उच्च संवेदनशीलता / Balb सी मस्तिष्क के ऊतकों में जांच 5-hydroxymethylcytosine

Neuroscience
 

Summary

5 HMC EpiMark और 5-MC विश्लेषण किट का विश्लेषण और एक विशेष cific बिन्दुपथ के भीतर 5 मिथाइलसिटोसाइन और 5-hydroxymethylcytosine quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. किट 5 - HMC से ग्लूकोज की एक enzymatic β-glucosyltransferase (टी -4 BGT) का उपयोग प्रतिक्रिया के माध्यम से 5-HMC के हाइड्रॉक्सिल समूह के अलावा द्वारा 5 MC अलग. जब 5-HMC CCGG के संदर्भ में होता है, इस संशोधन के एक गैर cleavable साइट के लिए एक cleavable MspI साइट धर्मान्तरित.

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Davis, T., Vaisvila, R. High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue. J. Vis. Exp. (48), e2661, doi:10.3791/2661 (2011).

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Abstract

Protocol

1. डीएनए Glucosylation और प्रतिक्रियाओं नियंत्रण

  1. 1.5 मिली लीटर बर्फ पर प्रतिक्रिया ट्यूब, 5-10 micrograms के जीनोमिक डीएनए (30 micrograms / मिली लीटर के एक अंतिम एकाग्रता के लिए), UDP-ग्लूकोज के 12.4 microliters (80 micromolar के अंतिम एकाग्रता के लिए), 4 NEBuffer के 31 microliters मिश्रण और ऊपर 310 microliters nuclease - मुक्त पानी लाने के लिए 310 microliters के लिए कुल मात्रा.
  2. प्रत्येक 155 microliters के दो नलियों में इस प्रतिक्रिया मिश्रण भाजित.
  3. फिर एक ट्यूब के लिए 30 इकाइयों, या टी -4 β-glucosyltransferase 3 microliters, जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. दूसरी ट्यूब नियंत्रण प्रतिक्रिया है, तो पानी की 3 microliters टी -4 - BGT के बजाय जोड़ने.
  4. 12 से 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दोनों ट्यूबों सेते हैं, जो समय के दौरान टी -4 - BGT ग्लूकोज नमूने में 5-hydroxymethylcytosine समूहों के हाइड्रॉक्सिल समूह के लिए जोड़ देगा.

2. प्रतिबंध एनजाइम पाचन

  1. लेबल तीन मिली लीटर 0.2 पीसीआर पट्टी ट्यूबों 1 से 3 संख्या. विभाज्य प्रतिक्रिया मिश्रण के प्रत्येक में 50 उल.
  2. लेबल तीन मिली लीटर 0.2 पीसीआर पट्टी ट्यूबों 4 6 के माध्यम से संख्या. विभाज्य नियंत्रण मिश्रण के प्रत्येक में 50 उल.
  3. 100 इकाइयों, या MspI का 1 microliter ट्यूबों 1 और 4 में जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  4. ट्यूबों 2 और 5 में 50 इकाइयों, या HpaII का 1 microliter जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  5. ट्यूबों 3 और 6 के लिए कुछ भी जोड़ने के लिए, के रूप में वे नियंत्रण कर रहे हैं मत करो.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए सभी 6 ट्यूबों सेते हैं.
  7. प्रत्येक ट्यूब में proteinase कश्मीर का 1 microliter जोड़ें और 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा proteinase कश्मीर निष्क्रिय.

3. पीसीआर / qPCR द्वारा डीएनए का विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल के अंत बिंदु पीसीआर जो अच्छा प्रदर्शन दिखाया गया है के लिए चोंच LongAmp Taq का उपयोग करता है . अन्य पीसीआर प्रोटोकॉल प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

  1. 5X LongAmp Taq रिएक्शन बफर, 10 millimolar dNTPs, 10 micromolar फॉरवर्ड प्राइमर के 1 microliter, 10 micromolar रिवर्स प्राइमर के एक microliter, 3 टेम्पलेट के microliters के 1.5 microliters के 10 microliters: एक 0.2 बर्फ पर मिली लीटर पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए निम्नलिखित घटकों जोड़ें पिछले कदम, LongAmp Taq डीएनए पोलीमरेज़ 1 microliter, और nuclease मुक्त पानी 50 microliters से डीएनए. इन संस्करणों पीसीआर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के अनुसार बदल सकते हैं.
  2. धीरे प्रतिक्रिया मिश्रण. यदि आवश्यक हो, एक त्वरित स्पिन द्वारा ट्यूब के नीचे सभी तरल एकत्र.
  3. अगर एक गर्म ढक्कन के बिना एक thermocycler का उपयोग खनिज तेल के साथ नमूना ओवरले.
  4. बर्फ से thermocycler पीसीआर ट्यूबों 94 डिग्री सेल्सियस के लिए preheated ब्लॉक के साथ स्थानांतरण और साइकिल चालन के कार्यक्रम शुरू. एक दिनचर्या पीसीआर 3 कदम के लिए, वहाँ एक 30 विकृतीकरण 94 डिग्री सेल्सियस के 15 सेकंड के लिए 30 चक्र, 55 से 65 डिग्री 30 सेकंड के लिए annealing सेल्सियस और 65 डिग्री सेल्सियस विस्तार के द्वारा पीछा किया सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण कदम होना चाहिए 20 सेकंड, या केबी प्रति 50 सेकंड के लिए. यह एक 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार के द्वारा पालन किया जाना चाहिए. वास्तविक समय पीसीआर भी 5 मिथाइलसिटोसाइन और 5-hydroxymethylcytosine की मात्रा quantitate किया जा सकता है है. उत्पाद पुस्तिका, विशिष्ट जानकारी के लिए पाया neb.com पर कृपया देखें.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1 5-hydroxymethylcytosine मात्रा 12 ठिकाना पर विभिन्न माउस / Balb सी ऊतकों के नमूनों में तुलना करें. (ए), अंत बिंदु पीसीआर. (बी), वास्तविक समय पीसीआर.

चार माउस ऊतकों से डीएनए का विश्लेषण किया किया गया था. तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए, वास्तविक समय पीसीआर डेटा बिना खतना के डीएनए के लिए सामान्यीकृत थे. एक मानक वक्र प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नमूने पचाया नहीं है कि नियंत्रण की प्रतिलिपि संख्या (5 नहीं) से 1-6 नहीं नमूनों की नकल संख्या विभाजित करके सामान्यीकृत जा सकता है. बॉक्स्ड जेल लेन 5 HMC वर्तमान में भिन्नता से पता चलता है.

Discussion

वहाँ कई महत्वपूर्ण बातें जब तक इस प्रयोग की स्थापना पर विचार करने के लिए कर रहे हैं. सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि जीनोमिक डीएनए के glucosylation पूरा करने के लिए आय. टी -4 - BGT के अनुक्रम विशिष्टता में जाना जाता है, नहीं है और यह सब्सट्रेट के अनुक्रम के लिए कोई विकल्प नहीं है प्रकट होता है है. इसलिए, कुछ मामलों में, अब ऊष्मायन बार आवश्यक हो सकता है. दूसरा MspI, और HpaII पाचन पूरा हो ताकि पृष्ठभूमि संकेत से बचने के लिए करना चाहिए. इन प्रतिबंध एंजाइमों के लिए, हम 4 घंटे की एक ऊष्मायन समय सलाह देते हैं, लेकिन अब incubations जब अधूरा दरार मनाया जाता है निष्पादित किया जा सकता है. तीसरा, इनपुट डीएनए राशि उपलब्धता पर निर्भर करता है, समायोजित किया जा सकता है के बाद डीएनए की 20 ngs पीसीआर अंत बिंदु के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, हम आपूर्ति नियंत्रण डीएनए जो 5 - एम सी और 5 - HMC मात्रा का ठहराव के लिए जीनोमिक डीएनए के साथ समानांतर में चलाया जा सकता है है के उपयोग की सलाह देते हैं.

Disclosures

दोनों टेड और Romas, इस लेख के लेखक, चोंच के कर्मचारी हैं, Romas किट के मुख्य डेवलपर टेड अनुप्रयोग एवं विकास विभाग है कि इस किट के विकास oversaw के निदेशक के साथ किया जा रहा है.

Acknowledgments

Sriharsa प्रधान, शान्नोन मोरे Kinney, रुको Gyeong चिन, Jurate Bitinaite, यू झेंग, पियरे Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, स्टीवन ई. Jacobsen प्रयोगशाला, UCLA. इस काम आंशिक रूप से 1R44GM095209 01 NIH द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit New England Biolabs E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0323
dNTPs New England Biolabs N0447
molecular biology grade water

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References

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Comments

3 Comments

  1. Will you please send me this article of "High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue". I just cannot download it.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 11:15 PM
  2. Linkejimai nuo Audriaus Buskeviciaus. Sekmes.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 23, 2011 - 2:48 PM
  3. Can glucosylation of C happen in vivo and is it possible that MspI digestion could be partially blocked by such a modification (without prior treatment with T4 BGT)? Thanks.

    Reply
    Posted by: Lise R.
    October 2, 2012 - 5:09 AM

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