Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

Neuroscience
 

Summary

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

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Davis, T., Vaisvila, R. High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue. J. Vis. Exp. (48), e2661, doi:10.3791/2661 (2011).

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Abstract

DNA의 hydroxymethylation은 DNA의 긴 알려진 수정이지만, 최근 epigenetic 연구의 초점이되었다. 포유 동물 DNA는 효소 predominately CPG dinucleotides의 맥락에서, 5 MC로 사이 토신 (C) 잔류물의 5 번째 탄소 위치에 수정됩니다. 5 MC 개발과 질병에 관련된 것으로 아르 효소의 Tet 가족에 의해 5 HMC에 효소 산화 의무가 있습니다. 현재, 5 - HMC의 생물 학적 역할은 완전히 이해되지 않지만 biomarker로서의 가능성 때문에 많은 관심을 생성합니다. 이것은 마우스 배아 줄기 (ES)와의 연결을 세포에서 5 hydroxymethylcytosine을 식별하는 몇 가지 획기적인 연구로 인해 발생합니다.

bisulfite 시퀀싱 방법을 포함한 연구 기술, 쉽게 5 MC 5 - HMC를 구분할 수 없습니다. 몇 가지 프로토콜은 질량 분광법 분석이나 게놈 DNA의 소화 단일 nucleosides의 얇은 층 크로마 토그래피 액체 크로마 토그래피와 결합을 포함한 게놈의 5 hydroxymethylcytosine의 글로벌 양을 측정할 수 존재한다. 도트 얼룩 분석, immunofluorescence, 또는 hydroxymethylated DNA의 침전에 사용될 수 있지만, 이러한 항체가 하나의 기본 resolution.In 추가이없는 대상 5 hydroxymethylcytosine도 존재한다는 항체, 해상도는 immunoprecipitated DNA의 크기와에 대한 의존 microarray 실험이 프로브 디자인에 따라 달라집니다. 그것이 5 hydroxymethylcytosine은 epigenetic 규제의 게놈 또는 역할 존재 정확한 위치를 알 수 있기 때문에, 새로운 기술은 특정 로커스 hydroxymethylation을 식별할 수있는 필요합니다. EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 특정 loci에서 두 수정 구별을위한 솔루션을 제공합니다.

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트 5 methylcytosine 및 특정 DNA를 로커스 내에서 5 - hydroxymethylcytosine의 식별 및 quantitation를위한 간단하고 강력한 방법입니다. 이 효소 접근 방식은 간단한 3 단계 절차에서 isoschizomers MspI과 HpaII의 차동 methylation 감도를 사용합니다.

관심 게놈 DNA는 5 hydroxymethylcytosine에 포도당 moeity를 추가 T4 - BGT와 함께 처리됩니다. 이 반응은 순서대로 독립적인, 따라서 모든 5 HMC이 glucosylated됩니다; 수정되지 않은 또는 5 - MC 포함된 DNA가 영향을받지 않습니다.

이 glucosylation는 다음 제한 endonuclease는 소화옵니다. MspI 및 HpaII 같은 순서 (CCGG)를 인식하지만 다른 methylation 상태에 민감합니다. 사이 토신 차단 절단 중 언제든지 변경 (5 - MC, 5 - HMC 또는 5 GHMC) : HpaII은 완전히 수정되지 않은 사이트를 클리브스. MspI 5 - MC 5 - HMC 아니지만 5 GHMC를 인식하고 클리브스.

프로토콜의 세 번째 부분은 PCR에 의한 로커스의 심문이다. 입력 DNA의 조금은 20 NG를 사용할 수 있습니다. 실험 (glucosylated와 소화) 및 제어 (모의은 glucosylated와 소화) 관심 CCGG 사이트 (100-200 BP)를 측면 primers와 대상의 DNA 증폭이 수행됩니다. CPG 사이트 5 hydroxymethylcytosine 포함되어있는 경우 밴드가 glucosylation과 소화 후에 감지 아니지만 비 glucosylated 제어 반응 인치입니다 실시간 PCR은 hydroxymethylcytosine이 특정 사이트에 얼마나의 근사치를 제공합니다.

본 실험에서는, 우리는 엔드 포인트 PCR에 의한 마우스 Babl / C 뇌 샘플에서 5 hydroxymethylcytosine 금액을 분석합니다.

Protocol

1. DNA의 Glucosylation 및 제어 반응

  1. 얼음 1.5 밀리리터 반응 관에서 게놈 DNA의 50-10 마이크로 그램 (30 마이크로 그램 / 밀리리터의 최종 농도의 경우), UDP - 포도당의 12.4 microliters (80 micromolar의 최종 농도에 대한) NEBuffer 4 31 microliters를 섞어 및 최대 310 microliters nuclease - 무료 물 310 microliters로 전체 볼륨을 가지고 있습니다.
  2. 155 microliters 각각 두 개의 튜브에이 반응 혼합물을 분리.
  3. 어느 튜브에 T4 - β - glucosyltransferase 30 단위, 또는 3 microliters를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다. 두 번째 관 제어 반응이기 때문에 대신 T4 - BGT의, 물 3 microliters를 추가합니다.
  4. T4 - BGT이 예제에서 5 hydroxymethylcytosine 그룹의 수산기 그룹에 포도당을 추가되는 기간 동안 12 ~ 18 시간 동안 섭씨 37도에서 모두 튜브를 품어.

2. 제한 효소 분해

  1. 레이블 세 0.2 밀리리터 PCR - 스트립 튜브 번호 3 1. 각각에 반응 혼합물의 나누어지는 50 UL.
  2. 레이블 세 0.2 밀리리터 PCR - 스트립 튜브 번호 4-6. 각각으로 제어 혼합물의 나누어지는 50 UL.
  3. 튜브 1 사에 MspI의 100 단위 또는 1 microliter를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다.
  4. 튜브 2와 5로 HpaII 50 단위 또는 1 microliter를 추가합니다. 부드럽게 최대 pipetting 아래로 잘 섞는다.
  5. 그들이 통제하는 한 튜브 3 6 아무것도 추가하지 마십시오.
  6. 최소한 4 시간 동안 섭씨 37도에서 모두 6 튜브를 품어.
  7. 각각의 튜브에 Proteinase K 1 microliter를 추가하고 30 분 섭씨 40도에서 알을 품다.
  8. 10 분 섭씨 95 도에 잠복기로 Proteinase K를 Inactivate.

3. PCR / qPCR에 의해 DNA를 분석

이 프로토콜은 잘 수행하기 위해 표시되었습니다 엔드 포인트 PCR을위한 코의 LongAmp DNA 형성 촉매를 사용합니다. 기타 PCR 프로토콜을 대체하실 수 있습니다.

  1. 배 LongAmp DNA 형성 촉매 반응 버퍼, 10 millimolar dNTPs, 10 micromolar 앞으로 프리머 1 microliter, 10 micromolar 리버스 프라이머 1 microliter, 템플릿 3 microliters 1.5 microliters 10 microliters : 얼음 0.2 밀리리터 PCR 반응 관에 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 이전 단계 LongAmp DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 1 microliter, 그리고 nuclease없는 물을 최대 50 microliters부터 DNA. 이러한 볼륨이 사용되는 PCR 프로토콜에 따라 변경될 수 있습니다.
  2. 부드럽게 반응을 섞는다. 필요한 경우, 빠른 스핀에 의해 튜브의 바닥에 모든 액체를 수집합니다.
  3. 온수 뚜껑없이 thermocycler를 사용하는 경우에는 미네랄 오일 샘플을 중첩.
  4. 섭씨 94 도까지 preheated 블록과 얼음 thermocycler로 PCR 튜브를 전송하고 자전거 프로그램을 시작합니다. 일상적인 3 단계 PCR의 경우, 15 초 동안 변성 섭씨 94도 30주기, 30 초 동안 풀림 섭씨 55-65도, 및 확장 섭씨 65도 다음에 30 초 동안 섭씨 94 도로 한 초기 변성 단계 있어야 20초 또는 킬로바이트 50 초. 이것은 5 분 섭씨 65 도에 마지막으로 확장하여 다음해야합니다. 실시간 PCR은 또한 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine의 금액을 quantitate을 수행할 수 있습니다. 구체적인 내용을 neb.com에있는 제품 매뉴얼을 참조하십시오.

4. 대표 결과 :

그림 1
그림 1. 다른 마우스 Balb / C 조직 샘플에서 로커스 12 5 hydroxymethylcytosine 금액의 비교. (A), 엔드 포인트 PCR. (B), 실시간 PCR.

네 마우스 조직에서 DNA 분석했다. 비교 목적을 위해 실시간 PCR 데이터를 삭제하지 않은 DNA에 정상화되었다. 표준 곡선은 사본 번호를 결정하는 데 사용되었다. 샘플은 소화되지 않은있는 컨트롤의 복사본 번호 (없음 5)에 의해 시료 없음 1-6의 사본 번호를 나누어 정상화 수 있습니다. 박스 겔 레인 5 HMC 선물의 편차를 보여줍니다.

Discussion

본 실험을 설정할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 첫째, 게놈 DNA의 glucosylation 끝까지 진행하는 것이 중요합니다. T4 - BGT의 시퀀스 특이성이 알려져 있으며 그것은 기판 시퀀스에 대한 선택의 여지가 없어 보인다되지 않습니다. 따라서, 어떤 경우에, 더 이상 부화 시간이 필요할 수 있습니다. 둘째, MspI 및 HpaII 소화 배경 신호를 방지하기 위해 완료해야합니다. 이러한 제한 효소의 경우, 우리는 4 시간 배양 시간을 권장하지만, 불완전 절단이 관찰되면 더 이상 incubations을 수행할 수 있습니다. 셋째, 입력 DNA 금액은 DNA의 20 ngs는 엔드 포인트 PCR에 사용할 수 있기 때문에, 상황에 따라 조정할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 5 - MC 5 - HMC의 부량에 대한 게놈 DNA와 병렬로 실행할 수 있습니다 공급 제어 DNA의 사용을 권장합니다.

Disclosures

테드와 Romas 모두는이 문서의 저자는 코의 직원되며 Romas 테드이 키트의 개발을 감독 응용 프로그램 및 개발 부서의 이사 있기 때문에 키트의 주요 개발자입니다.

Acknowledgments

Sriharsa Pradhan, 섀넌 모리 키니, 잠시 만요 경인 친, Jurate Bitinaite, 유 청, 피에르 올리비에 Esteve, Romualdas Vaisvila, 스티븐 E. 야콥센의 연구소, UCLA. 이 작품은 부분적으로 NIH 1R44GM095209 - 01에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit New England Biolabs E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0323
dNTPs New England Biolabs N0447
molecular biology grade water

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References

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Comments

3 Comments

  1. Will you please send me this article of "High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue". I just cannot download it.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 11:15 PM
  2. Linkejimai nuo Audriaus Buskeviciaus. Sekmes.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 23, 2011 - 2:48 PM
  3. Can glucosylation of C happen in vivo and is it possible that MspI digestion could be partially blocked by such a modification (without prior treatment with T4 BGT)? Thanks.

    Reply
    Posted by: Lise R.
    October 2, 2012 - 5:09 AM

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