता है) के साथ एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बातचीत से बचने के.
  2. जांच: ब्याज की प्रोटीन से पता चला है एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी . बाद अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी दूर धोया जाता है, झिल्ली एक अलग रिपोर्टर को जुड़े एंटीबॉडी के संपर्क में है एंजाइम हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी). यह माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रजातियों विशिष्ट भाग (जैसे एक विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी किसी भी खरगोश sourced प्राथमिक एंटीबॉडी करने के लिए बाध्य होगा) के खिलाफ निर्देशित है .
  3. जांच: एक chemiluminescent एजेंट luminesce होगा कि जब माध्यमिक एंटीबॉडी पर एचआरपी उजागर करने के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह प्रतिक्रिया जगह में और जांच प्रोटीन की मात्रा के अनुपात में luminescence पैदा करता है. प्रकाश तो फोटो फिल्म से पता चला है.

एक सामान्य प्रक्रिया कदम दर कदम नीचे प्रदान की जाती है. अन्य विस्तृत प्रक्रियाओं ईसीएल प्लस पश्चिमी सोख्ता जांच अभिकर्मकों अनुदेश मैनुअल 5 या डेटा पत्रक सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के साथ में पाया जा सकता है है . ऊष्मायन समय, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने, और अवरुद्ध और धोने के समाधान empirically प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना है.

Immunodetection प्रक्रिया:

  1. पीबीएस 1% कैसिइन अवरुद्ध समाधान के पूरे झिल्ली को कवर के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक. एक झूली कुरसी पर कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए रखें या 4 में रातोंरात डिग्री सेल्सियस
  2. अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी (हित के प्रोटीन के लिए विशिष्ट) के साथ झिल्ली सेते हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में पतला होना चाहिए. सबसे एंटीबॉडी के लिए, पूरा बंधन कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के ऊष्मायन के बाद हासिल की है. वैकल्पिक रूप से, ऊष्मायन कदम 4 में रात भर प्रदर्शन डिग्री सेल्सियस के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत वृद्धि कर सकते हैं.
  3. समाधान (त्यागने या सी -20 ° ° दोहराया उपयोग के लिए सी 4 बजे रखने) निकालें और जल्दी से एक बार झिल्ली धोने. फिर पीबीएस के साथ 3X10 मिनट, 0.05% के बीच 20 (PBST) जोरदार झटकों के साथ कमरे के तापमान पर.
  4. एचआरपी युग्मित माध्यमिक अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं. एक एंटीबॉडी जो प्रजातियों जहां प्राथमिक एंटीबॉडी उठाया गया था के आईजीजी भाग पहचानता चुनें. ऊष्मायन कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए किया जाता है.
  5. समाधान त्यागें और जल्दी से एक बार झिल्ली धोने. फिर जोरदार झटकों के साथ कमरे के तापमान पर PBST साथ 3X10 मिनट.
  6. निर्माता अनुदेश के अनुसार chemiluminescent पता लगाने के लिए आगे बढ़ें. हम ईसीएल प्लस पश्चिमी सोख्ता जीई हेल्थकेयर (विशेष निर्देश के लिये 5 संदर्भ देखें) से जांच अभिकर्मकों का उपयोग करें.
  7. सरन लपेट में अपने झिल्ली या पाउच और एक autoradiography कैसेट के अंदर जगह रखें. किसी भी अतिरिक्त तरल निकास और सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें.
  8. एक अंधेरे कमरे में झिल्ली फ़ोटो फिल्म बेनकाब. 1 मिनट जोखिम समय के साथ प्रारंभ करें और वांछित संकेत तीव्रता के अनुसार समायोजित.

तकनीकी सुझाव:

  1. गैर विशिष्ट बंधनकारी के अवरुद्ध प्रोटीन का एक पतला समाधान में झिल्ली रखकर हासिल की है. हम आम तौर पर 1% है, लेकिन कैसिइन उपयोग गोजातीय सीरम albumin (~ 2% BSA) या गैर वसा शुष्क दूध (~ 5%) एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है .
  2. Tris-buffered खारा (टीबीएस) प्रक्रिया के बजाय भर में पीबीएस की इस्तेमाल किया जा सकता है. हम टीबीएस का उपयोग करने की सलाह देते हैं अगर आप phosphospecific एंटीबॉडी के साथ अपनी झिल्ली की जांच की योजना है.
  3. का उपयोग एक चमक में अंधेरे (जैसे, Stratagene Glogos ® द्वितीय Autorad मार्करों) स्टीकर autoradiography कैसेट के तल में टेप आप विश्लेषण चरण के दौरान अपनी फिल्म और अपने झिल्ली संरेखित करने में मदद करेगा.

विश्लेषण

अब कि आप अपने फिल्म उजागर किया है, तो आपको एहसास होगा कि व्यावहारिक दृष्टि से, नहीं Westerns सभी एक अच्छा एकल बैंड के रूप में प्रोटीन का पता चलता है. Additionaएल बैंड भी गैर विशिष्ट दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन की वजह से प्रकट हो सकता है. इस पृष्ठभूमि संकेत immunodetection प्रक्रिया के अनुकूलन के द्वारा कम किया जा सकता है. इसके अलावा, एक उचित नियंत्रण (जैसे, untransfected कोशिकाओं, siRNA इलाज किया कोशिकाओं, आदि) उपयोगी हो करने के लिए अपने एंटीबॉडी की विशिष्टता और झिल्ली पर प्रोटीन लक्ष्य की सटीक स्थान निर्धारित करेगा.

फिल्म पर झिल्ली से सना हुआ प्रोटीन मानक बैंड की स्थिति अंकन करने के बाद, प्रत्येक आणविक वजन के लॉग साजिश उनके इसी सापेक्ष गतिशीलता (x-अक्ष) के खिलाफ प्रोटीन मानकों (y-अक्ष) . सापेक्ष गतिशीलता (आरएफ) के प्रोटीन के अपने मूल बिंदु (जेल के ऊपर) की दूरी पर नज़र रखने डाई या एक कम आणविक भार मार्कर के सापेक्ष से ले जाया गया है दूरी के अनुपात के लिए शब्द का इस्तेमाल किया है गई (जेल सामने) . मानक वक्र के ढाल और y-अंत: खंड के लिए मान प्राप्त करने के प्रतिगमन लाइन का निर्धारण करते हैं. अपने लक्ष्य प्रोटीन की अज्ञात आणविक वजन (आकार) अपने आरएफ और निम्नलिखित संशोधित समीकरण का उपयोग कर का अनुमान है:

लॉग इन आणविक वजन = (ढलान) (गतिशीलता या लक्ष्य प्रोटीन के आरएफ) + y-अंत: खंड

(6 संदर्भ के लिए विस्तृत निर्देश).

अभिव्यक्ति स्तर approximations एक संरचनात्मक प्रोटीन (जैसे, ट्यूबिलिन, या actin) या GAPDH जैसे एक गृह व्यवस्था जीन उत्पाद की है कि लक्ष्य प्रोटीन का बैंड तीव्रता की तुलना द्वारा लिया जाता है. इस तथाकथित "नियंत्रण लोड हो रहा है" के नमूनों के बीच बदल नहीं है और एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर पता चला चाहिए. छवि आगे प्रोटीन धुंधला के रिश्तेदार राशि का मूल्यांकन और ऑप्टिकल घनत्व के मामले में परिणाम यों densitometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया एमईएस PAGE denaturing Invitrogen NuPAGE Novex वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग कर के एक उदाहरण के रूप में बफर चलाने के साथ एक बीआईएस Tris जेल का उपयोग करता है. इसके अलावा, इस पूर्व डाली जेल प्रणाली के तहत प्रोटीन जुदाई denaturing या गैर denaturing शर्तों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की अनुमति देता है आणविक वजन की एक विस्तृत रेंज (1-200 बीआईएस - Tris जैल के लिए केडीए के लिए 36-400 केडीए से accommodates Tris - एसीटेट) जैल. अपने प्रयोग के आधार पर, आप करने के लिए पश्चिमी सोख्ता यहाँ वर्णित तकनीक का ही हिस्सा पालन करें और सीधे जेल धुंधला (उदाहरण के लिए, चांदी या Coomassie धुंधला) प्रक्रियाओं या एक वैकल्पिक immunodetection विधि (उदाहरण के लिए, वर्णमिति या फ्लोरोसेंट) का उपयोग करें चुन सकते हैं.

हम नियमित रूप से विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए हमारी प्रयोगशाला में Invitrogen NuPAGE Novex वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करें, जिनमें से कुछ उदाहरण 7-9 संदर्भ में पाया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

यह काम स्वास्थ्य और जॉर्ज ई. हेविट फाउंडेशन फैलोशिप (एपी) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

References

  1. Gel Migration chart: . http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf Forthcoming.
  2. Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E Forthcoming.
  3. NuPAGE technical guide. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf Forthcoming.
  4. Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf Forthcoming.
  5. ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf Forthcoming.
  6. Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure Forthcoming.
  7. Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
  8. Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
  9. Penna,, et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. Forthcoming.

Comments

6 Comments

  1. Better provide the protocol in written format as well.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2008 - 1:54 AM
  2. Could you provide the written protocol? Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 1:25 PM
  3. Thanks! really useful video

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 30, 2008 - 5:13 PM
  4. very helpful and useful video

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 7:25 AM
  5. this is however not the nupage system from invitrogen...

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 16, 2011 - 5:34 PM
  6. Interesting - why do you not use TMT from Thermo Fisher?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2011 - 12:58 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics