प्लास्मिड के Microinjection द्वारा Polarized उपकला कोशिकाओं में छोटे GTPases के फंक्शन का विश्लेषण

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Biology

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Summary

इस अनुच्छेद के विवरण और polarized microinjection तकनीक का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं में छोटे GTPases की overexpression विश्लेषण में शामिल प्रक्रियाओं.

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Cook, R. N., Ang, S. F., Kang, R. S., Fölsch, H. Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (51), e2645, doi:10.3791/2645 (2011).

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Abstract

Protocol

1. प्लाज्मिड डीएनए के अलगाव

  1. एक सिग्मा Aldrich endotoxin मुक्त maxiprep किट का प्रयोग निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार endotoxin मुक्त डीएनए तैयार है. इस किट हमारे लिए काम करता है, क्योंकि यह मज़बूती से डीएनए की तैयारी से किसी भी endotoxins को हटा. Endotoxins है कि डीएनए के साथ सेल नाभिक में इंजेक्ट कर रहे हैं की कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व करेंगे.
  2. पृथक डीएनए, भंवर और एक Eppendorf microcentrifuge में 13,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए 100 μl phenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) जोड़ें. एक नया ट्यूब में ऊपरी जल चरण स्थानांतरण और 100 क्लोरोफॉर्म μl / isoamylalcohol (24:1), भंवर और ऊपर के रूप में स्पिन जोड़ें. ऊपरी चरण एक नया ट्यूब करने के लिए डीएनए युक्त पानी स्थानांतरण. इस कदम के लिए डीएनए, जो microinjection सुई के clogging रोकता से किसी भी प्रोटीन निकालने की जरूरत है.
  3. 300 मिमी और 2 एक्स खंड 100% इथेनॉल के अंतिम एकाग्रता ना एसीटेट (6.0 पीएच) जोड़कर डीएनए वेग. -20 ° रातोंरात सी सेते हैं. Eppendorf microcentrifuge में 13,000 rpm पर 20 मिनट के लिए डीएनए स्पिन, 70% इथेनॉल के साथ एक बार धोने, और 300 μl endotoxin मुफ्त पानी (सिग्मा Aldrich) में resuspend.
  4. डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. एक ठेठ डीएनए एकाग्रता 1 से 5 / μg μl पर्वतमाला.

2. MDCK कक्ष की संस्कृति

  1. MDCK कोशिकाओं भाजित. कोशिकाओं और 4 बीज की गणना 10 एक्स स्पष्ट 12 मिमी Transwell फिल्टर (0.4 सुक्ष्ममापी ताकना आकार, Corning costar, +३४६०) पर 5 कोशिकाओं . एक इंजेक्शन नकली नियंत्रण और दो अलग उत्परिवर्ती रब प्रोटीन आप तीन फिल्टर बीज करने की जरूरत है युक्त प्रयोग के लिए.
  2. संस्कृति सदस्य मध्यम में 2 मिमी एल glutamine, 0.1 पेनिसिलिन मिलीग्राम / एमएल / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 37 में 7% (/ खंड खंड) भ्रूण गोजातीय सीरम (= सदस्य विकास मीडिया) डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के साथ MDCK कोशिकाओं
  3. Basolateral कक्ष में हर दिन मीडिया को बदलें. यह ध्रुवीकरण की प्रक्रिया एड्स, क्योंकि यह पशुओं में उपकला कोशिकाओं की स्थिति mimics.
  4. 2 दिन एक खुर्दबीन में चेक पोस्ट बोने कि कोशिकाओं को एक बंद monolayer में बढ़ रहे हैं. यदि आप किसी भी छेद monolayer में पता नहीं लगा सकता, 3 दिन पर अपने प्रयोग करते हैं. अगर वहाँ अभी भी छेद कर रहे हैं, 4 दिन पर अपने प्रयोग करते हैं.

3. Microinjection प्रक्रिया और इंजेक्शन के बाद Incubations

  1. प्रयोग के दिन एक ° 39 सी इनक्यूबेटर में 5 मिलीलीटर सदस्य विकास मीडिया प्लस प्रत्येक फिल्टर और जगह के लिए एक 60 x 15 मिमी प्लेट में 50 मिमी HEPES तैयार करते हैं. इसके अलावा, की स्थापना 1 मिलीलीटर सदस्य विकास मीडिया प्लस 50 मिमी HEPES और 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर cycloheximide प्रति फिल्टर, और एक 31 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह के साथ एक 12-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक है.
  2. अपने microinjection खुर्दबीन पर मुड़ें और 39 के लिए अपने गर्म मंच तैयार ° सी. हम एक गर्म मंच के साथ एक औंधा सूक्ष्मदर्शी (200 Axiovert, कार्ल Zeiss MicroImaging इंक), 10X और 32x उद्देश्यों, और एक Eppendorf Femtojet (NI2 Injectman) का उपयोग करें. अन्त में, नाइट्रोजन गैस टैंक है कि नाइट्रोजन के साथ हवा तालिका की आपूर्ति खुला.
  3. डीएनए 100 μl - 0.2 मिलीग्राम / 10 के कुल मात्रा में मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए फ़िल्टर्ड पानी (0.2 फिल्टर सुक्ष्ममापी का उपयोग करें) के साथ पतला. बाद में, Eppendorf microcentrifuge में 30 मिनट के लिए 13,000 rpm पर डीएनए स्पिन. ऊपर और एक नया ट्यूब में भाग जगह निकालें. यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि जब आप microinjection सुई में अपने पतला डीएनए लोड आप सही "साफ" डीएनए लोड कर सकते हैं. आपका डीएनए अब microinjection के लिए तैयार है.
  4. अपनी संस्कृति पकवान की पहली फिल्टर बाहर लेने के द्वारा अपने कोशिकाओं को तैयार है. के साथ एक शल्य चिकित्सा (पंख सर्जिकल ब्लेड, स्टेनलेस स्टील, 11 नहीं) ब्लेड, 5 मिलीग्राम, 39 ° सी गर्म सदस्य विकास मीडिया से अधिक 50 मिमी HEPES (60 x 15 मिमी प्लेट) में फिल्टर फ़िल्टर धारक और जगह से काट. सर्जिकल ब्लेड आप इसे काटने के लिए इस्तेमाल किया के साथ संस्कृति की थाली में फिल्टर नीचे वजन. यह फिल्टर जैसे कि सर्जिकल ब्लेड के छेद फिल्टर के बीच चारों ओर रखें. माइक्रोस्कोप के गर्म मंच पर अपनी संस्कृति की थाली प्लेस.
  5. Microinjection सुई (Femtotip द्वितीय, Eppendorf, 930,000,043) में अपने पतला डीएनए (इस मामले plasmids एन्कोडिंग VSVGts045 GFP में = नकली इंजेक्शन नियंत्रण) के 2-3 μl लोड करने के लिए, सुई की सुरक्षा कवर मोड़ और इसे फर्श पर गिर . अब सुई अपने धारक में खराब कर दिया है बनने के लिए तैयार है. ऐसा करने के लिए, अपने injectman मेनू कुंजी दबाएँ और यह सुनिश्चित करें कि वाल्व नीचे बंद है. अपने धारक में सुई भाड़ में, सुई में भी नहीं कस पेंच के रूप में है कि टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सावधान रहना. अब, मेनू कुंजी फिर से दबाएँ, लागू पी ग microinjeciton प्रक्रिया के दौरान सुई में चूसा जा रहा से मीडिया को रोकने जाएगा. अंत में, अपने घर वापस आना संग्रहीत मिटा जोस्टिक नल.
  6. कोशिकाओं पर सुई कम करने के लिए, 10X उद्देश्य का उपयोग करें और तरल ऊपर प्रकाश किरण में सुई लाने. अब ध्यान केंद्रित कोशिकाओं पर ध्यान फिर से ध्यान केंद्रित पहिया बदल 180 ° ऊपर लाने, और सुई खोजने की. बाद में, धीरे ध्यान में सुई ले जाते हैं, फिर ध्यान से बाहर फिर से लाने के (ध्यान में कोशिकाओं को फिर से लाने की दिशा में काम कर रहे), नीचे के लिए में सुई लानेएक बार फिर ग्राहकों. दोहराएँ जब तक सुई छू मीडिया की सतह, पर जो बात आप देखेंगे एक प्रभामंडल है. जब आप एक बिंदु तक पहुँचने पर जो कोशिकाओं को ध्यान में हैं, लेकिन अभी भी सुई है फजी (फोकल हवाई जहाज़ के बाहर यानी) 32x उद्देश्य और ठीक मोटे सेटिंग्स को बदलने.
  7. सुई की नोक के साथ शिखर छू झिल्ली और नाभिक के रूप में 10 सुक्ष्ममापी के बारे में घटाकर शिखर झिल्ली के नीचे लगभग 10 सुक्ष्ममापी बिछाने z सीमा निर्धारित करें.
  8. आप z सीमा निर्धारित करने के बाद, सही इंजेक्शन दबाव लगता है. 95 साई को प्रारंभ करें. यदि दबाव बहुत अधिक है, अपनी कोशिकाओं को उड़ा देंगे. यदि आपका दबाव बहुत कम है, तो आप एक सफेद डॉट है कि रहता देखते हैं, लेकिन कुछ नहीं होता. एक सफल इंजेक्शन के साथ, आप एक कोशिका का आकार बदलने के बिना एक चरण को बदलने देखेंगे. इंजेक्शन के लिए सुई microns के एक जोड़े लाने के फोकल हवाई जहाज़ के बाहर जितनी जल्दी हो सके. नाभिक ऊपर सुई (यानी एक व्यक्ति सेल के बीच) और अपने जोस्टिक के इंजेक्शन बटन प्रेस के साथ लक्ष्य है, लेकिन नीचे पकड़ नहीं बटन.
  9. अपने सर्जिकल ब्लेड है कि अपनी कोशिकाओं पर झूठ के छेद के भीतर 100-500 कोशिकाओं इंजेक्षन. जब आप कर रहे हैं, संस्कृति डिश और एक 39 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सर्जिकल ब्लेड, और सेते के साथ 2 एच. के लिए अपने कोशिकाओं को जगह इस समय के दौरान, VSVGts045 GFP व्यक्त की और ईआर में secreted. हालांकि, 39 डिग्री सेल्सियस, VSVGts045 GFP सही ढंग से नहीं गुना और इस प्रकार ईआर नहीं छोड़ सकते हैं कर सकते हैं. इस बीच, ब्याज के छोटे GTPase cytosol में सह इंजेक्शन प्रयोगों में जमा करेंगे.
  10. 2 घंटे बाद, 12 अच्छी तरह से एक थाली और सेते में 1 मिलीलीटर सदस्य विकास मीडिया प्लस में 50 मिमी HEPES और 0.1 मिलीग्राम / एमएल cycloheximide में अपने कोशिकाओं को 31 डिग्री सेल्सियस पर जगह 2 घंटे के लिए इस पीछा अवधि के दौरान, VSVGts045 - GFP सही ढंग से गुना, ईआर छोड़ और कोशिका की सतह के लिए दिया है.
  11. दो फिल्टर (plasmids VSVGts045 GFP एन्कोडिंग इंजेक्षन और उदाहरण के लिए Rab13T22N V5 टैग) और तीन के लिए 3.10 (plasmids VSVGts045 GFP एन्कोडिंग इंजेक्षन और उदाहरण के लिए Rab13Q67L V5 टैग) - 3.1 चरणों को दोहराएँ. प्रत्येक इंजेक्शन के बारे में 20 ले जाएगा - 60 मिनट. हालांकि, यह बिल्कुल तापमान बदलाव incubations और सतह धुंधला भर में हर फिल्टर उसी तरह का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है जब तक आप कोशिकाओं को ठीक. निर्धारण के बाद, आप अपने धुंधला प्रोटोकॉल के बाकी एक ही समय में सभी फिल्टर के लिए प्रदर्शन कर सकते हैं.

4. Immunofluorescence विश्लेषण के लिए भूतल धुंधला

नोट, VSVGts045 - GFP के GFP संकेत के क्रम में विरंजन से बचने के लिए, बाद के सभी प्रक्रियाओं के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा प्रकाश से नमूनों की रक्षा.

  1. यदि आप सतह धुंधला प्रदर्शन करना चाहते हैं, एक संस्कृति डिश में बर्फ पर एक धातु की थाली पर अपनी कोशिकाओं और जगह अपने कोशिकाओं के साथ बर्फ के ठंडे 2 पीबीएस (PBS [0.2 ग्राम / लीटर KCl, 0.2 ग्राम / लीटर 2 के.एच. + पीओ 4 1X धो , 8 ग्राम / लीटर NaCl, 2.17 और ना छ / लीटर 2 HPO 4 x 7 एच 2 हे] प्लस 0.1 ग्राम / लीटर CaCl 2 और 0.1 छ लीटर / MgCl 2 x 6 एच 2 हे). बाद में, जगह एक एंटीबॉडी है कि इस मामले में अपने प्रोटीन की ectodomain पहचानता है, के 30 μl माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी TK1 (1 आईजीजी, देर थॉमस क्रीस से प्राप्त), साफ बर्फ पर धातु की थाली पर रखा parafilm पर . उल्टा ड्रॉप पर नीचे अपने कोशिकाओं के साथ फिल्टर फिल्टर की पीठ पर प्लेस और एंटीबॉडी की कुछ बूँदें जोड़ने. बर्फ पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  2. 12 अच्छी तरह से एक थाली में प्लेस कोशिकाओं, बर्फ के ठंडे 2 पीबीएस के साथ 3X धो + (आर टी या गर्म 2 पीबीएस + पूर्व सतह धुंधला के बिना), और आरटी पर 15 मिनट के लिए 3% paraformaldehyde के साथ ठीक है.
  3. कोशिकाओं को एक बार और 2 + पीबीएस के साथ धो + 5 मिनट 2 पीबीएस में छोड़.
  4. / Permeabilization (BPB) बफर (2% [wt / वॉल] BSA, 0.4% [wt / वॉल] पीबीएस में 2 + सैपोनिन) 10% के साथ [/ खंड खंड] बकरी सीरम अवरुद्ध में कोशिकाओं को सेते हैं . 1 घंटे आरटी पर सेते हैं.
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी पतला व्यक्त रब GTPase (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आईजीजी 2a, Invitrogen) विरोधी V5, BPB में 1:200 इस उदाहरण में, पता लगाने के लिए. 13,000 rpm पर 10 मिनट के लिए एक Eppendorf microcentrifuge में पतला एंटीबॉडी स्पिन. जगह साफ parafilm पर एंटीबॉडी समाधान के 30 μl एक गीला कक्ष में रखा. फ़िल्टर पर कोशिकाओं एंटीबॉडी ड्रॉप पर नीचे उल्टा प्लेस और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  6. प्लेस वापस 12 अच्छी तरह से एक थाली और आरटी पर BPB के साथ 30 मिनट से अधिक 5X धोने में कोशिकाओं (दाईं ओर ऊपर).
  7. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी इस मामले बकरी विरोधी माउस आईजीजी 1 Alexa (सतह पर पता लगाने VSVG के लिए, Invitrogen) 594 लेबल, और Cy5 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी अपने रब GTPase पहचान करने के लिए इस उदाहरण बकरी में, विरोधी माउस आईजीजी 2a में, पतला (जैक्सन ImmunoResearch) Cy5 - लेबल, 1:200 BPB में और इसके बाद के संस्करण के रूप में स्पिन. प्लेस एक गीला कक्ष और फ़िल्टर उल्टा पर जगह कोशिकाओं एंटीबॉडी ड्रॉप पर नीचे में 30 साफ parafilm पर μl एंटीबॉडी समाधान. 1 घंटे आरटी पर सेते हैं.
  8. 4.6 कदम दोहराएँ.
  9. फ़िल्टर पर डुबकी कोशिकाओं विआयनीकृत जल और जगह r में 3Xmicroslides पर ight तरफ ऊपर. कोशिकाओं के शीर्ष पर 10-15 μl माउंट (10% [wt / वॉल] DABCO, 50% [wt / वॉल] आसुत जल में ग्लिसरॉल) जोड़ें. प्लेस 18X18 मिमी ऊपर और चेहरे के ऊतकों का उपयोग करने पर सूक्ष्म कवर गिलास धीरे कोशिकाओं पर सूक्ष्म कवर कांच दबाएँ. नेल पॉलिश के साथ सील.
  10. एक confocal खुर्दबीन के साथ नमूनों का विश्लेषण. हम एक माइक्रोसिस्टम LSM 510, कार्ल Zeiss MicroImaging इंक, कि एक 63X पानी विसर्जन लेंस के साथ सुसज्जित किया गया था इस्तेमाल किया.
  11. आंकड़ों की तैयारी के लिए समायोजित करने के लिए, और Adobe Photoshop और Adobe Illustrator के रूप में इस तरह के कार्यक्रमों का उपयोग चित्र संयोजन.

5. प्रतिनिधि परिणाम

कैसे छोटे GTPases सह अभिव्यक्ति छँटाई VSVG के साथ हस्तक्षेप पर उदाहरण के लिए कृपया या तो शिखर missorting 3, 4 या सतह 7 प्रसव के निषेध के लिए प्रकाशित लेख के लिए देखें.

चित्रा 1
चित्रा 1. इंजेक्शन नकली में, यानी केवल प्लाज्मिड VSVGts045 - GFP एन्कोडिंग का एक इंजेक्शन, प्रोटीन अच्छी तरह से polarized MDCK कोशिकाओं की basolateral सतह पर वितरित किया जाता है के रूप में सतह धुंधला हो जाना (लाल, चित्रा 1 एक में) के द्वारा न्याय. ध्यान दें कि VSVGts045 - GFP के सभी पीछा नहीं के दौरान 31 पर basolateral झिल्ली को दिया है ° सी के रूप में कुल प्रोटीन के लिए व्यापक intracellular संकेत द्वारा evidenced (हरे रंग में, 1 ए और बी आंकड़े). कोशिकाओं में है कि अच्छी तरह से polarized नहीं कर रहे हैं VSVGts045 GFP शिखर झिल्ली (1 चित्रा बी) के लिए भी दिया जाएगा. यदि आपका नियंत्रण नमूनों चित्रा 1 बी में सेल की तरह देखो, तो आप अपने डेटा पर भरोसा नहीं है और बेहतर-polarized कोशिकाओं के साथ प्रयोग दोहराने की है. स्केल सलाखों 5 सुक्ष्ममापी हैं.

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Discussion

एक सफल microinjection प्रयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है और डीएनए की गुणवत्ता और शुद्धता और अपनी कोशिकाओं के polarity हैं. Polarized कोशिकाओं के बिना, अपने इंजेक्शन नियंत्रण पहले से ही VSVG mistargeted होगा और प्रयोग किया नहीं किया जा सकता है. यदि डीएनए गरीब गुणवत्ता की है, डीएनए इंजेक्शन गरीबों को अग्रणी वांछित प्रोटीन की सुई या सभी में कोई अभिव्यक्ति रोकना हो सकता है. इसके अलावा, यह अभिव्यक्ति plasmids कि pRKV जैसे उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के लिए नेतृत्व करने के लिए जाना जाता है का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है.

यदि आप अन्य कार्गो प्रोटीन की छँटाई करने के लिए परीक्षण की इच्छा, तापमान बदलाव प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, कम घनत्व लेपोप्रोटीन रिसेप्टर्स व्यक्त, हम 37 पर microinjection प्रदर्शन ° 37 में एक 1 घंटे ऊष्मायन द्वारा पीछा सी डिग्री सेल्सियस, 4 घंटे 20 डिग्री सेल्सियस (TGN में माल की गिरफ्तारी के लिए) और 37 पर 2 घंटे ° सी 0.1 cycloheximide मिलीग्राम / एमएल की उपस्थिति में सतह के लिए प्रोटीन का पीछा करने के लिए. एफसी रिसेप्टर्स के रूप में कुछ प्रोटीन के लिए, पर 20 ऊष्मायन समय ° सी कितनी तेजी से अपने माल प्रोटीन संश्लेषित है पर दो निर्भर घंटे के लिए उतारा जा सकता है और स्रावी मार्ग के माध्यम से यात्रा. Incubations के एक विस्तृत वर्णन है कि हम अलग कार्गो प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया Nokes एट अल. देखते हैं, 7 2008.

अंत में, इस प्रोटोकॉल न केवल छोटे GTPases के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सभी प्रोटीन या प्रोटीन टुकड़े कि आपको संदेह है के लिए सिद्धांत (polarized) सतह प्रसव में एक समारोह में हो सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम एच. Fölsch स्वास्थ्य (GM070736) के राष्ट्रीय संस्थानों से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एस एफ आंग एक एक * स्टार ग्रेजुएट छात्रवृत्ति पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, और आरएस कांग रोग प्रशिक्षण कार्यक्रम के सेलुलर और आणविक आधार (GM8061) द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage Carl Zeiss, Inc. Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator Eppendorf Custom order
Femtotips II (Microinjection needles) Eppendorf 930000043
Microloader tips Eppendorf 930001007
Clear 12-mm transwell filter supports Corning 3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit Sigma-Aldrich NA0400

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References

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