डिम्बग्रंथि कूप और एक Proteolytically सड़ सकने 3 आयामी प्रणाली में इनकैप्सुलेशन संस्कृति के लिए एक विधि

Bioengineering

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Summary

एक 3D आतंच alginate interpenetrating नेटवर्क में डिम्बग्रंथि कूप encapsulation के लिए एक नई विधि में वर्णित है. इस प्रणाली के proteolytic गिरावट के साथ संरचनात्मक समर्थन को जोड़ती अपरिपक्व रोम के विकास का समर्थन करने के लिए परिपक्व oocytes उत्पादन. इस विधि संस्कृति सेल समुच्चय के लिए लागू किया जा सकता है विस्तार को सीमित किए बिना सेल सेल संपर्क बनाए रखना.

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Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System. J. Vis. Exp. (49), e2695, doi:10.3791/2695 (2011).

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Abstract

डिम्बग्रंथि कूप अंडाशय है कि सेक्स हार्मोन secretes की कार्यात्मक इकाई है और oocyte परिपक्वता का समर्थन करता है इन विट्रो कूप तकनीक में मॉडल कूप विकास के लिए एक उपकरण प्रदान करने के क्रम में बुनियादी जीव विज्ञान की जांच, और आगे तकनीक में प्रजनन क्षमता बनाए रखने के रूप में विकसित किया जा रहा 1-4 क्लिनिक. हमारे में इन विट्रो संस्कृति प्रणाली hydrogels रोजगार के क्रम में 3 डी कूपिक वास्तुकला, सेल सेल बातचीत और paracrine संकेत है कि प्रत्यक्ष कूप 5 विकास को बनाए रखने के द्वारा देशी डिम्बग्रंथि पर्यावरण नकल. इससे पहले, रोम सफलतापूर्वक alginate, एक आभ्यांतरिक शैवाल व्युत्पन्न polysaccharide के कैल्शियम 6-8 आयनों के साथ जमाना प्रक्रिया में सभ्य थे. Alginate 0.25% w / ध् की एकाग्रता में गठन hydrogels कूप संस्कृति के लिए सबसे अनुमोदक थे, और उच्चतम 9 विकास क्षमता को बनाए रखा. Alginate hydrogels degradable, नहीं इस प्रकार कूप है कि कूप 10 विकास को प्रभावित कर सकता पर एक compressive शक्ति में कूप व्यास परिणाम में वृद्धि कर रहे हैं. हम बाद में एक संस्कृति एक आतंच alginate interpenetrating (एफए IPN) नेटवर्क है, जो में आतंच और alginate की एक मिश्रण एक साथ gelled हैं पर आधारित प्रणाली विकसित की है. इस संयोजन एक गतिशील यांत्रिक वातावरण प्रदान करता है क्योंकि दोनों घटकों मैट्रिक्स कठोरता शुरू में योगदान है, लेकिन, बढ़ती कूप द्वारा secreted proteases ही समर्थन प्रदान alginate छोड़ने मैट्रिक्स में आतंच नीचा. IPN के साथ, alginate सामग्री नीचे 0.25% है, जो अकेले 5 alginate के साथ संभव नहीं है कम किया जा सकता है. इस प्रकार, के रूप में कूप फैलता, यह एक कम compressive कम ठोस सामग्री के लिए कारण बल का अनुभव होगा. इस के साथ साथ, हम encapsulation विधि और एक एफए IPN भीतर डिम्बग्रंथि रोम के लिए एक में इन विट्रो संस्कृति प्रणाली का वर्णन. गतिशील यांत्रिक वातावरण प्राकृतिक डिम्बग्रंथि वातावरण जिसमें छोटे रोम एक कठोर प्रांतस्था में रहते हैं और अधिक अनुमोदक मज्जा करने के लिए कदम के रूप में वे 11 आकार में वृद्धि mimics . degradable नैदानिक ​​अनुवाद के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण घटक क्रम में 10 से अधिक मात्रा में 6 गुना वृद्धि हुई है कि मानव रोम vivo में सामान्य से गुजरना समर्थन हो सकता है.

Protocol

1. कूप अलगाव

जानवरों पर प्रयोग प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए दिशा निर्देशों और नियमों स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा निर्धारित और स्थापित संस्थागत पशु का प्रयोग करें और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में केयर प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

इष्टतम परिणामों के लिए, सभी dissections पीएच नियंत्रण के लिए l15 मीडिया में किया जाता है, सीओ 2 के परिवेश स्तर पर 37 पर ° सी गरम चरणों का तापमान नियंत्रण के लिए, और एक साफ बेंच पर बैक्टीरियल संदूषण को कम करने के लिए. विच्छेदन मीडिया (डीएम) l15 50 / आइयू एमएल पेनिसिलिन और 50 μL स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल और 1% FBS के साथ पूरक मीडिया के साथ तैयार है. रखरखाव मीडिया (एम एम) 50 / आइयू एमएल पेनिसिलिन और 50 μL स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल और 1% FBS के साथ पूरक αMEM मीडिया के साथ तैयार है.

  1. एक नया 1-2 एमएल 0.1% Collagenase और 0.1% DNase युक्त एम एम के साथ 35 मिमी पेट्री डिश में 16 दिन पुरानी माउस से हौसले से dissected अंडाशय स्थानांतरण. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक मशीन के अंदर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. ऊष्मायन के बाद, डीएम में कई धोने कदम collagenase हटायें, और फिर एक 35 मिमी ताजा डीएम के साथ पेट्री डिश को हस्तांतरण करते हैं. धीरे रोम (या काटने) दो 28 5 / 8 गेज डिस्पोजेबल सीरिंज जुड़ी सुइयों का उपयोग करके पूरे अंडाशय से दूर flicking द्वारा अंडाशय से रोम पृथक. कूप की अखंडता को नुकसान पहुँचाए बिना संभव के रूप में ज्यादा stroma के रूप में निकालें. अंडाशय प्रति 20-40 माध्यमिक रोम (130-150mm) काटना. ये रोम आमतौर पर दैहिक कोशिकाओं के 2-3 परतों है.
  3. अच्छी तरह से एक 60 मिमी (इन विट्रो फर्टिलाइजेशन) पेट्री डिश आईवीएफ, और 3 एमएल बाहरी रिंग एम.एम. के केंद्रीय 1 एमएल एम.एम. जोड़ें. आईवीएफ संक्षेप में कुल्ला पकवान की बाहरी रिंग के लिए एक विंदुक के साथ बरकरार रोम स्थानांतरण, और तब उन चुनिंदा केंद्रीय अच्छी तरह से में स्थानांतरित (1.4 देखें ). इनक्यूबेटर में इस आईवीएफ पकवान स्टोर.
  4. सभी रोम के बाद एकत्र कर रहे हैं, चयन कदम एक 5 8x बढ़ाई के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत किया जाता है. स्वस्थ रोम निम्नलिखित morphological विशेषताओं है:
    • 2-3 दैहिक सेल परतों
    • 130-150 मिमी
    • Oocyte और दैहिक कोशिकाओं के बीच कोई जुदाई
    • बरकरार है और दौर oocytes
      स्वस्थ रोम encapsulation के लिए आईवीएफ व्यंजन के केन्द्र में स्थानांतरण.

2. कूप इनकैप्सुलेशन, विधि 1 - "ड्रॉप विधि"

  1. बीच ही में आईवीएफ डिश के 40 मिमी CaCl 2 के साथ 50 / आइयू टीबीएस में एमएल थ्रोम्बिन के 1 एमएल जोड़ें . पहले गला लें, और बर्फ पर फाइब्रिनोजेन स्टॉक (50 मिलीग्राम / एमएल टीबीएस में) रखने. कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले सही फाइब्रिनोजेन लाओ.
  2. तैयार मिश्रण 1x Pbs, पीबीएस समाधान में 0.5% alginate और 50 समाधान 1.7 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूब में एक 02:01:01 अनुपात में मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन द्वारा समाधान / फाइब्रिनोजेन alginate. समाधान में बुलबुले शुरू करने से बचें. धीरे भंवर और स्पिन नीचे. समाधान थोड़ा बादल दिखाई देता है और तुरंत उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए.
  3. जगह फाइब्रिनोजेन / एक आईवीएफ पकवान की बाहरी रिंग में alginate समाधान के दो बूंदों: encapsulation और धोने के लिए एक 10 μL छोटी बूंद के लिए एक 90 μL छोटी बूंद. वाष्पीकरण में कमी करने के लिए, बंद विदारक माइक्रोस्कोप हीटिंग मंच पर बारी. स्थानांतरण एक 200 सुक्ष्ममापी micropipette टिप, और जल्दी मिश्रण का उपयोग संस्कृति मीडिया (<5 μL) की एक न्यूनतम राशि के साथ 10 μL छोटी बूंद में 10-15 रोम. समाधान का एक न्यूनतम राशि (<5 μL) पहली बूंद से और मिश्रण के साथ 90 μL छोटी बूंद में रोम के सभी स्थानांतरण.
  4. इसके साथ ही एक कूप और फाइब्रिनोजेन / alginate थ्रोम्बिन / Ca 2 + समाधान में आईवीएफ पकवान में एक 10 μL पिपेट टिप, और रिलीज का उपयोग कर समाधान के 5 μL aspirate. इस चरण को दोहराएँ जब तक सभी रोम encapsulated रहे हैं.
  5. क्रॉस - लिंक थ्रोम्बिन / Ca 2 + समाधान में 5-7 मिनट के लिए मोती. मोती आतंच जैल के रूप में गहरा हो जाएगा. एक पेट्री डिश युक्त एम.एम. में मोती स्थानांतरण, गहरे रंग की मोतियों के साथ पहली बार शुरू. 15-30 inthe इनक्यूबेटर मिनट के लिए रवाना शेष थ्रोम्बिन कुल्ला के लिए पकवान सेते हैं.
  6. एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति कूप विकास मीडिया के 100 μL, और छवि तुरंत युक्त थाली में मोती का स्थानांतरण. विकास मीडिया (जीएम) αMEM 10 MIU / एमएल पुनः संयोजक FSH, 3 मिलीग्राम / एमएल BSA के साथ पूरक मीडिया के साथ तैयार है, 1 मिलीग्राम / एमएल के गोजातीय fetuin, 5 μg / इंसुलिन की एमएल, 5 μg / एमएल transferrin के, और 5 एनजी / एमएल सेलेनियम की.

3. कूप इनकैप्सुलेशन, विधि 2 - "Parafilm विधि"

  1. समाधान / फाइब्रिनोजेन alginate 1.7 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूब में एक 1:1 के अनुपात में 0.5% alginate समाधान और 50 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान के मिश्रण से तैयार करें.
  2. पिपेट 7.5 3 मिमी spacers के साथ एक parafilm लेपित गिलास स्लाइड पर मिश्रण / फाइब्रिनोजेन alginate की μL बूँदें. एक बूंद में एक minima के साथ 1 कूप स्थानांतरणमीडिया के एल राशि.
  3. प्रत्येक ड्रॉप करने के लिए 7.5 थ्रोम्बिन / Ca 2 + समाधान के μL जोड़ें. मिश्रण अनावश्यक है क्योंकि जेल लगभग तुरंत रूपों.
  4. दूसरा parafilm लेपित गिलास स्लाइड के साथ जैल कवर, स्लाइड उल्टा एक 100 मिमी पेट्री डिश में डाल और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण.
  5. एम.एम. युक्त एक पेट्री डिश में मोतियों का स्थानांतरण, और फिर अच्छी तरह के रूप में पहले वर्णित संस्कृति में. यदि मोती एक साथ रहना, जो मोती के बीच पार से जोड़ने की वजह से है, वे धीरे संदंश के साथ अलग किया जा सकता है.

4. कूप इमेजिंग और मीडिया बदलें

  1. हर 2 दिन, सुसंस्कृत रोम एक रोशनी खुर्दबीन और कूप व्यास सॉफ्टवेयर प्रोग्राम ImageJ के साथ मापा जाता है का उपयोग imaged कर रहे हैं.
  2. हर 2 दिन, विकास मीडिया (50 μL) के आधे से ताजा, पूर्व equilibrated वृद्धि मीडिया द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है.

5. 3 डी मैट्रिक्स से और इन विट्रो Oocyte परिपक्वता में कूप रिकवरी (IVM )

  1. संस्कृति के 8 दिनों के बाद, hydrogels स्पष्ट दिखाई देते हैं आतंच घटक की गिरावट को पूरा करने के लिए कारण है, और रोम 300-400 सुक्ष्ममापी की एक व्यास के लिए विस्तार. शेष alginate alginate-lyase संयंत्र व्युत्पन्न, एक एंजाइम है कि विशेष रूप से alginate degrades और जानवर की कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करता द्वारा अपमानित है.
  2. मोती युक्त कुओं से विकास मीडिया निकालें और 10 / आइयू αMEM में एमएल alginate lyase के 100 एमएल जोड़ें. इनक्यूबेटर में 25-30 मिनट के लिए थाली छोड़ो.
  3. एक कुंद अंत टिप के साथ भंग मोतियों से रोम निकालें. पहले एक आईवीएफ डीएम युक्त पकवान की बाहरी रिंग के स्थानांतरण, और फिर केंद्र में अच्छी तरह से, भी धोने डीएम युक्त.
  4. धोने के बाद, बाहर रोम हस्तांतरण, और इन विट्रो परिपक्वता मीडिया में तो एक आईवीएफ परिपक्वता मीडिया वाले पकवान की आंतरिक रिंग (IVM) αMEM, एफसीएस 10%, 1.5 एचसीजी के IU / एमएल से बना है, और 5 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) के
  5. 15-16 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर स्थानांतरण .
    जांच मेघपुंज कोशिकाओं विस्तार के लिए रोम. Oocyte से मेघपुंज कोशिकाओं को हटाने के लिए, अंतिम एकाग्रता के लिए hyaluronidase समाधान जोड़ने के 0.1 मिलीग्राम / एमएल और इनक्यूबेटर में 2-3 मिनट के लिए सेते हैं. कतरनी oocyte से मेघपुंज कोशिकाओं ऊपर और नीचे pipetting कई बार एक 75 मिमी micropipette टिप का उपयोग करें. एक प्रकाश या एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत oocyte की परिपक्वता के स्तर का निर्धारण करते हैं. संभव चरणों से कम से कम सबसे परिपक्व हैं,:
    • Degenerated. oocyte दो या अधिक टुकड़ों में खंडित है.
    • कीटाणु (जीवी) पुटिका मंच. oocyte अर्धसूत्रीविभाजन एचसीजी जोखिम है, जो oocyte (जीवी) के नाभिक की निरंतर मौजूदगी से स्पष्ट है के जवाब में फिर से शुरू नहीं किया.
    • कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD). परमाणु झिल्ली oocyte से अनुपस्थित है, लेकिन वहाँ कोई ध्रुवीय शरीर में मौजूद है. इसलिए, oocyte अर्धसूत्रीविभाजन - मैं में अब भी है.
    • मेटाफ़ेज़ द्वितीय गिरफ्तार oocyte (MII). oocyte अर्धसूत्रीविभाजन फिर से शुरू है, और अब मेटाफ़ेज़ - द्वितीय में गिरफ्तार कर लिया. एक ध्रुवीय शरीर एक प्रकाश या एक विदारक माइक्रोस्कोप पर दिखाई जानी चाहिए. oocyte MII में रहते हैं जब तक कि बाद के प्रयोगों में निषेचित जाएगा.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

हम एक एफए IPN में इन विट्रो संस्कृति में के लिए (चित्रा 1) डिम्बग्रंथि के रोम के एक उपन्यास encapsulation विधि का वर्णन किया. डिम्बग्रंथि के रोम एक दैहिक कोशिकाओं की कई परतों से घिरा oocyte से मिलकर बनता है. कई सेलुलर डिब्बों के बीच संचार स्वस्थ कूप विकास और oocyte परिपक्वता के लिए आवश्यक है. एक 3D hydrogel में कूप encapsulation के कूप विस्तार का समर्थन करता है जबकि 9,11,12 कूप की वास्तुकला को बनाए रखने. के रूप में रोम का विकास, उनकी मात्रा तेजी से फैलता है और encapsulating biomaterial एक बाधा compressive शक्ति के विकास के बिना इस विस्तार की अनुमति चाहिए. एफए IPN एक नेटवर्क दो प्राकृतिक सामग्री, जहां आतंच plasmin द्वारा proteolytically degradable कूप द्वारा सक्रिय है और alginate जैविक 13 निष्क्रिय (चित्रा 2) के साथ बनाया गया है . कूप विकास के दौरान, आतंच गिरावट कूप के पास स्थानीय रूप से शुरू होता है, और जारी रहता है जब तक आतंच hydrogel से मंजूरी दे दी है. alginate गैर degradable घटक है, जो संस्कृति की अवधि भर में बरकरार hydrogel के 3D संरचना का समर्थन करता है.

रोम विकास के माध्यमिक स्तर (150-180 सुक्ष्ममापी व्यास) में अलग थे और एफए - IPN जैल में विकास के antral चरण में 400 सुक्ष्ममापी करने के लिए विस्तारित. उत्तेजना के साथ एचसीजी, सुसंस्कृत रोम मेघपुंज सेल विस्तार से गुजरना कर सकते हैं और oocytes निषेचन के लिए अर्धसूत्रीविभाजन और प्रगति मेटाफ़ेज़ द्वितीय को फिर से शुरू कर सकते हैं. इन परिणामों का सुझाव है कि encapsulation विधि और encapsulating सामग्री (चित्रा 3) इन विट्रो में कूप संस्कृति और सफल परिपक्वता की अनुमति दी.

Encapsul आसपास आतंच गिरावटपैदा रोम संस्कृति के पहले दिन शुरू होता है और 6 दिन तक पूरा है. Aprotinin, एक घुलनशील plasmin अवरोध करनेवाला, आतंच गिरावट में परिवर्तन और encapsulating सामग्री (चित्रा 4) में यांत्रिक ढाल का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि रोम 0.01 TIU / एमएल aprotinin साथ सुसंस्कृत हैं, आतंच पहले 4 दिनों के लिए अपमानित धीमी है. बहरहाल, रोम अभी भी antral चरण के लिए विकसित कर सकते हैं और oocytes मेटाफ़ेज़ द्वितीय अर्धसूत्रीविभाजन फिर से शुरू करने के लिए सक्षम रहने के बाद aprotinin removed.A aprotinin के उच्च एकाग्रता (0.1 TIU / एमएल) काफी आतंच गिरावट रोकता है, मैट्रिक्स कठोरता कूप विस्तार और दैहिक सेल को रोकता है मैट्रिक्स में आक्रमण मनाया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. कूप विकास के फ़्लोचार्ट डिम्बग्रंथि कूप एक केन्द्र स्थित oocyte दैहिक कक्षों की एक या अधिक परतों, जो oocyte विकास का समर्थन करने से घिरे होते हैं. के रूप में रोम preovulatory antral चरण के लिए माध्यमिक से विकसित, दैहिक oocyte आसपास कोशिकाओं पैदा करना और अंतर है, और oocyte आकार में बढ़ जाती है इन विट्रो परिपक्वता में (IVM) कूप संस्कृति के लिए अंतिम कदम है, जब दैहिक कोशिकाओं करने के लिए आसन्न oocyte, मेघपुंज कोशिकाओं करार दिया, एचसीजी उत्तेजना के बाद विस्तार, और oocyte अर्धसूत्रीविभाजन शुरू और एक मेटाफ़ेज़ (MII) द्वितीय चरण के लिए प्रगति.

चित्रा 2a
चित्रा 2a. Alginate और इन विट्रो में 3 डी कूप संस्कृति के लिए आतंच alginate (क) Alginate एक प्राकृतिक biomaterial है कि इन विट्रो कूप अपनी कोमल जमाना और जैव रासायनिक गुणों, जैसे जाल आकार, नियंत्रणीय कठोरता और जैविक जड़ पदार्थ की एक विशिष्त स्थिति के कारण संस्कृति में के लिए उपयुक्त है . Alginate α-एल guluronic (G) एसिड और β डी mannuronic एसिड (एम) के एक रेखीय polysaccharide copolymer है. दोहरा जी monomers के साथ क्षेत्रों, "जी ब्लॉक" करार दिया है, द्विसंयोजक कैल्शियम आयनों की उपस्थिति में एक hydrogel के रूप में पार से जुड़े हैं.

चित्रा 2b
चित्रा 2b (द्वि) लघु समझाया रोम संस्कृति की शुरुआत में alginate में कम compressive शक्ति का अनुभव. हालांकि, के रूप में कूप मनका में विस्थापित की मात्रा का विस्तार बढ़ रही है, जो अधिक से अधिक कूप विस्तार की विपरीत दिशा (ख-II) में compressive शक्ति में परिणाम.

चित्रा 2c
चित्रा 2c व्यक्तिगत पॉलिमर चेन आतंच - alginate समाधान में पूरी तरह से उलझ पार से जोड़ने के लिए पहले से कर रहे हैं. एफए - IPN के दोनों घटकों के शुरू करने के लिए तुरंत पार से लिंक के रूप में वे थ्रोम्बिन और कैल्शियम के मिश्रण को उजागर कर रहे हैं.

चित्रा 3a
चित्रा 3a. फ़्लोचार्ट कूप और एक एफए माध्यमिक IPN. रोम में अलगाव encapsulation के लिए एक 16 दिन पुरानी माउस (ऐ) से अलग कर रहे हैं. प्रजनन अंगों (A-ii) विच्छेदित कर रहे हैं, और पृथक रोम रखरखाव मीडिया (A-III) के साथ एक डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.

चित्रा 3b
चित्रा 3b फाइब्रिनोजेन alginate समाधान में कूप encapsulation के लिए ड्रॉप विधि (बी: i-iv). फाइब्रिनोजेन alginate समाधान की दो बूँदें, rinsing (10 μL) ड्रॉप और encapsulation ड्रॉप (90 μL) पकवान (बीआई) में pipetted हैं. अगले 3-5 रोम rinsing के ड्रॉप (बी ii) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. Rinsing और मीडिया हटाने के बाद, रोम encapsulation के ड्रॉप (बी iii) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. प्रत्येक कूप 5 एक 10 μL विंदुक टिप के साथ μL फाइब्रिनोजेन - alginate समाधान के साथ aspirated है और फिर थ्रोम्बिन / समाधान कैल्शियम (बी iv) में निष्कासित कर दिया.

चित्रा -3 सी
चित्रा -3 सी 5 मिनट के लिए मनका crosslinks. parafilm फाइब्रिनोजेन alginate समाधान में कूप encapsulation के लिए विधि (C: i-III). फाइब्रिनोजेन alginate समाधान (7.5 μL) parafilm लेपित गिलास स्लाइड पर pipetted है और रोम को व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक ड्रॉप करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं के बाद rinsing (Ci, ii). थ्रोम्बिन समाधान (7.5 μL) (सी iii) प्रत्येक ड्रॉप करने के लिए जोड़ा जाता है.

चित्रा 3 डी - ई
चित्रा 3 डी - ई. बूँदें एक दूसरे parafilm लेपित गिलास स्लाइड के साथ आते हैं और एफए - IPN इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए Crosslinked है. (डी) एक 96 - अच्छी तरह से थाली में समझाया रोम विकास मीडिया के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. (ई) एफए IPN (सफेद तीर) में समझाया कूप की एक छवि.

चित्रा 4
चित्रा 4. बढ़ रही है folli द्वारा आतंच गिरावटcle. रोम संस्कृति अवधि है, जो कूप के चारों ओर एक स्पष्ट सर्कल के द्वारा प्रदर्शन किया है के दौरान एफए IPN आतंच घटक नीचा. कूप 3D वास्तुकला शेष alginate द्वारा समर्थित है. जिस दिन 0 (D0) आतंच अभी भी बरकरार है और कूप के आसपास मैट्रिक्स बादल है, के बाद संस्कृति में 1 दिन (D1) कूप के आसपास स्पष्ट अंगूठी (सफेद तीर) प्रकट होता है और आतंच गिरावट सामने त्रिज्यात दिन पर विस्तार जारी 2 (D2) और संस्कृति के दिन 4 (D4).

चित्रा 5
चित्रा 5. कूप विकास की छवियाँ प्रतिनिधि छवियों 0 दिन ofsecondary एफए - IPN में कूप विकास (ए), 4 (बी), 6 (सी) और संस्कृति के (डी) 8. 8 दिनों के बाद इन विट्रो में, antral रोम परिपक्व थे, और जिसके परिणामस्वरूप MII चरण oocytes (ई, ध्रुवीय शरीर काला तीर के साथ दिखाया गया है) दिखाए जाते हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6. आतंच गिरावट aprotinin से हिचकते 2 दिन, 4, 10 और 12 पर रोम बढ़ते प्रथम पंक्ति में दिखाए जाते हैं.. Aprotinin सांद्रता में 0.01 / TIU एमएल (दूसरी पंक्ति) और 0.1 TIU / एमएल 0 दिन, 2, और 4 पर संस्कृति मीडिया को जोड़ा गया है. केवल 0.01 TIU / एमएल अपमानित aprotinin aprotinin हटाने के बाद आतंच के साथ संस्कृतियों कूप और antral चरण में पहुंच गया. रोम 0.1 में सुसंस्कृत TIU / एमएल aprotinin एफए - IPN में विकसित नहीं किया.

संक्षिप्तीकरण पूरा नाम
CO 2 इनक्यूबेटर 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर
COC मेघपुंज oocyte जटिल
3D 3 आयामी
डीएम विच्छेदन मीडिया
EGF Epidermal वृद्धि कारक
एफए IPN आतंच - alginate interpenetrating नेटवर्क
FBS भ्रूण गोजातीय सीरम
जीएम ग्रोथ मीडिया
जी.वी. कीटाणु पुटिका
एचसीजी मानव chorionic gonadotropin
इसके इंसुलिन transferrin सेलेनियम पूरक
आईवीएफ पकवान अच्छी तरह से इन विट्रो निषेचन पकवान में 60 मिमी केंद्र
एम.एम. रखरखाव मीडिया
MII चरण oocyte मेटाफ़ेज़ द्वितीय चरण oocyte
rFSH पुनः संयोजक कूपिक उत्तेजक हार्मोन
टीबीएस Tris खारा buffered
TIU Trypsin निरोधात्मक इकाइयों

तालिका 1 संकेताक्षर.

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Discussion

प्रस्तुत एक एफए IPN में डिम्बग्रंथि कूप encapsulation विधि इन विट्रो में एक 3 डी वातावरण में कूप संस्कृति की अनुमति देता है. एक एफए - IPN एक गतिशील, सेल उत्तरदायी मैट्रिक्स जिसमें प्रारंभिक यांत्रिक गुणों आतंच और alginate दोनों के संयोजन द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. संस्कृति के दौरान, समझाया कूप proteases कि केवल IPN का एक घटक है, आतंच, जो धीरे - धीरे घटते जेल कठोरता है कि संस्कृति के अंत में शेष alginate द्वारा पूरी तरह योगदान है में परिणाम नीचा सक्रिय है. एक एफए IPN के साथ गतिशील यांत्रिक गुण प्राप्त विकासशील रोम के प्राकृतिक वातावरण के साथ अनुरूप होना प्रस्तावित किया गया है और oocyte meiotic परिपक्वता alginate के लिए अकेले की तुलना में सुधार की दर से योगदान दिया.

एफए - IPN प्रणाली एक स्वतंत्र तंत्र द्वारा पार से जोड़ने के प्रत्येक घटक के साथ हल्के और तेजी से जमाना, दर्शाता है. हम 5 कहीं वर्णन किया है कि जेल गठन की गति फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन सांद्रता द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है है . गिरावट की दर aprotinin निषेध आतंच proteolysis के द्वारा समायोजित किया जा सकता है. Murine माध्यमिक रोम आमतौर पर अन्य अब संस्कृति अवधि की आवश्यकता होती प्रजातियों से 8-12 दिन और रोम के लिए सुसंस्कृत हैं. इस प्रकार, aprotinin द्वारा देरी आतंच गिरावट संभवतः अब संस्कृतियों के लिए एक विस्तारित गतिशील माहौल प्रदान कर सके.

वर्णित encapsulation के तरीकों और सूक्ष्म ऊतकों या embryoid निकायों, जिसमें अभी तक सेल सेल से संपर्क बनाए रखा जा सकता है, कुल आंशिक रूप से मैट्रिक्स नीचा कर सकते हैं और विस्तार के लिए एक जगह बनाने के encapsulation और संस्कृति के रूप में अन्य प्रणालियों, के लिए लागू किया जा सकता है. अंत में, एफए IPN encapsulation विधि गतिशील, सेल उत्तरदायी यांत्रिक गुणों और एक नियंत्रणीय गिरावट दर के साथ एक बाँझ hydrogel संस्कृति प्रणाली प्रस्तुत करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम एनआईएच (U54HD41857 और PL1EB008542, p30 Oncofertility कंसोर्टियम रोडमैप अनुदान के भीतर बायोमैटिरियल्स कोर) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetuin Sigma-Aldrich F3385
FBS Invitrogen 10082-139
Aprotinin Roche Group 10236624001
CaCl2 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 039-00475 40 mM
EGF Sigma-Aldrich A412
rFSH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG Sigma-Aldrich CG-5
Hyaluronidase Sigma-Aldrich A1603
ITS Sigma-Aldrich I1884-1VL
L-15 GIBCO, by Life Technologies 11415
αMEM+Gluta MAX GIBCO, by Life Technologies 32561
Pen-Strep Cellgro 30-002-CI
TBS Pierce, Thermo Scientific 28379
Tisseel Fibrin kit Baxter Internationl Inc. 921030
Sodium Alginate FMC BioPolymers LF200DL Mw 418kDa

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References

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Comments

6 Comments

  1. i want the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 4, 2012 - 3:16 AM
  2. Hello! Thank you for your comment. You can find a detailed protocol in the PDF file version of this publication. However, if you are interested in additional specific details you can email me directly at
    a-shikanov@northwestern.edu. Thanks!

    Reply
    Posted by: Ariella S.
    February 5, 2012 - 9:27 AM
  3. hi, where can i find the pdf version? pubmed only shows the video reference. Thanks!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 10, 2012 - 9:41 AM
  4. Hello! You can contact me directly at ariellashikanov@gmail.com and I will be happy to send the protocol. Best,
    Ariella

    Reply
    Posted by: Ariella S.
    April 10, 2012 - 12:43 PM
  5. hello
    please give me information and protocol for using fibrin sealant in embryo transfer in IVF and PRP with fibrin glue for repair cartilage and alginate in embryo transfer in IVF
    thank

    Reply
    Posted by: mahdieh g.
    October 7, 2012 - 6:00 AM
  6. Hi Mahdieh!
    The protocol is published here, so you can download it. If you have any other questions or need some more clarification, please, contact me at ariellashikanov@gmail.com. Thanks!

    Reply
    Posted by: Ariella S.
    October 8, 2012 - 8:47 PM

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