共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

Immunology and Infection
 

Summary

本論文では、ヒト末梢血単核細胞にアロ抗原特異的アネルギーを誘発するための簡単​​なテクニックを説明します。技術は、非alloreactiveドナー細胞を生成するために臨床的に適用することができます。これらの細胞の注入は免疫再構築を改善し、同種造血幹細胞移植後の毒性を減らすことができる。

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Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673, doi:10.3791/2673 (2011).

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Abstract

同種造血幹細胞移植(AHSCT)は、先天性と後天血液疾患を持つ多くの患者の治療の最善の機会を提供しています。残念ながら、健康な患者の組織を認識し、損傷alloreactiveドナーT細胞の移植は、移植片対宿主病(GVHD)が1になることがあります。成功AHSCTに1つの課題は、ドナーのT細胞、特に免疫再構築や再発の予防の有益な効果の関連を損なうことなく移植片対宿主病(GVHD)の予防です。 GVHDは、幹細胞の移植からまたは薬理学的免疫抑制の投与によるドナーT細胞の非特異的な枯渇することによって防ぐことができます。残念ながら、これらのアプローチは、感染や病気の再発2-4増加させる。代替戦略は選択的に移植前にレシピエントの抗原提示細胞(APC)によってallostimulation後alloreactiveドナーT細胞を枯渇することです。これらallodepletion戦略の早期の臨床試験は、過剰な移植片対宿主病(GVHD)5、6のないHLA不適合造血幹細胞移植後の免疫再構築を改善。ただし、一部のallodepletion技術は、特殊な受信者APCの生産6、7を必要とし、いくつかのアプローチは、ドナー病原体特異的T細胞の枯渇8およびCD4を含むオフターゲット効果は9調節細胞をTをしている可能性があります。一つの代替的なアプローチがalloreactiveドナーT細胞の活性化です。アロ抗原特異的低応答性の誘導を介して。 CD28を介する共刺激シグナル10の封鎖を提供しながら、これは受信者APCとの刺激的なドナー細胞によって達成されます。試験管11に病原体と腫瘍関連抗原のT細胞応答を維持しながら、この"alloanergization"アプローチは1-2ログで同種反応性を減少させる。戦略は、正常に完了したとalloanergizedドナーT細胞がHLA不適合急速な免疫再構築の結果として造血幹細胞移植、いくつかの感染症との歴史的な制御の受信者よりも重度の急性および慢性GVHDの間または後に注入された1進行中の臨床パイロット研究2で採用されているHLA不適合移植12 unmanipulated。ここでは、HLA不適合無関係な刺激のPBMCにalloanergizedされた末梢血単核細胞(PBMC)の世代のための私達の現在のプロトコルを記述する。 AlloanergizationはCD28を介する共刺激をブロックするリガンドB7.1とB7.1に対するモノクローナル抗体の存在下でallostimulationによって実現されます。この技法は、特殊な刺激APCの生産を必要とし、唯一のシングルと、比較的簡単なex vivoでのインキュベーションのステップを必要とする、実行するのは簡単ですしていません。このように、アプローチは容易に低下同種反応性ドナーT細胞を生成するために臨床使用するための標準化が、過剰な移植片対宿主病(GVHD)なしで免疫再構築を改善するためにAHSCTの設定で養子移入するための病原体特異的免疫を保持することができます。

Protocol

Discussion

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Hypaque PLUS GE Healthcare 17-1440-02
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093
Hepes 1M Invitrogen 15630-080
L-Glutamine 200mM Invitrogen 25030-081
Gentamicin Invitrogen 15750-060
Human AB serum (heat inactivated) Gemini Bio Products 100-512 Use validated batches
Complete Culture Media (500ml) 440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps Corning 3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies See protocol text
U bottomed 96 well culture plates BD Biosciences 353077
Monoclonal CD3 antibody Beckman Coulter Inc. IM0178 Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody Beckman Coulter Inc. IM1376 Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen Microbix EL-01-02
Tritiated Thymidine NEN NET027
Scintillation Fluid PerkinElmer, Inc. 1205-440
Harvester Tomtec
Printed Filtermat A PerkinElmer, Inc. 1450-421
Filter Bag PerkinElmer, Inc. 1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter Wallac
null

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hi, I am a graduate student at Johns Hopkins university and will be interested to use your protocol for experiments. This is a very nice work. I am wondering if you had tried to measure the alloreactivity by intracellular cytokine staining? Is it reliable and correlates with the proliferation? Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Yen-Ling C.
    July 8, 2012 - 8:26 AM
  2. Hello Yen-Ling C..

    Thanks for your comments. Yes, using this system you can see less proliferation by CFSE dilution and tritiated thymidine incorporation, as well as reduced IFN-gamma intracellular staining from responders. A primary assay after 3-6 days of allostimulation, and also upon repeat stimulation with first party stimulators works. Best regards, CM Barbon

    Reply
    Posted by: Christine B.
    July 8, 2012 - 12:50 PM

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