보조 전기 분무 이온화 질량 분석법 (SESI - MS)를 사용하여 특성화 세균 휘발성 물질

Bioengineering
 

Summary

보조 전기 분무 이온화 질량 분석계 (SESI - MS)은 샘플 전처리가 필요하지 않고 휘발성 유기 화합물 (휘발성 유기 화합물)의 검출이 가능합니다. 이 프로토콜은 SESI - MS를 사용하여 세균 휘발성 유기 화합물의 급속한 (분 이내) 특성화하기위한 지침을 제공합니다.

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Bean, H. D., Zhu, J., Hill, J. E. Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS). J. Vis. Exp. (52), e2664, doi:10.3791/2664 (2011).

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Abstract

보조 전기 분무 이온화 질량 분석계 (SESI - MS)는 샘플 전처리가 필요없이, 휘발성 화합물의 신속한 감지를 위해 개발된 방법입니다. 방법은 먼저 펜 및 동료 1 설명되었으며 불법 마약 2 폭발물 3-4, 피부 휘발성 물질 5 특성과 호흡 6-7의 분석의 검출에 적용되었습니다.

SESI 이온화는 전기 분무 솔루션과 휘발성 analyte 사이 프로톤 전달 반응에 의해 발생하고, 마찬가지로 전통적인 전기 분무 이온화 (ESI)에, 이종 유기 분자의 분석에 따라서 적합합니다. 그러나, 표준 ESI 달리 SESI의 프로톤 전송 과정은 솔루션의 기상 단계보다는 (그림 1)에서 발생하고, 따라서 SESI 유기 휘발성 물질과 에어로졸 검출에 가장 적합합니다.

우리는 박테리아 식별 및 특성 8 방법으로 세균 휘발성 물질의 검출에 SESI - MS의 이용을 확대하고 있습니다. 우리는 통계 분석 방식과 결합된 SESI - MS 휘발성 지문이, 성장 매체의 다양한 세균 장군, 종, 그리고 혼합 문화를 차별화하는 데 사용할 수있는 것을 증명하고있다. 8 자 SESI을 사용하여 박테리아 휘발성 지문을 취득하는 단계를 제공합니다 강력한 박테리아 식별 및 특성화를 위해 최적화되어야 수단 매개 변수를 포함 - MS.

Protocol

그림 1
그림 1. 세균성 휘발성 물질의 SESI - MS 분석을위한 도식. 세균성 문화의 상부는 SESI 반응 챔버 (2)에 CO 2 (1)에 의해 전이됩니다. 휘발성 물질들은 전기 분무 구름을 통과 SESI 반응 챔버를 통과하고 (3) 이온화되기로. 일단 이온화, 휘발성 물질은 분석을 위해 질량 분석계 (4)에 연루됩니다. 초과 캐리어 가스 및 휘발성 물질 unreacted 세균성 보호의 추가 조치로, 0.22 μm의 필터 (5)를 통과하고, 화학 후드로 배출됩니다. 삽입된 페이지 : SESI의 전기 분무 니들이 날카롭게 바늘 끝과 함께 (40 μm의 ID가) 모세관 실리카이다.

세균 휘발성 물질, E.의 특성화를위한 SESI - MS의 사용 시범으로 대장균 K12와 P. 녹농균이라는 박테리아의 PAO1는 37 50 ML LB - 레녹스 24 H에 대한 aerobically 양식 아르 ° C와 상부의 휘발성 물질의 SESI - MS 스펙트럼은 2 분 후에 수집하고 있습니다. 2 L / 분 유동 속도로 이산화탄소 (99.99 %)는 반응 챔버에 휘발성 배달 캐리어 가스로 사용됩니다. SESI 반응 챔버 사용자 정의했습니다 지어진 원래의 전기 분무 이온 소스를 대체 API - 3000 (SCIEX)에 장착되어. 스펙트럼은 0.1 % 개미 산성, 5.0 %의 메탄올 및 전기 분무 솔루션으로 94.9 %의 물 (V / V)를 사용하여 긍정적인 이온 모드에서 수집한 5 전달됩니다 날카롭게 바늘 끝과 모세관 비 전도성 실리카를 통해 NL / S (40 μm의 ID가). 인가 전압 2.5 KV입니다. - 500 다, MCA 모드, 40 검사, 3 S / 스캔하고, 2 분 총 분석 시간이 20 : 분석 1.4.2 소프트웨어 (응용 Biosystems)는 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 데이터 수집에 사용됩니다.

1. Culturing 시스템

  1. 실험 (예, 통기, 빛, 온도, 등)뿐만 아니라 질량 분석기로 휘발성 물질의 효율적인 전달에 수종의 성장 요구 사항을 고려하여 문화를 성장에 해당하는 선박을 선택합니다. 우리가 사용하도록 선택할 문화 병 적어도 두 luer 포트가 스레드 모자가 장착되어 표준 100 ML Pyrex 미디어 병입니다. 입구 라인 캐리어 가스 샘플 병에 전달 및 콘센트 라인이 악기에 VOC 배달 (그림 1)에 대해 다른 포트를 통해 삽입 한 luer 포트를 통해 삽입됩니다. 추가 포트 연결됩니다.
  2. 이전 culturing 샘플을 위해 누수를 확인하기 위해 물에 선박과 잠수함의 기압. 가스 누출이 약하거나 결석 휘발성 이온 신호의 형태로 비정형 결과의 주요 원인이됩니다.

2. 생물학 실험 : 설정과 안전 고려 사항

  1. 귀하의 가설에 적합한 조건에서 문화를 성장. 그것은 적어도 두 생물 학적, 각 두 기술은 복제, 복제 각 변수에 대해 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 모든 문화 조건에 대한 빈 준비 (중간, 항생제 등) 및 샘플과 동일한 조건에서 공백으로 품어.
  3. 고려 종족의 biosafety 레벨 (들)을 데리고, 당신이 사용하는 생물 학적 에이전트에 적합한 안전 조치를 사용합니다.
  4. 악기 및 가능한 생물 학적 에이전트와 가스 이송 라인의 오염을 방지하기 위해, 캐리어 가스 라인에 적절한 기공 크기의 필터를 설치합니다. 필터는 SESI 반응 챔버에 휘발성 물질의 전송에 방해가되지 않겠지만 약간 에어로졸 전송의 효율성에 영향을 수 있습니다 6.
  5. 생물 학적 대리인이 밝혀 지던의 경우에 적절한 봉쇄을 보장하여 문화 병에 가스 전송 뚜껑을 부착하면 보조 억제 또는 biosafety 캐비닛을 사용합니다.
  6. 시작하고 병 내부의 압력을 빌드하지 않습니다 방식으로 샘플 병에 캐리어 가스 흐름을 종료할 수 있습니다.

3. 악기 최적화

참고 : SESI - MS가 특별히 샘플 휘발성 물질하도록 설계되었습니다 때문에 악기를 사용하기 전에 향기로운 개인 관리 항목 (예 : colognes, 구강 세척제, 로션, 섬유 유연제), 껌, 담배 등의 사용을 제한할 수 있습니다. 단단히 연구실의 모든 휘발성 화학 물질 모자, 제어 공기는 테스트 기간 동안 최대한 임시 보관함.

모든 신호 강도 및 안정성에 영향을 미치는 다음과 같은 수단 매개 변수, 악기 및 실험을위한 최적화해야합니다.

  1. 전기 분무 솔루션과 유량이 : 계정으로 운영 악기 극성 (긍정적이거나 부정적인 이온 모드) 및 대상 화합물의 분자 특성을 복용, 당신이 목표하고자하는 분자의 클래스에 해당하는 전기 분무 솔루션을 선택합니다. 이 실험에서는 전기 분무 솔루션은 0.1 % 개미 산성, 5.0 %의 메탄올, 이하 극지 분자의 신호 강도를 향상 94.9 %의 물 (V / V)입니다 whil좋은 신호 안정성을 제공하는 전자. 솔루션 5 NL / s의의 흐름 속도 제공됩니다
  2. 캐리어 가스 유량 : 캐리어 가스 유량은 전기 분무의 안정성과 신호 강도에 영향을 줄 수 있습니다. 2 L / 분 유량에서 CO 2 (≥ 99.99 %)이 여기에 사용됩니다.
  3. 니들의 모양과 위치는 : 바늘 팁 형상과 위치는 강력하게 신호 강도 및 안정성에 영향을 미칩니다. 새로운 바늘을 설치할 때 바늘의 위치가 낮은 배경, 높은 analyte 신호 강도, 및 신호 안정성 사이의 균형을 만들 최적화해야합니다. 바늘 변경 후 SESI 스펙트럼를 재현하기 위해서, 그것은 당신이 당신의 기록에 관찰된 스펙트럼을 일치시킬 수있을 때까지 당신이 바늘 위치를 조정으로 주기적으로 검사 결과를 수집하는 것이 필요합니다. 질량 분석 오리피스에 전기 분무의 바늘 끝의 거리는 1 것입니다 - 5mm.
  4. 적용 전압 : 시스템에 적용되는 전압 신호 이온 강도 및 전기 분무 테일러 원추의 안정성에 영향을 미칩니다. 또한, 최적의 전압은 전기 분무 솔루션과 바늘 팁 형상에 의존적일 수 밖에 없습니다. 실험의 시리즈의 시작 부분에서, 사용중인 시스템에 대한 최적의 스펙트럼 및 신호 안정성을 산출 전압을 결정하고 이후의 모든 실험이 전압을 사용합니다. 우리 시스템, 2.0의 적용 전압 - 5.0 KV는 최적의 신호 강도와 전기 분무의 안정성을 제공합니다. 본 실험에서는 2.5 KV이 사용됩니다.

4. 켜기 및 분석을위한 SESI - MS 조정

  1. 전압 공급 장치가 해제되어 있고 시스템이 전기의 방전입니다함으로써 시작합니다. 전압 공급 장치의 표시등이 점등이 0 멀티미터에서 전압을 보장), 2에서, 그리고 3) 전기 접지 리드를 보장 1)하여이 문제를 마십시오.
  2. 실험에 적합한 전기 분무 솔루션을 설치합니다.
  3. 캐리어 가스를 켜고 및 실험을위한 적절한 속도로 흐름을 설정합니다.
  4. 반응 챔버에 전기 분무 솔루션의 제공을 시작하는 전기 분무 저수지에 압력을 적용합니다.
  5. 전압 공급 켜고 및 실험을위한 적절한 값을 전압을 조정합니다.

참고 :이 시점에서 이온화 소스의 금속 표면은 위험한 충격을 전달할 수 있습니다. 전압 공급 장치가 켜져되었습니다 일단 악기 주위 작업시 큰주의.

  1. 적용 전압 미세 조정 조정을하는 동안 SESI - MS 스펙트럼을 모니터링을위한 튜닝 방법을 설정합니다. 귀하의 시스템과 실험에 최적화된 것으로 인수 매개 변수를 사용합니다. 모든 검사가 독립적인 스펙트럼을 생산 있도록 다중 채널 수집 (MCA) 확인란을 (해당되는 경우) 지우기, 10 수집 시간을 설정할 수 - 15 분, 그리고 인수를 시작합니다. 캐리어 가스 배경의 스펙트럼 이제 관찰해야합니다.
  2. 이전 실험에 대한 CO 2 검색과 일치하는 안정된 총 이온 크로마토 그램 (TIC)와 재현성 스캔을 얻기 위해 적용 전압 미세 조정 조정을합니다. 전압 조정되었습니다되면, 악기가 안정화되도록 5 분 동안 스펙트럼과 TIC를 수집 진행합니다.
  3. 일단 기기의 안정성이 필요한 경우, 인수 시간을 조정 데이터 범위 및 MCA 선택하여 샘플에 맞게 수집 방식을 설정 보장합니다. 기록에 대한 캐리어 가스 배경 스펙트럼을 수집합니다.

5. 당신의 세균성 문화의 휘발성 지문을 구하기

  1. 빈 스펙트럼을 수집하기 위해 우회 회선을 통해 운반 기체 흐름을 직접, 그리고 악기의 가스 전송 라인 (밸브 폐쇄) 빈 샘플을 첨부합니다.
  2. 샘플 병에 밸브를 열고 우회 라인의 밸브를 닫습니다.
  3. 시스템이 반응 챔버의 습도가 안정화되는 시간 동안, 30 초 동안 평형 수 있습니다. 평균의이 기간은 재현성 스펙트럼을 얻기 위해 필수적입니다. 시스템이 equilibrated 있는지 확인하려면 평균 기간 동안 변경됩니다 TIC를 모니터링하고자하고, 이후 안정 수 있습니다.
  4. 시스템이 equilibrated되면, 스펙트럼 수집을 시작합니다.
  5. 스펙트럼이 수집되면, 먼저 다음 샘플 밸브를 폐쇄, 캐리어 가스 바이패스 라인을 개방하고, 마지막으로 샘플 병을 제거하여 샘플 병을 제거하십시오. , 전송 라인에서 수분과 adsorbed 휘발성 물질을 제거 샘플 - 투 - 샘플 carryover를 방지, 4 분 - 2 캐리어 가스와 함께 시스템을 플러쉬.
  6. 간헐적으로 철저한 빈 뺄셈을 보장하기 위해 추가적인 빈 스펙트럼을 수집, 각 세균의 샘플에 대해 5.5 - 5.2 단계를 반복합니다. 불완전한 빈 뺄셈은 이어질 것입니다대기압 이온화 기술에 공통적으로있는 귀하의 처리 스펙트럼의 화학적 배경 봉우리의 모양 (예, phthalates, 실리콘 등) 9.
  7. 당신의 검사 결과를 수집하면, 이온 신호로 TIC 및 개별 봉우리의 최대 강도에 의해 결정 악기의 선형 검출 한계를 초과하지 않도록하십시오. 악기의 감지기의 위쪽 한계를 초과하는 이온은 샘플을 대표하지 않습니다 유물의 봉우리를 생성할 수 있습니다.

6. 대표 결과

SESI - MS 스펙트럼의 예를으로이 세균 휘발성 물질, E.에 대한 긍정적인 이온 모드 휘발성 지문을 얻을 수 있습니다 대장균P. 37 24 H에 대한 LB - 레녹스에 aerobically 재배 녹농균이라는 박테리아는 ° C (그림 2) 표시됩니다. E. 대장균 휘발성 스펙트럼은 M / Z = 118에서 인돌에 의해 지배되어 이것은 E.에게 제공 콜리 문화 P.의 스펙트럼 반면, 자신의 특성 냄새, 녹농균이라는 박테리아는 protonatable 봉우리의 큰 다양성을 포함하고 있습니다.

휘발성 스펙트럼의 봉우리의 상대적인 농도가 제 3에 설명되어있는 수단이 매개 변수에 의존하는주의하시기 바랍니다. 이러한 매개 변수는 단단히 재현할 수 스펙트럼을 얻기 위해서는 실험에서 실험을 제어해야합니다.

그림 2
그림 2 새 - 빼는 긍정적인 이온 모드 SESI - MS 스펙트럼 (20~150미터 / Z). E.의 대장균 K12와 P. 37 LB - 레녹스 24 H 에어로빅 성장 후 녹농균이라는 박테리아 PAO1 휘발성 물질을 ° C. SESI 스펙트럼에서 관찰 봉우리에 대한 자세한 내용을 보려면, Zhu, 외. 8 참조하십시오.

Discussion

박테리아는 박테리아 식별 10-12과 신진 대사 상태의 평가를 위해 활용할 수있는 휘발성 물질의 다양한 조합을 생산하고 있습니다. SESI - MS 방법은 여기서 설명하는 것은 급속하게 종족의 식별을위한 박테리아 "지문"을 생성하는 샘플 준비를하지 않고 박테리아 휘발성 물질을 (두 분 이내에) 특성화하는 수단을 제공합니다. 지난 몇 십년 8 다른 대기압 이온화가 MS의 기술은 선택적 이온 유동 튜브 (선별)과 프로톤 전달 반응 (PTR) 질량 분광법을 포함한 휘발성 화합물의 특성에 적용되었습니다. SESI이 다른 이온화 방법을 통해 제공하는 독특한 장점은 복합 식별을위한 중요한 도구입니다 조각 구체적인 봉우리 (SESI에 맞게 조정될 수 있습니다 질량 분석기의 적절한 유형을 제공) 할 수있다는 것입니다. 우리는 위에 나열된 프로토콜의 정상 분열을 해결하지만, 조각화 정보는 세균 휘발성 물질의 특성에 사용할 수있는 방법의 예를 들면, 외, Zhu을 참조하시기 바랍니다 않았 8.

SESI - MS 숨을 분석을 통해 세균성 폐 감염의 현장 검출에 직접 응용 프로그램을 가지고 있지만, 휘발성 샘플링이 가능합니다 어느 설정에도 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 신진 대사 질환의 진단에 관련된 소변, 혈액 및 호흡에 휘발성 물질의 분석은 위장 질환, 암, 및 환경 노출은 잘 SESI - MS에 적합합니다. 13,14 SESI - MS도있다 , 숙성 노화, 또는 망치고과 관련된 특성 휘발성 물질에 대한 식품의 신속한 분석을 포함하지 않은 임상 VOC 지문 애플 리케이션의 광범위한. 15-18

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH 그랜트 P20 RR021905 - 01, CF RPD 부여 STANTO07R0, 그리고 NASA 부여 NNH09ZNE002C에 의해 후원됩니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
API-3000 Triple Quadrupole Instrument SCIEX Purchased with Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)
SESI Ion Source Instrument Custom-made; See reference 6
Gas flow meter Equipment Cole-Parmer EW-03217-74
Carbon dioxide Equipment Airgas CD I300 ≥ 99.99% pure
Nitrogen Equipment Airgas NI UHP300 Ultra high purity
100 mL glass media bottles Equipment VWR international 89012-114 GL45 screw threads
Bottle caps with luer ports Equipment Bio Chem Fluidics 00945T-3 Cap assembly
Luer port plugs Equipment Bio Chem Fluidics 009LP Cap assembly
Tubing 1/4" (OD) x 1/8" (ID) Equipment Cole-Parmer EW-95875-02 Cap assembly & gas transfer lines
Tubing 1/8" (OD) x 1/16" (ID) Equipment Cole-Parmer EW-06605-27 Cap assembly
Two-way valves Equipment Cole-Parmer 07391-04 Cap assembly
Filter, Grade AAQ Equipment Balston Filters 9922-05
Formic acid, LC/MS grade Reagent Fisher Scientific A117-05AMP Electrospray solution
Methanol, LC/MS grade Reagent Fisher Scientific A456-500 Electrospray solution
Water, LC/MS grade Reagent Fisher Scientific W6-500 Electrospray solution

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References

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