Микрожидкостных устройств с Groove Шаблоны для изучения Сотовая Поведение

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы опишем протокол для изготовления микрожидкостных устройств, которые могут позволить захват клеток и культуры. При таком подходе узорной микроструктур, таких как пазы внутри микрожидкостных каналов используются для создания низкого напряжения сдвига регионов, в которых клетка может дока.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chung, B. G., Manbachi, A., Khademhosseini, A. A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior. J. Vis. Exp. (7), e270, doi:10.3791/270 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мы описываем микрожидкостных устройств с microgrooved моделей для изучения сотовой поведения. Это микрожидкостных платформа состоит из верхней жидкостный канал и нижней microgrooved подложки. Для изготовления microgrooved каналов, топ поли (диметилсилоксана) (PDMS) плесень содержащие впечатление микрожидкостных каналов, был согласован и связан с microgrooved подложки. С помощью этого устройства, клеток фибробластов мыши не могли двигаться и рисунком в microgrooved субстраты (25, 50, 75 и 100 мкм в ширину). Для изучения апоптоза в микрожидкостных устройств, сред, содержащих перекись водорода, Аннексин V, и пропидий иодида перфузии в жидкостный канал на 2 часа. Мы обнаружили, что клетки подвергаются окислительному стрессу стал апоптоза. Эти апоптотических клеток были подтверждены Аннексин V которая привязана к фосфатидилсерина в наружный листок из плазматической мембраны в процессе апоптоза процесса. С помощью этого устройства с микрожидкостных microgrooved узоры, апоптоз процесс наблюдался в режиме реального времени и проанализированы с помощью инвертированного микроскопа, содержащая камеру инкубации (37 ° C, 5% СО 2). Таким образом, этот микрожидкостных устройство, установленное с microgrooved подложки могут быть полезны для изучения клеточного поведения и выполнения высокой пропускной скрининга препаратов.

Protocol

А. микротехнологий из микрожидкостных устройств

  1. 4-дюймовый пластины кремния обрабатывают реактивные кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
  2. Отрицательные фоторезиста (ГУ-8 2015 года, Microchem, MA) является спин-покрытие в 900 оборотов в минуту в течение 1 мин на пластины кремния.
  3. Пластины мягкой запеченный при температуре 95 ° С в течение 6 мин на плиту и подвергается воздействию ультрафиолетового излучения (200 Вт) в течение 4 мин через маску пленку, содержащую микроканалов.
  4. Пластины сообщение запеченный при температуре 95 ° С в течение 6 мин и разработан с использованием SU-8 фоторезиста разработчика.
  5. Фоторезиста узорной пластины содержащей микроканалов помещается в Петри-блюдо.
  6. Поли (диметилсилоксана) (PDMS) (Sylgard 184) формы изготавливаются путем смешивания эластомера силикона и отвердителя (10:1).
  7. Смесь PDMS выливают на плесень мастер Si и находится на вакуумном эксикаторе, чтобы удалить пузырьки.
  8. PDMS отверждается при температуре 70 ° С в течение 1 ~ 2 часа.
  9. PDMS формы, затем снимают с формы мастер Si.

Б. Сборка устройства

  1. 40 мкм верхней жидкостных каналов и 40 мкм толстым дном microgrooved каналы (25, 50, 75 и 100 μ м в ширину) получаются из двух различных мастер формы Si.
  2. Канал входе и выходе устройства жидкостный пробиваются.
  3. Fluidic каналов и каналов микроканавка необратимо связанных с реактивной кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
  4. Внеклеточного матрикса (ECM) (т.е. фибронектин) покрыты внутри микрожидкостных устройств в течение 1 часа в инкубатор (37 ° С).

С. посева клеток и экспериментальной установки

  1. NIH-3T3 фибробластов мыши культивировали в колбе ткань культуры с помощью СМИ Дульбеко изменения Орла (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
  2. Клетки трипсином и диссоциирован.
  3. Расхождение между клетками загружаются в микроканавка каналов на плотность клеток в 3 × 10 6 кл / мл (рис. 1).

    Рисунок 1
    Рисунок 1

  4. 2 мл СМИ, 100 мМ H 2 O 2 и апоптоз анализа (20 мкл Аннексин V и 40 мкл йодида пропидий, Invitrogen, CA), которые вливаются в канал с помощью шприцевой насос (1 мкл / мин).
  5. Клетки в режиме реального времени контролировать с помощью инвертированного микроскопа (Nikon TE 2000).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клетки иммобилизованных и рисунком в microgrooved субстратов в микрожидкостных устройств. Процесс апоптоза клеток воздействию перекиси водорода наблюдалось в реальном времени и проанализированы с помощью Аннексин V и пропидий йодида. Таким образом, это устройство, содержащее микрожидкостных микроканавка каналов может быть полезна для высокопроизводительного скрининга препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent K.R. Anderson Co. 2065622 Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
DMEM medium Invitrogen 11965 Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
FBS serum Invitrogen 10082-147 Fetal Bovine Serum
Hydrogen peroxide Reagent Sigma-Aldrich H1009
Apoptosis assay Invitrogen V13242 Annexin A, propidium iodide
Negative photoresist MicroChem Corp. SU-8 2015
Si wafer Tool 4 inch silicone wafer
Reactive oxygen plasma Reagent Harrick Scientific Products, Inc. treat wafer 5 min at 30W
inverted microscope Tool Nikon Instruments TE 2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
  2. Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
  3. Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics