在斑马鱼胚胎的代谢标记和Bioorthogonal点击化学成像聚糖

Biology

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Summary

点击化学的方法,允许炔标签聚糖在斑马鱼胚胎的快速,非侵入性和强大的标签描述。在这项研究中,已故的原肠胚形成阶段,在斑马鱼胚胎的包围层Fucosylated聚糖成像。

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Jiang, H., Feng, L., Soriano del Amo, D., Seidel III, R. D., Marlow, F., Wu, P. Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (52), e2686, doi:10.3791/2686 (2011).

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Abstract

活体成像聚糖最近已经启用了一个bioorthogonal化学记者战略治疗叠氮或炔标记的单糖1,2细胞或生物体。修改后的单糖,聚糖的生物合成机制处理,纳入细胞表面的糖复合物。 bioorthogonal叠氮或炔标签用于可视化的荧光探针,然后让共价键共轭,或用浓缩和glycoproteomic分析的亲和力探头。这个协议描述fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的无创成像通常使用的,包括程序:1)单细胞阶段的胚胎显微注射与国内生产总值5 alkynylfucose(国内生产总值FucAl),2)标签包围层fucosylated聚糖通过生物 ​​相容性铜(I)催化叠氮炔环加成反应(CuAAC),并通过共聚焦显微镜3 3)成像叠氮共轭荧光团的斑马鱼胚胎。这里描述的方法可以很容易地扩展到其他类别的聚糖,如含有唾液酸4 N -乙酰5,6的糖链,在发展中国家斑马鱼和其他生物可视化。

Protocol

1。蛋的收集和Dechorionation

  1. 收集和斑马鱼的卵转移到35mm培养皿中,删除尽可能多的水,然后添加1毫克/毫升Pronease在E3胚胎培养基E(5 mM氯化钠,0.17 mM的氯化钾,0.33毫米氯化钙2 · 2H 2 O,0.33毫米硫酸镁4,PH = 7.4),绒毛膜消化。
  2. 3-5分钟后,合并到一个烧杯中弥漫着鱼水(60毫克的“即时海洋”每公升蒸馏水H 2 O)的菜,轻轻的鸡蛋转移到烧杯中,并允许鸡蛋到入水“落“。
  3. 鱼水三次冲洗的鸡蛋。从他们的绒毛膜大部分的鸡蛋会被释放。
  4. 使用火抛光的玻璃巴斯德吸管,转让dechorionated鸡蛋琼脂糖涂层的培养皿菜肴充满E3胚胎中期。

2。显微注射与国内生产总值FucAl

  1. 以下报道的协议 7,准备注射菜。
  2. 转移到充满E3胚胎中期注射菜dechorionated鸡蛋。
  3. 准备针,2μL注射液和负载。该解决方案包含了20毫米的国内生产总值FucAl合成chemoenzymatically 8任的Alexa Fluor 594 -葡聚糖(5%W / V)作为示踪或酚红样染料(0.1%W / V)在0.2 mol氯化钾。作为阴性对照,与GDP -岩藻糖注射液取代国内生产总值FucAl。
  4. 打破了针,调整喷油压力和持续时间,产生了1 NL下降9。
  5. 注入1 NL的任何一个解决方案的鸡蛋。
  6. 转移到琼脂糖涂层培养皿充满E3胚胎中期的菜蛋。
  7. 在28 ° C孵育的鸡蛋和未受精的卵受精后三到四个小时内删除。

3。 BTTES - 铜(I)催化点击化学反应

  1. 当胚胎达到理想的发育阶段(如已故的原肠胚,组织分割和早期幼虫),外套一个96孔板,用琼脂糖基地。
  2. ,每孔加入92μLE3胚胎中期,随后另外4μL的Alexa Fluor 488叠氮(从一个2.5毫米的股票在H 2 O),2μLBTTES,硫酸铜4 6:1复杂,和轻轻摇动混合。
  3. 点击化学试剂使用火抛光的玻璃巴斯德吸管转移到胚胎。每口井应包含少于五个胚胎。
  4. 添加2.5μL新鲜配制的抗坏血酸钠(100毫米股票在H 2 O)发起的点击反应 3 。终浓度为每一个试剂的Alexa Fluor 488叠氮:100微米; 硫酸铜 4:50微米; BTTES:300微米;抗坏血酸钠:2.5毫米。
  5. 3分钟后,加入2微升bathocuproine磺酸(H 2 O 50毫米股票),生物相容性铜螯合剂,然后立即稀释100μLE3胚胎中期淬火反应。
  6. 胚胎玻璃培养皿和清洗处理的胚胎与15毫升的E3胚胎中期的2倍。

4。成像

  1. MatTek玻璃底部的微孔盘上放置一个超低熔点琼脂糖(E3胚胎中期的1.2%(W ​​/ V))的下降,胚胎放入琼脂糖下降。
  2. 位置的胚胎背侧或外侧,并置于冰上5分钟,以巩固琼脂糖下降的菜。 E3胚胎培养基添加轻轻的菜,直到它涵盖了琼脂糖下降。
  3. 顺序使用共聚焦显微镜,荧光和明亮的现场图像采集。所有胚胎图像采集使用一个5微米的一步区间。综合数字准备使用ImageJ软件。

5。代表性的成果

图1显示了我们两个步骤的标签战略的工作流程。图2显示了斑马鱼的胚胎在受精后9.5小时(HPF)通过BTTES介导CuAAC标签。 BTTES是一个三(triazolylmethyl)胺为基础的配体。它加速CuAAC显着时在原位生成铜(一)协调,促进在生物系统中的环加成反应迅速没有明显的毒性。紧接着一个3分钟的点击反应,我们能够探测到强大的国内生产总值FucAl处理的胚胎标签(图2,左侧面板)。只有背景荧光检测控制胚胎显微注射与GDP -岩藻糖(图2中,右图)。

图1
图1标签fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的包围层的战略。

图2
图2。fucosylated聚糖通过BTTES铜(I)催化点击化学斑马鱼胚胎发育期间体内成像。单细胞阶段斑马鱼的胚胎显微注射单剂量的国内生产总值FucAl并允许发育运到9.5 HPF。胚胎的Alexa Fluor 488叠氮BTTES铜(一)催化反应。使用共聚焦显微镜成像反应胚胎。最大强度Z -投影图像的Alexa Fluor 488荧光(上图);明场(下图)。比例尺:100微米。

故障排除

问题原因补救
看不健康的胚胎显微注射的溶液中含有污染物核苷酸糖的纯度应大于85%。检查你的源代码。
没有标签后的反应铜浓度低于30微米要小心,不要稀释反应液加​​入过量E3胚胎培养基加入胚胎时,反应率显着下降,当铜浓度低于30微米的。
胚胎死亡后的反应胚胎处理不当确保吸管火抛光和反应容器涂一层非常薄的0.5%琼脂糖。
图像看起来参差不齐所用试剂不正确混合后再加入胚胎按照建议的顺序添加试剂,并确保点击化学试剂已正确之前加入胚胎混合。
图像显示,胚胎受损剧烈摇晃的​​胚胎损害的反应过程中一旦胚胎是在溶液中轻轻摇动少于10秒。

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Discussion

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是部分支持由美国国立卫生研究院(GM093282到十五分; 3U54AI057158 - 06S1到RDS)和艾伯特爱因斯坦医学院的启动资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 203165
Alexa Fluor 488 azide Invitrogen A10266
dextran, Alexa Fluor 594 Invitrogen D-22913
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A7631
Bathocuproinedisulfonic acid Acros Organics 164060010
Glass bottom microwell dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

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References

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Comments

1 Comment

  1. Surprisingly light on the references, and mostly their own. One wonders how they came to these ligands and conditions? Showy, yes; scholarly, no.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 12, 2011 - 2:59 PM

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