Procédure pour l'ingénierie du poumon

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Published 3/08/2011
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Bioengineering
 

Summary

Nous avons développé une matrice extracellulaire et des poumons décellularisé bioréacteur roman biomimétiques qui peuvent être utilisés pour générer des tissus pulmonaires fonctionnelles. Par ensemencement des cellules dans la matrice et la culture dans le bioréacteur, nous générons des tissus qui démontre les échanges gazeux efficaces lorsqu'elles sont transplantées in vivo pour de courtes périodes de temps.

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Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for Lung Engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651, doi:10.3791/2651 (2011).

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Abstract

Le tissu pulmonaire, y compris le cancer du poumon et les maladies pulmonaires chroniques telles que la bronchopneumopathie chronique obstructive, cumulativement représentent environ 280 000 décès par an; maladie pulmonaire obstructive chronique est actuellement la quatrième cause principale de décès aux États-Unis 1. Contribuer à cette mortalité est le fait que les poumons ne sont généralement pas au-delà de réparer ou de régénérer le microscopique, au niveau cellulaire. Par conséquent, le tissu pulmonaire qui est endommagé par une dégénérescence ou une infection, ou du tissu pulmonaire qui est une résection chirurgicale n'est pas fonctionnellement remplacé in vivo. Pour déterminer si les tissus pulmonaires peuvent être générés in vitro, nous avons traité les poumons de rats adultes en utilisant une procédure qui supprime les composants cellulaires pour produire une matrice extracellulaire pulmonaire acellulaire échafaud. Cet échafaudage conserve les structures hiérarchiques de branchement des voies respiratoires et le système vasculaire, ainsi que d'une membrane basale largement intact, ce qui comprend le collagène IV, laminine, fibronectine et. L'échafaud est monté dans un bioréacteur conçu pour imiter les aspects critiques de la physiologie des poumons, telles que la ventilation à pression négative et de perfusion vasculaire pulsatile. En cultivant l'épithélium pulmonaire et l'endothélium vasculaire au sein de l'échafaudage monté bioréacteur, nous sommes en mesure de générer des tissus pulmonaires qui est phénotypiquement comparables au tissu pulmonaire native et qui est capable de participer à un échange de gaz pour des intervalles de temps courts (de 45 à 120 minutes). Ces résultats sont encourageants et suggèrent que le repeuplement du poumon matrice est une stratégie viable pour la régénération du poumon. Cette possibilité constitue une occasion non seulement de travailler à augmenter l'offre de tissu pulmonaire pour une transplantation, mais aussi à l'étude des cellules des voies respiratoires et la biologie moléculaire in vitro pour des périodes plus longues et dans un microenvironnement plus précis que ce qui a été possible auparavant.

Protocol

1. Bioréacteur Assemblée

Figure détaillé (s) de la conception et l'assemblage de bioréacteur pour les deux décellularisation et la culture sont fournis dans les figures 1 et 2, respectivement. Tous les composants doivent être stérilisés avant l'assemblage du bioréacteur. Les points suivants sont notés:

CONNEXIONS:

  1. La canule artérielle est constitué d'un raccord luer-lock connecté à un Y-splitter par un court segment de tuyau. Le connecteur luer-lock est attaché à la tubulure de perfusion, et le segment de l'Y qui n'est pas suturé à l'artère pulmonaire est reliée à une valve unidirectionnelle. La valve unidirectionnelle est orientée de telle sorte que du liquide peut être prélevé dans les tubes (dans le sens inverse que la perfusion), mais pendant la perfusion des organes toutes les moyennes se jette dans le poumon.
  2. La canule trachéale compose également d'un connecteur luer-lock liée à un Y-splitter avec des tubes. Le luer-lock se connecte à une boucle de respiration entre le réservoir trachée et la chambre principale. Le segment de la Y-connecteur qui n'est pas suturé à la trachée est également relié à une valve unidirectionnelle. La valve unidirectionnelle est orientée de la même façon que la canule artérielle.

FONCTIONS:

  1. Les valves à sens unique dans les canules artérielles et la trachée sont utilisés pour dégager les bulles d'air dans le tube en permettant inversion de l'écoulement dans le tube et donc les bulles d'air permettant d'être enlevé.
  2. La "boucle respiratoire" comprend deux valves unidirectionnelles, positionné de telle sorte que le milieu suit un chemin différent dans et hors des poumons. Une description plus détaillée de cette fonctionnalité est fournie dans une publication préalable de nos 2 laboratoires.
  3. Perfusion vasculaire est assurée à l'aide d'une pompe à rouleaux. Medium est perfusé dans l'artère pulmonaire par la canule jointe, circule à travers les vaisseaux du poumon, et la veine pulmonaire directement dans le bioréacteur principal, où le média est établi pour perfusion.

2. Prélèvement d'organes

  1. Euthanasier les adultes (3-6 mois) des rats Fischer 344 par overdose de pentobarbital de sodium, conformément aux directives énoncées par l'American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP). Remarque: la solution de pentobarbital comprend l'héparine à 100 unités / ml pour l'anticoagulation.
  2. Pulvériser ou essuyez la poitrine et l'abdomen avec de l'éthanol à 70%.
  3. Ouvrez la cage thoracique, ce qui expose le cœur et les poumons, en prenant soin de ne pas endommager les poumons. Soigneusement faire une petite fenêtre à travers le diaphragme dans la cavité thoracique, les poumons causant de se rétracter, puis développez cette incision horizontale afin d'exposer les bases des poumons. Faire deux incisions verticalement à travers les côtes, et se rétractent de la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.
  4. Préparer un système de perfusion par gravité, c'est à dire en utilisant une seringue avec un piston enlevé, un robinet à 3 voies, et ~ 20cm de tube avec un 1.5inch, 21-gauge. Maintenir la seringue à ~ 20cm au-dessus de l'animal en utilisant un support universel. S'assurer que tout l'air est retiré de la tubulure de perfusion.
  5. Couper l'oreillette droite pour drainer le sang, l'empêchant de retourner dans les poumons. Découpage de l'oreillette gauche pour permettre un drainage facile de sang et de liquide de perfusion des poumons peut également être utile, mais n'est pas nécessaire.
  6. Insérez l'aiguille dans la base du ventricule droit et ouvrir le robinet pour perfuser les poumons avec une solution de nitroprussiate de sodium et de l'héparine (50U/ml et 1ug/ml, respectivement) dans le PBS. Confirmez que l'artère pulmonaire se remplit de liquide de perfusion, et que le sang est la compensation des poumons. Si nécessaire, remplir la seringue avec le liquide de perfusion supplémentaire. Généralement, seuls 10ml ~ est nécessaire.
  7. Continuez jusqu'à ce que la perfusion des poumons sont clairs de sang, puis arrêter la perfusion.
  8. Disséquer la libre trachée, dans le col le plus loin possible. Assurer la trachée est séparé de l'œsophage. Disséquer toutes les connexions restantes vers le cœur, les poumons et la trachée, et de supprimer en bloc.
  9. En utilisant une paire de ciseaux scalpel ou pointu, couper la pointe du cœur, exposant les ventricules droit et gauche.
  10. Cathétériser l'artère pulmonaire par le ventricule droit, et la suture en place. Retirez tout excès de tissu ventriculaire gauche.
  11. Cathétériser la trachée et de suture en place. Assurez-vous que les deux canules trachéales et artérielles pulmonaires sont positionnés de telle sorte que il n'ya pas de contrainte de torsion sur la trachée, des poumons, ou des gros vaisseaux (figure 1).
  12. S'assurer qu'il n'ya pas de bulles d'air dans la canule artérielle, car les bulles d'air piégées dans le système peut empêcher le flux constant de grâce de l'orgue. Dans certains cas, une bulle d'air peut complètement stopper flow.To fluide ce faire, placez le bloc cœur / poumon dans un bocal contenant du PBS. Utiliser une seringue avec une aiguille pour injecter une petite quantité de PBS dans la canule coeur d'expulser toutes les bulles.
  13. Lavage des voies respiratoires avec PBS 4-5 fois, pour enlever l'air autant que possible à partir du poumon.
  14. Après l'étape de lavages sont complets, gonfler les poumons avec du PBS contenant du sodium nitroprussiate (SNP) au 1ug/ml. Mettre un bouchon sur la canule trachéale, donc la solution reste dans les poumons. Autoriser le poumon à incuber pendant 30 minutes, comme la même solution passe par la vascularisation par l'artère pulmonaire, pour permettre à la vasodilatation.
  15. Connectez-coeur / poumons d'un plafond bioréacteur en utilisant les connexions luer-lock lié à la canule en forme de Y, décrit dans "Assemblée bioréacteur" ci-dessus. (Figure 1).

3. Décellularisation orgue

  1. Raccordez le capuchon (avec des poumons ci-jointe) à l'appareil de décellularisation (figure 1). La canule artérielle pulmonaire doit se connecter à la ligne de perfusion, et la canule trachéale doit flotter librement. S'assurer que tous les lignes sont nettes de l'air. Comme décrit ci-dessus, l'air dans les lignes peuvent être une source de décellularisation pauvres en empêchant l'écoulement du fluide decllularization. L'air emprisonné dans le système peut également persister dans le temps la culture, quand elle peut avoir un impact négatif sur la survie des cellules 3.
  2. Gonflez les poumons avec du PBS / SNP jusqu'au poumons sont pleins, mais pas sur-gonflé. Immédiatement plafonner la canule trachéale de telle sorte que le poumon reste gonflé.
  3. Pulmonaires perfuser avec du PBS / SNP pendant au moins 15 min à ~ 15 mmHg (20cm H 2 O de pression). Après 15min ou plus, retirez le bouchon de la canule trachéale pour permettre le poumon à se dégonfler.
  4. Poursuivre la perfusion avec du PBS / SNP pour 30min. Si nécessaire, remplir PBS / SNP pour assurer la pression de perfusion est maintenue à 10-15 mmHg.
  5. Commencez la perfusion avec une solution décellularisation (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25 mM EDTA dans du PBS 1X). Prenez soin de s'assurer que toutes les lignes sont nettes de l'air. Un système de vide peut être utile de fournir d'aspiration.

Perfuser avec une solution décellularisation jusqu'à 500ml de solution a perfusé par le poumon. Pression optimale est <15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Ce généralement, il faudra 2,5 heures. Les débits sont généralement très lents (0.2-0.5ml/minute) initialement, et d'augmenter rapidement au cours de la deuxième heure à environ 1ml/minute ou supérieure. Périodiquement, enlever le liquide décellularisation occasion à partir de bioréacteur, assurant suffisamment de liquide reste à l'appui du poumon et de la canule trachéale.

4. Orgue de rinçage et de stérilisation

  1. Transfert du poumon et bioréacteur pour une hotte de culture de tissus. Commencez le rinçage avec du PBS stérile en enlevant le pot de 500ml qui contenait le liquide décellularisation et le remplacer par un bocal stérile contenant jusqu'à 1L de PBS stérile. Utilisez aspiration pour assurer les lignes sont nettes de l'air.
  2. Perfuser PBS à travers les vaisseaux sanguins à 10-15 mmHg, de la même manière que pour décellularisation. Périodiquement, éliminer les déchets PBS de bioréacteur et remplacer et / ou la recharge du pot de PBS avec frais, PBS stérile. Il est conseillé d'utiliser une technique stérile.
  3. Continuer à rincer pendant au moins 2,5 L de PBS stérile ont perfusé les poumons.
  4. Transfert du poumon à un nouveau système de bioréacteur stérile contenant du PBS frais. S'assurer que les deux la boucle entière de perfusion et les lignes de voies entières sont remplies de liquide. Toutes les étapes suivantes seront l'utilisation d'une pompe pulsatile pour perfuser les poumons à 5mL/min.
  5. Stériliser l'échafaud, soit par perfusion pendant la nuit avec du PBS + 10% de FBS + 10% pen-strep solution ou pendant 3 heures avec de l'acide peracétique à 0,1% dans PBS. Ces derniers auront besoin de rinçage du poumon avec 3 changements de 250ml de PBS pendant plusieurs heures pour éliminer l'acide résiduel. Pour chaque rinçage, le poumon doit être aéré ainsi que perfusé pour s'assurer que toutes les parties du tissu sont rincés.
  6. Transfert du poumon à un incubateur à 37 ° C et perfuser avec du PBS qui a 10% de FBS et 10% de pénicilline / streptomycine pour ~ 1h ou jusqu'à ce que la température est équilibrée, en préparation pour le traitement de la benzonase.
  7. Traiter du poumon avec benzonase pour éliminer l'ADN reste:
    1. Chauffer le tampon benzonase (voir tableau des réactifs) à 37 ° C.
    2. Pour chaque poumon, remplir une seringue de 10 ml avec le tampon benzonase seulement et une seringue de 10 ml avec benzonase 90U/ml dans le tampon.
    3. Arrêtez la perfusion du poumon.
    4. Gonflez les voies respiratoires avec un tampon de benzonase.
    5. Autoriser les poumons à se dégonfler (pour ~ 1 minute). Ensuite, gonflez le poumon avec la solution benzonase. Au cours de l'inflation avec un tampon de benzonase & benzonase, essayez d'éviter d'injecter l'air dans les poumons.
    6. Autoriser le poumon de s'asseoir sans perfusion ou d'une ventilation à 37 ° C pendant 1 heure après gonflage avec benzonase.
  8. Reprendre la perfusion avec le FBS PBS + 10%, 10% de pénicilline / streptomycine qui est déjà dans le bioréacteur, et continuer toute la nuit. Le jour suivant, le poumon peut être stocké à 4 ° C (pour un maximum de 3 mois) ou préparées pour l'ensemencement des cellules.
  9. Pour préparer l'échafaud pour le repeuplement cellulaire, remplacer le PBS / FBS / solution benzonase avec ~ 250ml de milieu de culture. Perfuser pour au moins une heure avant que les cellules sont introduites, unee remplacer par un milieu de culture frais directement avant que les cellules d'ensemencement.

5. Recellularization

Le choix de la source de cellules pour le réensemencement organe est laissé à des chercheurs individuels. Beaucoup de sources de cellules peuvent être utilisées, y compris les populations disponibles dans le commerce, fraîchement isolées néonatale ou fœtale des cellules pulmonaires, les cellules souches embryonnaires, ou de sources de cellules disponibles dans le commerce. Protocoles d'isolement spécifiques pour ces populations de cellules peuvent être trouvés ailleurs 4,5,6. Ici, nous fournissons des instructions sur la façon de semences à la fois des populations de cellules endothéliales et épithéliales.

Ensemencement endothélial:

  1. Préparer une suspension de la population de cellules endothéliales désiré, dans un milieu de culture approprié. Suspension cellulaire Filtrer à travers une passoire pour enlever la cellule 40um amas cellulaires. Un ensemencement endothélial typiques dans notre laboratoire utiliserait environ 30 millions de rats pulmonaires cellules endothéliales microvasculaires de 60ml de milieu de culture.
  2. Répartir la suspension cellulaire dans un petit réservoir temporaire incorporée dans la boucle de la perfusion du bioréacteur (Figure 2). Assurez-vous que le tuyau de ce réservoir et la boucle entière perfusion est clair de bulles d'air.
  3. Faire infuser les cellules dans l'artère pulmonaire à l'aide d'une pompe 3ml/min rouleau.
  4. Après la perfusion de cellules, de continuer la perfusion avec support recyclé provenant du bioréacteur principale au taux désiré.
  5. Sur une base quotidienne, ce que le tube de perfusion est clair de bulles d'air.
  6. Moyen devrait être remplacé par du milieu frais régulièrement; cela se fait souvent tous les 3-4 jours.

Ensemencement épithélial:

  1. Préparer une suspension cellulaire de la population de cellules épithéliales désiré. Dans notre laboratoire, il s'agit typiquement d'approximativement 50-100 millions de cellules de rats néonatals pulmonaire. Filtre la population à travers la crépine de cellule 40um et suspendre dans 15ml de milieu de culture dans une seringue. Remplir le réservoir voies aériennes avec 80ml de milieu de culture.
  2. Placez le dans un bioréacteur 37 ° C incubateur de culture de tissu, et de connecter la pompe seringue pour la ventilation. S'assurer que tous les lignes de ventilation sont clairs de l'air.
    1. Ensemencer les cellules dans les poumons par l'injection de 15ml de suspension cellulaire comme un bolus unique dans la canule trachéale.
    2. Commencer immédiatement à une seule respiration lente en utilisant la pompe seringue. Ce souffle est administré par le retrait 60ml d'air provenant du bioréacteur principal 3ml/minute dure donc environ 20 minutes. S'assurer que le filtre à air sur le bioréacteur principaux sont plafonnés immédiatement après l'injection de la suspension cellulaire et avant le début de la respiration lente.
  3. Autoriser les poumons de s'asseoir statiquement pendant environ 18h, et ensuite commencer lente perfusion vasculaire (environ 0,5 ml / min).

6. Culture d'organe

Bien que les détails de la perfusion et de ventilation varie en fonction de la conception expérimentale, les points suivants sont notés:

  1. Pendant la culture endothéliales, la perfusion est généralement effectué à 1-3 ml / min en utilisant une pompe à rouleaux. Pendant la culture épithéliales, la ventilation est généralement fournie à un rythme continu d'une respiration par minute en utilisant une pompe seringue. Retrait de la 5-10ml d'air provenant du bioréacteur principal est généralement nécessaire pour effectuer la ventilation pulmonaire à un volume normal des marées. En raison de la nécessité de maintenir l'étanchéité du bioréacteur pendant la ventilation, la ventilation doit être mis en pause quotidienne et de l'air dans la chambre principale doit être échangée. Tout l'air dans le système est l'air ambiant, ce qui est d'environ 21% d'oxygène en pression partielle. Le retrait de 5 10ml d'air provenant du bioréacteur (qui induit une inspiration 5-10ml de liquide par le poumon) est basé sur la taille du poumon et combien lobes sont cultivés (lobes peut être fixée à des fins d'analyse, tandis que le lobes restants continuent dans la culture). Le montant de l'air évacué par la pompe seringue est choisie pour approcher le "volume courant" du poumon en culture.
  2. Milieu doit être changé environ tous les 3-4 jours pendant la culture.
  3. Lors de co-culture des deux épithélium et l'endothélium, des expériences dans notre laboratoire de semences généralement d'abord l'épithélium de 4-8 jours, période durant laquelle l'ingénierie tissulaire est ventilé. L'endothélium est ensuite ensemencé par perfusion, après laquelle le tissu est à la fois perfusé et ventilé.

7. Les résultats représentatifs:

Décellularisation

Lorsque le protocole est réalisé correctement, les poumons fraîchement extrait devrait tenir l'air sans fuite. Les gonfler avec de l'air tandis immergée dans un liquide peut vérifier cela - il ne devrait pas y avoir de bulles indiquant les fuites d'air. La décellularisation ultérieures devraient permettre ~ 500ml de liquide de couler à travers décellularisation les poumons au cours de 2,5 - 3 heures à 37 ° C, et PBS devrait finalement être en mesure de circuler à travers les poumons, à environ 10 ml / min (sous ~ 15 mm Hg de la pression hydrostatique) à la fin du rinçage. Après traitement à l'acide peracétique à 0,1% et benzonase, les poumons peuvent être conservés à 4 ° C pour un maximum de 3 mois, et encore adapté à recellularization.

La matrice extracellulaire décellularisé finale devrait être complètement dépourvu de matériaux cellulaires, et de conserver les caractéristiques brutes, microscopique et ultrastructurale du poumon natif. Décellularisation insuffisant ou de rinçage peut entraîner des restes d'ADN "coller" à l'échafaud, qui peuvent être visualisées avec une hématoxyline standard et éosine (voir la figure 3 pour la comparaison).

Repeuplement de la matrice acellulaire et la culture des tissus pulmonaires

Si les cellules sont fraîchement isolés de 7 jours anciens ratons nouveau-nés, comme décrit dans le supplément en ligne qui accompagnent le travail de Petersen et ses collègues 4, on peut s'attendre à un rendement cellulaire des cellules 120-150 millions par portée de 10 chiots (juste plus de 10 millions cellules par nouveau-né).

Les conditions optimales pour l'ensemencement des cellules et la culture subséquente du poumon dans le bioréacteur devrait donner bien réparties dans toutes les cellules 5 lobes du poumon, et devrait fournir une couverture d'environ 70% de la matrice extracellulaire échafaudage (figure 3). La population de cellules en culture sera positif pour les principaux marqueurs de cellules respiratoires telles que la pro-sécrétoire protéine C (CPS), la protéine sécrétoire de cellules de Clara (CCSP), et l'aquaporine-5 (PAQ), par ordre d'abondance relative (figure 4).

Figure 1
Figure 1. Postes canules et bioréacteur décellularisation

Figure 2
Figure 2. Bioréacteur utilisé pour l'ensemencement et la culture de tissu pulmonaire conçu

Figure 3
Figure 3. Histologie des indigènes, décellularisé, et repeuplée pulmonaires

Figure 4
Figure 4. Immunofluorescence de marqueurs pulmonaires clés

Discussion

Les aspects les plus critiques du système présentés ici incluent maintien de la stérilité, et une surveillance étroite de pressions appliquées sur le lit vasculaire à travers le processus de préparation et l'ensemencement de l'échafaud et la culture des poumons repeuplé. La stérilité est mieux maintenu par autoclavage tous les matériaux avant leur utilisation, ainsi que par le montage du poumon dans un système fermé, peu après explant et évitant violation ultérieure de cette barrière. Une fois la matrice décellularisé a été soigneusement rincés et transférés dans un bioréacteur stérile pour la culture, le bouchon de silicone et autres phoques et les connexions ne devraient pas être dérangé ou enlevé. Pour maintenir la pression en échec, le débit conduit par gravité est préférable lorsque cela est possible. Quand une pompe est nécessaire pour la recirculation du liquide, en commençant après le rinçage avec du PBS et continue au cours de la culture, nous vous recommandons de mesurer directement la pression juste avant que le fluide pénètre dans l'artère pulmonaire avec un capteur de pression. L'ampleur de la pression appliquée doit pas dépasser 15 mm Hg.

Poumons Recellularized peuvent être cultivées pour différentes périodes, allant généralement de 4 jours à 3 semaines au maximum. Perfusion vasculaire est généralement réalisé à 1-3 ml / min pendant la culture endothéliales, tandis que la ventilation est généralement appliquée à un taux de 1 respiration / min pendant la culture épithéliales. Pendant les périodes de culture associée, la ventilation et la perfusion simultanée est approprié. La ventilation peut être effectuée soit avec un milieu liquide ou par air.

Au cours de ces dernières décennies, plusieurs groupes ont réalisé d'importants travaux d'ingénierie tissulaire démontrant la faisabilité de différencier l'épithélium pulmonaire in vitro et de reproduire plusieurs aspects du poumon microanatomie 7,8,9, 10. Cependant, jusqu'à récemment, aucune de ces tentatives 4,5 pour concevoir les tissus pulmonaires avaient abouti à un organe implantables qui a été en mesure de maintenir la séparation entre le sang et les compartiments des voies aériennes et qui pourraient participer à l'échange gazeux. Par conséquent, si les méthodes décrites ne sont qu'une première étape vers l'objectif à long terme de générer des tissus pulmonaires fonctionnels, ce travail est une étape encourageante vers la possibilité d'augmenter la quantité de tissu pulmonaire disponibles pour la transplantation. Par ailleurs, ce travail élabore travail effectué par Ott et al. Uygun et ses collègues et de 11,12, ce qui démontre l'efficacité d'une matrice extracellulaire décellularisé comme un échafaudage pour l'ingénierie tissulaire complexes en trois dimensions des structures et de soutenir la croissance et la survie de différents types de cellules . Ce travail est également importante pour sa contribution à l'arsenal des cellules respiratoires et biologistes moléculaires. En fournissant un unique environnement tridimensionnel qui peut également fournir des stimuli mécaniques, et qui ne partage pas le risque d'accompagnateur rapidement dé-différenciation que l'on pourrait rencontrer lors de l'épithélium de rongeurs en culture en laboratoire avec des méthodes plus traditionnelles 13, les scientifiques pourraient utiliser notre système pour gagner un nouvel éclairage sur les interactions cellule-cellule et cellule-matrice qui jouent un rôle dans la différenciation cellulaire et la fonction. Cette connaissance peut être particulièrement puissant si utilisé comme levier pour orienter le destin des différentes populations de cellules souches, en tant que groupe Cortiella a démontré dans les études initiales 14.

Disclosures

LEN détient des titres dans Humacyte, une société de médecine régénérative. Humacyte ne pas financer ces études, et n'a pas d'incidence sur la conception, l'interprétation, ou la déclaration de l'un des expériences ou des méthodes décrites. Les auteurs (LEN, THP, EAC) et l'Université de Yale ont déposé une demande de brevet relatifs à l'ingénierie des tissus des poumons.

Acknowledgements

Nous remercions Maegan B. Colehour de l'aide pour le développement bioréacteur. Ces études ont été financées par l'Université de Yale Département d'anesthésie et par NIH 098220 HL (à LEN). THP a été soutenu par le NIH T32 GM007171.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthanasia
Heparin Sigma-Aldrich H4784
Sodium nitroprusside Fluka 71778
Euthasol euthanasia solution Virbac Animal Health 710101 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration
Decell Solution
CHAPS Sigma-Aldrich C3023
NaCl American Bioanalytical AB01915
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaOH JT Baker 3722-01
1X PBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Bioreactor Components
480 ml jar Cole-Parmer EW-3460560
Silicone stopper, size 14 Cole-Parmer EW-06298-26
Y-connectors Cole-Parmer ED-30614-08 Used for arterial and tracheal cannulae
Silicone tubing Masterflex (Cole Palmer) 96420-14; 16 L/S 14; 16
Pressure Transducers Edwards Lifesciences PX-212
Check valve Cole-Parmer EW-98553-20 One-way valve
4-way stopcocks Edwards Lifesciences 594WSC
Syringe filter Cole-Parmer 2915-08 PTFE, 0.2μm
Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor)
500 and 1000 ml glass bottles Corning 1395-500; -1L Used for decell and rinsing by gravity
Benzonase Treatment
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140122
FBS Hyclone SH30071.03
Tris-HCl American Bioanalytical AB14043 1M, pH 8.0
MgCl2 JT Baker 2444-01
BSA Sigma-Aldrich A9647
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix

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References

  1. American Lung Association. Lung Disease Data. (2008).
  2. Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. (2010).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
  4. Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
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