Vorgehensweise für Lung Technik

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Published 3/08/2011
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Bioengineering
 

Summary

Wir haben eine dezellularisierte Lunge extrazellulären Matrix und neuartige biomimetische Bioreaktor verwendet werden, um funktionelle Lungengewebe erzeugen können entwickelt werden. Durch Aussaat Zellen in die Matrix und die Kultivierung im Bioreaktor, generieren wir Gewebe, das effektive Gasaustausch zeigt, wenn in vivo für kurze Zeit transplantiert.

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Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for Lung Engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651, doi:10.3791/2651 (2011).

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Abstract

Lungengewebe, einschließlich Lungenkrebs und chronische Lungenerkrankungen wie chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, kommen zusammen auf rund 280.000 Todesfälle pro Jahr; chronisch obstruktive Lungenerkrankung ist derzeit die vierthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten 1. Dazu trägt die Mortalität ist die Tatsache, dass Lunge in der Regel nicht reparieren oder regenerieren jenseits der mikroskopischen zellulären Ebene. Daher ist das Lungengewebe, die durch Degeneration oder Infektion oder Lungengewebe, die chirurgisch reseziert beschädigt ist funktionell nicht in vivo ersetzt. Um zu erforschen, ob das Lungengewebe in vitro erzeugt werden kann, behandelten wir Lungen von erwachsenen Ratten mit einem Verfahren, dass zelluläre Komponenten entfernt, um eine azelluläre Lunge extrazellulären Matrix Gerüst zu erzeugen. Dieses Gerüst behält die hierarchische Verzweigung Strukturen der Atemwege und Gefäßsystem sowie eine weitgehend intakte Basalmembran, die Kollagen IV, Laminin und Fibronectin enthält. Das Gerüst wird in einem Bioreaktor entwickelt, um kritische Aspekte Lungenphysiologie, wie Unterdruckventilation und pulsatile Gefäßperfusion imitieren montiert. Durch Kultivierung Lungenepithel und Gefäßendothel innerhalb des Bioreaktors montiert Gerüst sind wir in der Lage, Lungengewebe, die phänotypisch vergleichbar mit nativen Lungengewebe ist, und das ist in der Lage, in der Gasaustausch für kurze Zeitintervalle (45-120 Minuten) teilnehmen zu generieren. Diese Ergebnisse sind ermutigend und legen nahe, dass Wiederbesiedlung von Lungen-Matrix ist eine tragfähige Strategie für Lungen-Wiederbelebung. Diese Möglichkeit stellt eine Gelegenheit, nicht nur zur Erhöhung der Zufuhr von Lungengewebe zur Transplantation Arbeit, sondern auch die Atmungsorgane Zell-und Molekularbiologie in vitro über einen längeren Zeitraum und in einer genaueren Mikroumgebung als bisher möglich zu studieren.

Protocol

1. Bioreaktor Assembly

Detaillierte Figur (en) des Bioreaktors Konstruktion und Montage für beide Dezellularisierung und Kultur sind in den Abbildungen 1 und 2, jeweils. Alle Komponenten müssen vor der Montage des Bioreaktors sterilisiert werden. Die folgenden spezifischen Punkte werden notiert:

ANSCHLÜSSE:

  1. Die arterielle Kanüle besteht aus einem Luer-Lock-Ansatz verbunden mit einem Y-Splitter durch einen kurzen Abschnitt der Rohre. Der Luer-Lock-Anschluss ist der Infusionsschlauch angebracht, und das Segment der Y, die nicht der Lungenarterie angenäht ist ein Einweg-Ventil verbunden. Die Ein-Wege-Ventil ist so ausgerichtet, dass Flüssigkeit kann bis in den Schlauch (in die entgegengesetzte Richtung wie Perfusion) gezogen werden, aber während der Organperfusion alle Medium strömt in die Lunge.
  2. Die Trachealkanüle besteht ebenfalls aus einem Luer-Lock-Anschluss in Verbindung mit einem Y-Verteiler mit Schlauch. Der Luer-Lock-Verbindung zu einem Atemkreislauf zwischen der Luftröhre Reservoir und der Hauptkammer. Das Segment der Y-Stecker, der nicht auf die Luftröhre wird vernäht ist auch ein Einweg-Ventil verbunden. Die Ein-Wege-Ventil ist in der gleichen Weise wie die arterielle Kanüle ausgerichtet.

FUNKTIONEN:

  1. Die Ein-Wege-Ventile in den arteriellen und Trachealkanülen werden eingesetzt, um Luftblasen in den Schlauch klar, indem Umkehrung der Strömung in der Rohrleitung und daher erlaubt Luftblasen zu entfernen.
  2. Die "atmende loop" enthält zwei Einweg-Ventile, so positioniert, dass mittelfristig nach einem anderen Weg in und aus der Lunge. Eine ausführlichere Beschreibung dieser Funktion ist in einer früheren Publikation aus unserem Labor 2 vorgesehen.
  3. Vascular Perfusion erfolgt mit Hilfe einer Walze Pumpe. Medium in die Pulmonalarterie erfolgt über den beiliegenden Kanüle perfundiert, fließt durch die Lunge Gefäßsystem und die Lungenvene direkt in die Haupt-Bioreaktor, wo mittel-bis zur Perfusion gezogen wird.

2. Organentnahme

  1. Euthanize Erwachsenen (3-6 Monate alt) Fischer 344 Ratten durch Natrium-Pentobarbital Überdosierung, nach Leitlinien, die von der American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP) gesetzt. Hinweis: die Pentobarbital-Lösung umfasst Heparin bei 100 Einheiten / ml zur Antikoagulation.
  2. Spray oder wischen Sie die Brust und Unterleib mit 70% Ethanol.
  3. Öffnen Sie die Brusthöhle, Freilegung der Herz und Lunge, wobei darauf zu achten nicht beschädigen die Lunge. Vorsichtig einen kleinen Fenster, durch das Zwerchfell in die Brusthöhle, wodurch die Lunge zu widerrufen, und erweitern Sie dann diesen Schnitt horizontal, um die Grundlagen der Lunge aufzudecken. Machen Sie zwei Schnitte senkrecht durch die Rippen, und schieben Sie den Brustkorb in das Herz und die Lungen aussetzen.
  4. Bereiten Sie einen Schwerpunkt Perfusion, dh mit Hilfe einer Spritze mit Kolben entfernt, ein 3-Wege-Hahn, und ~ 20 cm Schlauch mit einem 1.5, 21-Gauge-Nadel. Pflegen Sie die Spritze bei ~ 20 cm über dem Tier mit einem Ring zu stehen. Stellen Sie sicher, dass alle Luft aus dem Infusionsschlauch entfernt wird.
  5. Schneiden Sie den rechten Vorhof Blut drain, verhindern, dass es wieder in die Lungen. Cutting den linken Vorhof zur einfachen Entwässerung von Blut und Perfusat aus der Lunge ermöglichen kann auch hilfreich sein, ist aber nicht notwendig.
  6. Führen Sie die Nadel in die Basis des rechten Ventrikels und öffnen Sie den Hahn in die Lunge mit einer Lösung von Heparin und Natrium-Nitroprussid (50U/ml und 1ug/ml jeweils) in PBS perfundiert. Bestätigen Sie, dass die Lungenarterie mit Perfusionsflüssigkeit füllt, und das Blut aus den Lungen Lichtung. Wenn nötig, füllen die Perfusion Spritze mit zusätzlicher Flüssigkeit. Typischerweise werden nur ~ 10ml erforderlich ist.
  7. Weiter Perfusion, bis die Lungen frei von Blut sind, dann stoppen Perfusion.
  8. Präparieren Sie die Luftröhre frei, bis in den Hals so weit wie möglich. Stellen Sie sicher, Luftröhre von der Speiseröhre getrennt. Dissect alle übrigen Verbindungen zum Herz, Lunge und Luftröhre, und entfernen Sie en bloc.
  9. Mit einem Skalpell oder einer scharfen Schere, schneiden Sie die Spitze des Herzens, Freilegung der rechten und linken Herzkammer.
  10. Kanülieren Truncus pulmonalis über die rechte Herzkammer, und Naht in Kraft. Entfernen Sie überschüssiges linksventrikulären Gewebe.
  11. Kanülieren der Luftröhre und Naht in Kraft. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Luftröhre und der pulmonalen arteriellen Kanülen sind so positioniert, dass es keine Torsionsspannung auf die Luftröhre, Lungen oder der großen Gefäße (Abbildung 1).
  12. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in die arterielle Kanüle, da Luftblasen in das System gefangen kann konstanten durch das Organ zu verhindern. In einigen Fällen, eine Luftblase komplett stoppen kann Flüssigkeit flow.To dies zu erreichen, statt das Herz / Lunge bloc in ein Gefäß mit PBS. Verwenden Sie eine Spritze mit Nadel eine kleine Menge von PBS in das Herz Kanüle injizieren, um Luftblasen zu vertreiben.
  13. Lavage der Atemwege mit PBS 4-5 mal, um so viel Luft wie möglich aus der Lunge.
  14. Nach Lavage Schritts abgeschlossen sind, blasen die Lunge mit PBS, das Natrium-Nitroprussid (SNP) bei 1ug/ml. Setzen Sie einen Anschlag auf die Trachealkanüle, so bleibt die Lösung in der Lunge. Lassen Sie die Lunge bis zu 30 Minuten inkubieren, als die gleiche Lösung fließt durch das Gefäßsystem über die Lungenarterie, zur Vasodilatation ermöglichen.
  15. Connect Herz / Lunge einen Bioreaktor Kappe mit dem Luer-Lock-Anschlüsse in Verbindung mit der Y-förmigen Kanülen, in "Bioreaktor Assembly" beschrieben. (Abbildung 1).

3. Orgel Dezellularisierung

  1. Schließen Sie den Deckel (mit Lunge angeschlossen ist), um Dezellularisierung Apparat (Abbildung 1). Die Lungenarterie Kanüle sollte auf die Perfusion Linie zu verbinden, und die Trachealkanüle sollte schwimmen frei. Sicherstellen, dass alle Linien sind klar der Luft. Wie oben beschrieben, kann die Luft in den Leitungen eine Quelle der armen Dezellularisierung werden durch die Verhinderung Fluss decllularization Flüssigkeit. Luft im System eingeschlossene Luft kann auch in die Kultur der Zeit bestehen bleiben, wenn es einen negativen Einfluss auf das Überleben der Zelle 3 haben.
  2. Inflate der Lunge mit PBS / SNP, bis Lungen voll sind, aber nicht über-aufgeblasen. Unmittelbar Kappe der Trachealkanüle, so dass die Lunge aufgeblasen bleibt.
  3. Perfundieren Lunge mit PBS / SNP für mindestens 15 min bei ~ 15 mmHg (20cm H 2 O Druck). Nach 15min oder länger, entfernen Sie den Stopfen aus der Trachealkanüle, damit die Lunge zu entleeren.
  4. Weiter Perfusion mit PBS / SNP für 30min. Wenn nötig, zum Nachfüllen PBS / SNP sicherzustellen Perfusionsdruck bei 10-15 mmHg gehalten wird.
  5. Begin Perfusion mit Dezellularisierung Lösung (8mm CHAPS, 1M NaCl, 25mM EDTA in 1X PBS). Achten Sie darauf, alle Linien sind klar der Luft. Ein Vakuumsystem kann hilfreich sein, Saug-stellen.

Perfundieren mit Dezellularisierung Lösung bis 500ml der Lösung durch die Lunge durchströmt hat. Optimale Druck <15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Diese Regel erfordert 2,5 Stunden. Volumenströme sind in der Regel sehr langsam (0.2-0.5ml/minute) zunächst schnell und in der zweiten Stunde zu erhöhen, um etwa 1ml/minute oder höher. Entfernen Sie regelmäßig verwendet Dezellularisierung Flüssigkeit aus Bioreaktor, wodurch genug flüssig bleibt, um die Lunge und Trachealkanüle zu unterstützen.

4. Orgel Spülen und Sterilisieren

  1. Transfer-Lungen-und Bioreaktor zu einer Gewebekultur Kapuze. Begin Spülen mit sterilem PBS, indem Sie die 500ml Glas, dass die Dezellularisierung Flüssigkeit enthalten und ersetzt mit einem sterilen Gefäß mit bis zu 1 Liter sterilem PBS. Staubsauger benutzen, um sicherzustellen, Linien sind klar der Luft.
  2. Perfundieren PBS durch das Gefäßsystem bei 10-15 mmHg, in der gleichen Weise wie für Dezellularisierung. Entfernen Sie regelmäßig Abfall PBS aus dem Bioreaktor und ersetzen und / oder füllen Sie das PBS-Gefäß mit frischem, sterilem PBS. Es ist ratsam, sterile Technik zu verwenden.
  3. Weiter spülen, bis mindestens 2,5 l sterilem PBS der Lunge haben perfundiert.
  4. Transfer Lunge, um eine neue, sterile Bioreaktor-System mit frischem PBS. Stellen Sie sicher, dass sowohl die gesamte Durchblutung Schleife und der gesamten Atemwege Linien mit Flüssigkeit gefüllt sind. Alle weiteren Schritte werden mit einem pulsatile Pumpe in die Lunge bei 5ml/min perfuse.
  5. Sterilisieren das Gerüst, entweder über Nacht Perfusion mit PBS + 10% FBS + 10% Pen-Strep-Lösung oder für 3 Stunden mit 0,1% Peressigsäure in PBS. Letzteres erfordert Spülung der Lunge mit 3 Änderungen der 250ml PBS über mehrere Stunden, um restliche Säure zu entfernen. Für jede spülen, sollte der Lunge sowie perfundiert, um sicherzustellen, dass alle Teile des Gewebes gut gespült werden belüftet werden.
  6. Übertragen Sie die Lunge zu einem 37 ° C Inkubator und perfuse mit PBS, dass 10% FBS und 10% Penicillin / Streptomycin für ~ 1 Std. oder hat, bis die Temperatur ist ausgeglichen, in Vorbereitung auf Benzonase Behandlung.
  7. Gönnen Lunge mit Benzonase um Überbleibsel DNA zu entfernen:
    1. Warm die Benzonase-Puffer (siehe Tabelle der Reagenzien) bis 37 ° C.
    2. Für jede Lunge, füllen einen 10ml-Spritze mit Benzonase Puffer nur und eine 10ml Spritze mit 90U/ml Benzonase in Puffer.
    3. Stoppen Sie die Durchblutung der Lunge.
    4. Pumpen Sie den Atemweg mit Benzonase Puffer.
    5. Lassen Sie die Lunge zu entleeren (für ~ 1 Minute). Dann blasen die Lunge mit der Benzonase Lösung. Während der Inflation mit Benzonase Puffer & Benzonase, versuchen zu vermeiden Injektion keine Luft in die Lunge.
    6. Lassen Sie die Lunge, ohne Perfusion oder Belüftung bei 37 ° C zu sitzen für 1 Stunde nach dem Aufblasen mit Benzonase.
  8. Fortsetzen Perfusion mit PBS + 10% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin, die sich bereits in den Bioreaktor, und weiter über Nacht. Am folgenden Tag kann die Lunge entweder bei 4 ° C gelagert werden (für bis zu 3 Monate) oder vorbereitet für die Zell-Aussaat.
  9. Zur Vorbereitung des Gerüstes für die zelluläre Wiederbesiedlung, ersetzen Sie das PBS / FBS / Benzonase Lösung mit ~ 250 ml Kulturmedium. Perfundieren für mindestens eine Stunde vor-Zellen eingeführt werden, einnd mit frischem Kulturmedium ersetzen direkt vor der Aussaat Zellen.

5. Recellularization

Die Wahl der Zelle Quelle für Orgel Nachsaat ist Sache der einzelnen Forscher überlassen. Viele Zelle Quellen können verwendet werden, einschließlich im Handel erhältlich Populationen, frisch isolierten neonatalen oder fetalen Lungenzellen, embryonale Stammzellen, oder im Handel erhältliche Zelle Quellen. Spezielle Isolation Protokolle für diese Zellpopulationen anderswo 4,5,6 gefunden werden. Hier stellen wir Anleitungen zur Saat sowohl Endothel-und Epithelzellen Zellpopulationen.

Endothelial Aussaat:

  1. Eine Suspension von gewünschten Endothel-Zell-Population, in geeigneten Kulturmedium. Filter Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb zu Zellklumpen zu entfernen. Eine typische Endothelzellen Aussaat in unserem Labor würde rund 30 Millionen Rattenlunge mikrovaskulären Endothelzellen in 60ml Kulturmedium zu nutzen.
  2. Dispense Zellsuspension in ein kleines Reservoir vorübergehend in die Perfusion Schleife des Bioreaktors (Abbildung 2) eingebaut. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch aus diesem Reservoir und die gesamte Durchblutung Schleife frei von Luftblasen ist.
  3. Infuse Zellen in der Lungenarterie bei 3ml/min mit einer Rolle zu pumpen.
  4. Nach Zelle Infusion weiterhin Perfusion mit Medium aus dem Haupt-Bioreaktor in der gewünschten Geschwindigkeit zurückgeführt.
  5. Auf einer täglichen Basis, sicherzustellen, dass die Infusionsschlauch frei von Luftblasen ist.
  6. Medium sollte mit frischem Medium regelmäßig ausgetauscht werden, ist dies oft getan alle 3-4 Tage.

Epitheliale Aussaat:

  1. Eine Zellsuspension des gewünschten epithelialen Zell-Population. In unserem Labor, das typischerweise aus ca. 5 bis 10 neugeborenen Ratten Lungenzellen. Filter der Bevölkerung durch 40um Zellsieb und suspendieren in 15ml Kulturmedium in einer Spritze. Füllen Sie die Atemwege Behälter mit 80ml Kulturmedium.
  2. Setzen Sie den Bioreaktor in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator, und verbinden Sie die Spritzenpumpe für die Belüftung. Sicherstellen, dass alle Entlüftungsleitungen sind klar der Luft.
    1. Seed die Zellen in der Lunge durch die Injektion von 15 ml Zellsuspension als einzelner Bolus in die Trachealkanüle.
    2. Sofort beginnen einen einzigen, langsamen Atemzug mit der Spritzenpumpe. Dieser Atem ist durch den Rückzug 60ml von Luft aus dem Haupt-Bioreaktor bei 3ml/minute verabreicht werden, damit dauerhaft etwa 20 Minuten. Sicherstellen, dass die Luftfilter an der Hauptstraße Bioreaktor off werden sofort nach der Injektion der Zellsuspension und vor Beginn der langsamen Atem begrenzt.
  3. Lassen Sie die Lunge zu statisch sitzen etwa 18h, und beginnen Sie dann langsam Gefäßperfusion (ca. 0,5 ml / min).

6. Organ Culture

Obwohl die Einzelheiten der Perfusion und Ventilation basiert auf experimentellen Design variieren, sind folgende Punkte zu beachten:

  1. Während endothelial Kultur, ist die Perfusion in der Regel bei 1-3 ml / min mit einer Walze Pumpe durchgeführt. Während epithelialen Kultur, ist die Belüftung in der Regel mit einer kontinuierlichen Rate von 1 Atemzug pro Minute mit einer Spritze Pumpe vorgesehen. Rücknahme von 5-10ml von Luft aus dem Haupt-Bioreaktor ist in der Regel erforderlich, um Lungenventilation bei einem normalen Atemzugvolumen Wirkung. Aufgrund der Notwendigkeit, den Bioreaktor luftdicht während der Beatmung zu erhalten, sollten Lüftungs täglich angehalten werden und die Luft in der Hauptkammer sollte ausgetauscht werden. Alle Luft im System ist Raumluft, die ca. 21% Sauerstoff-Partialdruck ist. Das 5-10ml Rückzug der Luft aus dem Bioreaktor (das führt zu einem 5-10ml Inspiration von Flüssigkeit in der Lunge) ist von der Größe der Lunge auf und wie viele Lappen sind kultiviert (Lappen können für die Analyse eingebunden werden, während die verbleibenden Lappen weiter in Kultur). Die Menge an Luft durch die Spritzenpumpe zurückgezogen ist die Angleichung der "Atemzugvolumen" des kultivierten Lungenzellen gewählt.
  2. Medium sollte etwa geändert werden alle 3-4 Tage während der Kultur.
  3. Während Co-Kultur der beiden Epithel-und Endothelzellen, Experimente in unserem Labor in der Regel erste Saat des Epithels für 4-8 Tage, während welcher Zeit die gezüchteten Gewebe belüftet ist. Das Endothel ist dann über Perfusion ausgesät, nach denen das Gewebe sowohl perfundiert und belüftet wird.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Dezellularisierung

Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollte die frisch entnommenen Lungen Luft, ohne undicht zu halten. Aufblasen sie mit Luft, während in Flüssigkeit eingetaucht können dies - sollte es keine Blasen zeigt Leckagen werden. Die anschließende Dezellularisierung sollte es ~ 500ml Dezellularisierung Flüssigkeit zu fließen durch die Lunge im Laufe der 2,5 bis 3 Stunden bei 37 ° C, und PBS sollte letztlich in der Lage sein über die Lunge auf etwa 10 ml / min Durchfluss (unter ~ 15 mm Hg des hydrostatischen Drucks) am Ende der Spülung. Nach der Behandlung mit 0,1% Peressigsäure und Benzonase, kann in die Lunge bei 4 ° C für bis zu 3 Monate gelagert werden, und bleiben für recellularization geeignet.

Die endgültige dezellularisierte extrazellulären Matrix sollten völlig frei von zellularen Werkstoffen und behalten die grobe, mikroskopische und ultrastrukturelle Eigenschaften der nativen Lunge. Unzureichende Dezellularisierung oder Spülen kann in Rest-DNA "Kleben" auf das Schafott, die visualisiert werden mit einer Standard-Hämatoxylin und Eosin-Färbung kann (siehe Abbildung 3 zum Vergleich) führen.

Wiederbelegung von azelluläre Matrix und Kultur des Lungengewebes

Wenn Zellen frisch aus 7 Tage alten Neugeborenen Rattenjungen, wie in der Online-Ergänzung beschriebenen begleitenden Arbeiten von Petersen und Kollegen 4 isolierte sind, kann man erwarten Zellausbeute von 120-150 Millionen Zellen pro Wurf von 10 Welpen (knapp über 10 Millionen Zellen pro Neugeborene).

Optimale Bedingungen für die Zell-Aussaat und anschließende Kultur der Lunge in den Bioreaktor sollte gut verteilte Zellen innerhalb alle 5 Lungenlappen Ertrag, und sollte Abdeckung von ca. 70% der extrazellulären Matrix Gerüst (Abbildung 3) bieten. Die kultivierten Zellpopulation positiv sein wird für die wichtigsten Atemwege Zellmarkern wie pro-sekretorische Protein-C (SPC), Clara-Zelle sekretorischen Protein (CCSP) und Aquaporin-5 (AQP), in der Reihenfolge der relativen Häufigkeit (Abbildung 4).

Abbildung 1
Abbildung 1. Kanülen Positionen und Dezellularisierung Bioreaktor

Abbildung 2
Abbildung 2. Bioreaktor für die Aussaat und Kultur entwickelt Lungengewebe verwendet

Abbildung 3
Abbildung 3. Histologie der native, dezellularisierte, und die Neuansiedlung von Lungenkrebs

Abbildung 4
Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung für Schlüssel Lunge Marker

Discussion

Die wichtigsten Aspekte der hier vorgestellte System sind die Erhaltung der Sterilität und eine engmaschige Überwachung der Druck aufgebracht, um das Gefäßbett in den Prozess der Vorbereitung und Aussaat das Gerüst und die Kultivierung der neu besiedelt Lunge. Sterilität wird am besten durch Autoklavieren alle Materialien vor dem Gebrauch, und durch die Montage der Lunge in einem geschlossenen System kurz nach Explantation und die Vermeidung von späteren Verletzung dieser Barriere aufrechterhalten. Nach dem dezellularisierte Matrix hat gründlich gespült wurden und in einem sterilen Bioreaktor für Kultur, sollte die Silikonkappe und andere Dichtungen und Verbindungen nicht gestört oder entfernt werden. Um Druck in Schach, wird der Durchfluss durch die Schwerkraft angetrieben vorzuziehen, wenn möglich. Wenn eine Pumpe zur Rückführung von Flüssigkeit erforderlich ist, beginnt nach dem Spülen mit PBS-und Weiterbildung während der Kultur, empfehlen wir direkt den Druck kurz vor der Flüssigkeit der Lungenarterie mit einem Druckwandler eintritt. Die Größe der aufgebrachten Druck sollte nicht mehr als 15 mm Hg.

Recellularized Lunge können für unterschiedliche Zeiträume, typischerweise im Bereich von 4 Tagen bis zu 3 Wochen kultiviert werden. Vascular Perfusion ist in der Regel bei 1-3 ml / min bei Endothelzellen Kultur erreicht, während Lüftung ist in der Regel mit einer Rate von 1 Atemzug / min bei epithelialen Kultur angewendet. Während kombiniert Kultur Zeiten, ist die gleichzeitige Ventilation und Perfusion angemessen. Lüftung kann entweder mit flüssigem Medium oder Luft durchgeführt werden.

Im Laufe der letzten Jahrzehnte haben mehrere Gruppen wichtige Tissue Engineering Arbeit zeigt die Machbarkeit der Differenzierung Lungenepithel in vitro und der Replikation von mehreren Aspekten der Lunge Mikroanatomie 7,8,9, 10 getan. Doch bis vor kurzem hatte 4,5 keinem dieser Versuche Lungengewebe Ingenieur in einem implantierbaren Organ, das in der Lage, um die Trennung zwischen dem Blut und der Atemwege Fächer zu erhalten und das könnte in den Gasaustausch teilnehmen konnte geführt. Deshalb, obwohl die beschriebenen Methoden nur ein erster Schritt zur langfristigen Ziel der Erzeugung von funktionellen Lungengewebes sind, ist diese Arbeit ein ermutigender Schritt in Richtung der Möglichkeit der Erhöhung der Menge des Lungengewebes zur Verfügung zu verpflanzen. Darüber hinaus erarbeitet diese Arbeit Arbeit von Ott et al. Und Uygun und Kollegen 11,12 getan, was die Wirksamkeit eines dezellularisierte extrazellulären Matrix als Gerüst für das Tissue Engineering von komplexen dreidimensionalen Strukturen und unterstützt das Wachstum und Überleben der verschiedenen Arten von Zellen . Diese Arbeit ist auch für seinen Beitrag zum Rüstzeug der Atemwege Zell-und Molekularbiologen signifikant. Durch die Bereitstellung einer einzigartigen, dreidimensionalen Umgebung, die auch liefern können entsprechende mechanische Reize, und dass nicht teilt die damit verbundene Gefahr der schnellen Entdifferenzierung, dass man die beim Züchten Nagetier Epithel im Labor mit herkömmlichen Methoden 13, Wissenschaftler könnten unser System, um neue Einblicke in die Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionen eine Rolle spielen bei der Zelldifferenzierung und Funktion zu gewinnen. Dieses Wissen kann besonders leistungsfähig, wenn als Hebel benutzt, um das Schicksal der verschiedenen Stammzell-Populationen führen, wie Cortiella Gruppe in ersten Studien 14 gezeigt hat.

Disclosures

LEN hat Bestand in Humacyte, ein Unternehmen der regenerativen Medizin. Humacyte nicht finanzieren diese Studien, und hatte keinen Einfluss auf die Gestaltung, Auslegung oder die Berichterstattung über jegliche der Experimente und Methoden beschrieben. Die Autoren (LEN, THP, EAC) und der Yale University haben eine Patentanmeldung in Bezug auf das Tissue Engineering von Lungen eingereicht.

Acknowledgements

Wir danken Maegan B. Colehour um Hilfe bei der Bioreaktor Entwicklung. Diese Studien wurden von der Yale University Klinik für Anästhesie und von NIH HL 098220 (LEN) finanziert. THP wurde durch die NIH T32 GM007171 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthanasia
Heparin Sigma-Aldrich H4784
Sodium nitroprusside Fluka 71778
Euthasol euthanasia solution Virbac Animal Health 710101 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration
Decell Solution
CHAPS Sigma-Aldrich C3023
NaCl American Bioanalytical AB01915
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaOH JT Baker 3722-01
1X PBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Bioreactor Components
480 ml jar Cole-Parmer EW-3460560
Silicone stopper, size 14 Cole-Parmer EW-06298-26
Y-connectors Cole-Parmer ED-30614-08 Used for arterial and tracheal cannulae
Silicone tubing Masterflex (Cole Palmer) 96420-14; 16 L/S 14; 16
Pressure Transducers Edwards Lifesciences PX-212
Check valve Cole-Parmer EW-98553-20 One-way valve
4-way stopcocks Edwards Lifesciences 594WSC
Syringe filter Cole-Parmer 2915-08 PTFE, 0.2μm
Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor)
500 and 1000 ml glass bottles Corning 1395-500; -1L Used for decell and rinsing by gravity
Benzonase Treatment
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140122
FBS Hyclone SH30071.03
Tris-HCl American Bioanalytical AB14043 1M, pH 8.0
MgCl2 JT Baker 2444-01
BSA Sigma-Aldrich A9647
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix

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References

  1. American Lung Association. Lung Disease Data. (2008).
  2. Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. (2010).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
  4. Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
  5. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
  6. Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
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  8. Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
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  14. Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. (2010).

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