Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Neuroscience
 

Summary

Мы демонстрируем применение флуоресценции индикатора, TMRM, в корковых нейронов, чтобы определить относительные изменения TMRM интенсивности флуоресценции до и после применения конкретных стимулов. Мы также показываем применения флуоресценции зонда Н

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (51), e2704, doi:10.3791/2704 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Митохондриальная мембранного потенциала (ΔΨm) имеет решающее значение для поддержания физиологических функций дыхательной цепи для генерации АТФ. Значительные потери ΔΨm оказывает клетки обедненного энергии с последующей смерти. Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль сигнальных молекул, но и их накопление в патологических условиях приводит к окислительному стрессу. Два основных источника АФК в клетках являются экологические токсины и процесс окислительного фосфорилирования. Митохондриальной дисфункции и окислительного стресса были замешаны в патофизиологии многих заболеваний, поэтому способность определять ΔΨm и ROS могут предоставить важную информацию о физиологического состояния клетки и функции митохондрий.

Несколько флуоресцентных зондов (родамина 123, TMRM, TMRE, JC-1) может быть использована для определения Δψm в различные типы клеток, и многие флуоресценции показателей (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA), могут быть использованы для определения ROS . Почти все доступные зондов флуоресценции используется для оценки ΔΨm или ROS являются одной длине волны показателей, увеличение или уменьшение их интенсивности флуоресценции пропорциональна стимул, который увеличивает или уменьшает уровни ΔΨm или АФК. Таким образом, крайне важно для измерения интенсивности флуоресценции этих зондов на базовом уровне и после применения конкретных стимулов. Это позволяет определить процент изменения интенсивности флуоресценции от базового уровня и стимул. Это изменение в интенсивности флуоресценции отражает изменение относительных уровней ΔΨm или АФК. В этом видео показано, как применять флуоресценции индикатора, TMRM, у крысы корковых нейронов, чтобы определить процентное изменение TMRM интенсивности флуоресценции от базового уровня, и после применения FCCP, митохондриальная разобщающий агент. Более низкие уровни TMRM флуоресценции в результате лечения FCCP отражает деполяризацию митохондриального потенциала мембраны. Мы также показываем, как применять флуоресценции зонда H 2 DCF-DA оценить уровень АФК в корковых нейронов, во-первых в начале исследования, а затем после применения H 2 O 2. Этот протокол (с незначительными изменениями) может быть также использована для определения изменений в ΔΨm и АФК в различных типах клеток и нейронов, изолированы от других участков мозга.

Protocol

1. Клеточные культуры

  1. Корковые нейроны выделяют и выращивают, используя ранее описанные методы и высевают на культуру блюд с прозрачным дном (Маттек Corporation, Ashland, штат Массачусетс) с покрытием из поли-D-лизина и ламинин 1.

2. Подготовка фондовых решений для флуоресцентных зондов TMRM и Н 2 DCF-DA

  1. Подготовка 10-мм исходного раствора TMRM путем растворения 5,0 мг TMRM в 1 мл безводного диметилсульфоксида. Vortex он в течение 1 мин. Затем, чтобы аликвоты и хранить их при температуре -20 ° C, защищать от света, и использовать в течение одного месяца.
  2. Далее, подготовить 10-мм исходного раствора H 2 DCF-DA, растворив 4,87 мг H 2 DCF-DA в 1 мл безводного ДМСО. Точно так же вихря в течение 1 мин. Затем, чтобы аликвоты и хранить их при температуре -20 ° C, защищать от света, и использовать в течение одной недели.

3. Загрузка корковых нейронов крысы с TMRM и Н 2 DCF-DA

TMRM является потенциометрического, сотовые проницаемой флуоресцентный индикатор, который накапливается в очень отрицательно заряженных интерьера митохондрий. Важно использовать низкие концентрации (10-50 нм) из TMRM, чтобы избежать автоматического тушения митохондриальной TMRM. Затем, сигнал флуоресценции от TMRM могут быть непосредственно совместно, связанных с ΔΨm через внутреннюю мембрану митохондрий. Потеря ΔΨm причины TMRM течь из митохондрий приводит к потере интенсивности флуоресценции. H 2 DCF-DA является клетка-проницаемой зонда преобразуется в DCF-DA внутриклеточными эстераз и его окисление приводит к флуоресцентным DCF. Конечная концентрация H 2 DCF-DA составляет от 2-10 мкм, и это должно быть проверено эмпирически в нейронах, полученных из различных областей мозга, так как высокие концентрации загрузки могут привести к насыщению DCF флуоресценции даже в отсутствие H 2 O 2. Наличие каких-либо эндогенных или экзогенных окислитель (например, оксид азота, перекиси водорода) увеличит DFC интенсивности флуоресценции. Ниже мы приведем протокол для загрузки корковых нейронов крысы с TMRM и Н 2 DCF-DA.

  1. Чтобы загрузить крысы корковых нейронов с TMRM, во-первых, мыть культурный нейронов 3 раза буфером Тирода (наложение текста: TB: 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ глюкозы, 1,5 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2 и 10 мМ HEPES; регулировать рН до 7,4 с NaOH). Затем, подготовить 20 нМ TMRM путем разбавления 10 мМ TMRM складе 1 / 1000 раз в борьбе с туберкулезом, а затем добавляют 2 мкл разведенной TMRM на 1 мл ТБ. Инкубируйте нейронов с TMRM в течение 45 минут в темном месте при комнатной температуре. Через 45 мин, крепление культуры блюдо на столик микроскопа и начать съемки.
  2. Чтобы загрузить корковых нейронов крысы с H 2 DCF-DA, мыть культурный нейронов 3 раза с туберкулезом. Далее, подготовить 2 мкМ H 2 DCF-DA путем разбавления 10 мМ H 2 DCF-DA складе 1 / 10 раз в борьбе с туберкулезом, а затем добавляют 2 мкл разбавленной H 2 DCF-DA на 1 мл ТБ. Затем, инкубировать нейронов с H 2 DCF-DA в течение 45 мин в темноте при комнатной температуре. После 45 минут, смойте нейронов в 4 раза с туберкулезом, чтобы удалить лишнюю флуоресцентного индикатора до получения изображения.

4. Живая изображений нейронов инкубировали с TMRM определить ΔΨm

  1. Для выполнения жить изображений нейронов инкубировали с TMRM, конфокальной микроскопии лазерного сканирования (наложение текста: LSM 510, объективом Carl Zeiss Inc), с применением жить временных рядов программы, используется. Применять с низким разрешением и ослабленных мощности лазера (наложение текста: низкое разрешение: 256 х 256; мощность лазера: 1%), чтобы минимизировать время, необходимое для получения изображения и избежать фотообесцвечивания.
  2. . Далее, настроить фокус установлен нейронов загружены TMRM использовании отраженного света. Изучить TMRM флуоресценции при освещении в 514 нм и обнаружение при 570 нм. Установить обнаружения усиления камеры чуть ниже уровня насыщения.
  3. После того как все параметры, которые включают разрешение, мощность лазера, обнаружение усиления камеры, и покадровой интервал для получения изображения устанавливаются; не изменять эти параметры между экспериментами. Затем измените поле. Начните собирать изображения.
  4. Чтобы проверить изменения в ΔΨm, стимулы, такие как 1 мкМ FCCP или 2 мкг / мл олигомицину, может быть применена, что позволит существенно деполяризовать или hyperpolarize митохондриального мембранного потенциала, соответственно. Эти изменения будут отражены на снижение TMRM интенсивности флуоресценции по сравнению с базовым уровнем интенсивности флуоресценции в случае FCCP, или увеличение TMRM интенсивности флуоресценции в случае олигомицину.

5. Живая изображений нейронов инкубировали с H 2 DCF-DA, чтобы определить ROS

  1. Для выполнения жить изображений нейронов инкубировали с H 2 DCF-DA, во-первых, крепление культуры блюдо на стадии микроскоп. Настройте фокус клетки намиING отраженного света. Изучить DCF флуоресценции при возбуждении на 488 нм и эмиссии при 515 нм.
  2. Далее, регулировать мощность лазера до 5-7%, детектор усиления, и разрешение 256 х 256. Не меняйте эти настройки между экспериментами. Затем установите частоту для получения изображения в реальном времени с помощью программы временных рядов.
  3. Выберите новое поле и начать приобретения изображений. Чтобы обнаружить изменения уровня АФК, лечить клетками с 100-200 мкМ H 2 O 2. Это отразится на увеличении DCF интенсивности флуоресценции по сравнению с исходным уровнем.

6. Анализ данных

  1. Используйте область интереса (наложение текста: ROI) инструмент из LSM программа для выбора областей. Затем, измерьте TMRM или ROS интенсивности флуоресценции. Выберите трансформирования из митохондриальных регионов или трансформирования со всего тела ячейки в отображаемого клетки для измерения интенсивности флуоресценции от TMRM или ROS, соответственно.
  2. Рассчитать средние интенсивности флуоресценции от всех трансформирования каждой ячейки для TMRM или из цельных органов ячейки для всех отображаемого клеток для АФК для каждого момента времени. Выбор регионов рядом с клетками для расчета интенсивности фона флуоресценции. Сделайте несколько измерений и расчета средней интенсивности фона.
  3. Вычтите средней интенсивности флуоресценции фон от средней интенсивности флуоресценции от трансформирования в каждой ячейке для каждой временной точке использованием Microsoft Excel. После вычитания фона интенсивности, нормализуют TMRM или DCF интенсивности флуоресценции с базовым флуоресценции с помощью этой формулы (наложение текста: ΔF = FF о / Р о х 100, где F = интенсивности флуоресценции в любой момент времени, для = базовый флуоресценции). Затем с помощью программы Sigma участок для создания график, показывающий изменения в интенсивности флуоресценции с течением времени.

7. Представитель Результаты

Рисунок 1А показывает флуоресценции изображение крысы корковые нейроны инкубировали с TMRM. Добавление FCCP, митохондриальная разобщающий агент, приводит к митохондриальной деполяризации и потери TMRM интенсивности флуоресценции (рис. 1В). Флуоресценции базовой TMRM уровень остается стабильным перед добавлением FCCP (первые 350 сек;. Рис 1С). Количественный анализ TMRM флуоресценции изменения с течением времени показывает значительное снижение флуоресценции TMRM после добавления FCCP (рис. 1в).

Рис. 1D показывает флуоресценции изображение крысы нейроны коры загружены DCF. Добавление H 2 O 2 приводит к увеличению интенсивности флуоресценции DCF в клеточных тел (рис. 1E). Базовые DCF уровень флуоресценции остается неизменным (первые 120 сек) перед нанесением H 2 O 2. Покадровый измерения флуоресценции DCF показать его устойчивые уровни, которые повышают после H 2 O 2 лечения (рис. 1е).

Рисунок 1
Рисунок 1. Оценка митохондриального мембранного потенциала и уровня АФК в живых крысы корковые нейроны. () Представитель флуоресценции образ нейронов коры загружены TMRM. После сканирования базовой TMRM флуоресценции, нейроны лечили protonophore FCCP (1 мкМ). Справа псевдо-бар интенсивность флуоресценции TMRM с ярко-желтыми и черными представляющих максимальной и минимальной интенсивности, соответственно. Потери флуоресценции TMRM от митохондриальной регионов показывает крах ΔΨm на FCCP лечения (группа В). Количественное представление изменения TMRM интенсивности флуоресценции в различные моменты времени до и после лечения FCCP показан в панели C (D) флуоресценции изображение крысы корковые нейроны загружены H2DCF-DA. После определения базовых DCF флуоресценции, клетки обрабатывали 200 мкМ H 2 O 2, а также изменение флуоресценции DCF был оценен. Увеличение DCF флуоресценции отражает повышение уровня АФК при H 2 O 2 лечения (E). Количественный анализ изменения флуоресценции DCF, до и после H 2 O 2 лечения, показана на панели бар Ф. Масштаб = 10 мкм

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
Живая клетка изображений TMRM в нейроны коры до и после того FCCP использованием 40X цели. Интенсивность псевдо показывает максимум (ярко-желтого, до того FCCP) и снизились (красный цвет, после того FCCP) TMRM интенсивность флуоресценции после того FCCP. Щелкните здесь для просмотра видео

Видео. 7,5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Живая клетка изображений DCF в нейроны коры до и после H 2 O 2 Помимо использования 40X цели. Базовые DCF флуоресценции светло-зеленого цвета в клеточных тел и Н2О2 того увеличивает DCF интенсивности флуоресценции в ярко-зеленый цвет. Щелкните здесь для просмотра видео

Discussion

Мы представили шаг за шагом описывающие процедуры, как определить, ΔΨm и АФК крыс нейроны коры использованием флуоресцентных индикаторов TMRM и Н 2 DCF-DA, соответственно. Для других типов клеток, важно, чтобы эмпирически определить конечную концентрацию и время загрузки для TMRM или H 2 DCF-DA. В общем, TMRM диапазоне концентраций от 20-200 нм, а время клетка инкубации с TMRM колеблется от 20 до 60 мин. Конечная концентрация H 2 DCF-DA составляет от 2-10 мкм, а инкубации клеток в растворе, содержащем загрузку этот показатель колеблется от 30-45 мин.

Очень важно для оптимизации мощности лазера и скорость сканирования взятия изображения, чтобы избежать как фото-токсичности для клеток и изменения в интенсивности флуоресценции (например мерцание TMRM флуоресценции) в отсутствие какого-либо стимула. Оптимизированные оптические параметры должны приводить к флуоресценции, не больше или меньше насыщенных (порог) в отсутствии стимула. Оптимальных условий для сбора изображений из выбранного поля в частности мощности лазера и скорость сканирования достигаются тогда, когда Есть никаких изменений в интенсивности флуоресценции зонда в отсутствие какого-либо стимула в течение 10-15 минут живого изображения.

Другие флуоресценции зондов для определения ΔΨm включают родамина 123 и тетра метил родамина этиловый эфир (TMRE). Тем не менее, они были найдены ингибировать дыхательные процессы в изолированных митохондриях 2. Важно отметить, что TMRM не оказывает влияния на дыхание митохондрий при низких концентрациях 2 и имеет низкую фототоксичности и фотообесцвечивания 3 по сравнению с другими датчиками. H 2 DCF-DA является хорошим показателем для АФК, как он хорошо сохраняется в клетках и распознает несколько видов окислителей, таких как перекиси, супер оксидов и оксида азота 4.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (K22NS050137 к JCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass bottom culture dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
NbActive4 BrainBits NbActive4
TMRM Invitrogen T668
H2DCF-DA Invitrogen C400
NaCl Sigma-Aldrich S6191
KCl Sigma-Aldrich P3911
CaCl2∙2H2O Sigma-Aldrich C3306
MgCl2∙6H2O Sigma-Aldrich M2670
D-Glucose Sigma-Aldrich G6152
HEPES Invitrogen 15630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Comments

15 Comments

  1. I have ² queries:

    1. U ddid not mention washing off of the TMRM containing media before imaging. DŒs that mean that there is TMRM present in the imaging media?

    ². If DCFDA is washed off and imaging being done, upon addition of H²O², how can the DCF fluorescence increase?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 3:02 AM
  2. 1. We did not wash the neurons after TMRM loading. TMRM makes equilibrium between compartments (mitochondria-cytosol- extracellular buffer) in response to negative membrane potentials and a very low concentration of the dye has to be present in the imaging buffer throughout the experiment.
    ². The principle of H²DCF-DA is different as it is cell-permeable probe and trapped into the cytosol once the acetate group is cleaved by intracellular esterases. The access of dye from extracellular medium has to be washed out. Intracellular oxidation of DCF-DA by reactive oxygen species (generated by H²O² addition) results an increased DCF fluorescence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2012 - 12:42 AM
  3. Thanks for the response. However regarding DCFDA, if the dye is washed off, and then H²O² added to increase the ROS inside cells, where is the dye to react with the newly formed ROS? How will the fluorescence increase if there are no more molecules of DCF available for reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 9:42 AM
  4. When we incubate cells with H²DCFDA for an optimal time period, most of the dye molecules are trapped in cytosol and excess of dye has to be washed from extracellular buffer. The cytosolic dye will have enough molecules to produce many fold increase of fluorescence upon oxidation. Due to basal ROS activity some of the dye molecule gets oxidized but not all until cells undergo some stress which causes ROS formation. It is well known that H²O² addition to the cells result intracellular ROS formation and even H²O² itself can diffuse through the cell membrane and oxidize the cytosolic dye to increase the fluorescence.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 3, 2012 - 12:43 AM
  5. Changes in plasma membrane potential will also lead to a decrease in both the mitochondrial and cytosolic TMRM signals, (because there is a step-wise concentration gradient mitochondrial > cytosol > medium). How do you think is the best way distinguish between a loss of signal due to mitochondrial depolarization vs. loss of signal due to plasma membrane depolarization?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 9:28 PM
  6. A previous lab member has used KCl in the media to keep the plasma membrane potential constant so that changes in TMRM fluorescence are reflective of changes in mitochondrial potential only rather than a combination of both.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 1:57 AM
  7. In non- quenched method (1 to 50nM, should be optimized for a particular cell type) majority of the TMRM fluorescence arise from mitochondria and any change in TMRM fluorescence (either single mitochondrion or entire cell) can be directly correlated to polarized state of mitochondria. Alternately the ratio of TMRM fluorescence from mitochondrial and non-mitochondrial regions in cell can be normalized to ratio of TMRM fluorescence at baseline and after FCCP addition. A parallel control experiment to monitor the TMRM fluorescence under plasma membrane depolarization (such as in presence of 30mM KCl) also can be performed.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 7, 2012 - 12:50 PM
  8. For the DCFDA experiments, is the use of verapamil advisable to inhibit the efflux of DCF from cells?

    Can both TMRM and DCFDA be used at the same time or will one affect the read-out of the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 2:31 AM
  9. We never tried using verapamil in our experiments but there are reports using this drug in DCFDA experiments.
    Yes TMRM and DCFDA can be used at the same time to monitor ROS formation and mitochondrial membrane potential.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 11, 2012 - 1:30 AM
  10. Hi, I am curious how stable the preparation is in order to measure membrane potential. We have a 4 h protocol applied to cells in culture and at the end of this treatment we'd like to assess the membrane potential. Would you recommend loading TMRM before or after the 4 h procedure? I am afraid the membrane potential might change during the 45 min incubation. Therefore, it seems better to load TMRM before perhaps.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 16, 2012 - 11:37 PM
  11. TMRM incubation time varies from one cell type to another. However, once the equilibrium is reached, TMRM fluorescence remains quite stable for long time. You can try loading TMRM before treatment and keep a parallel control loading without any treatment to rule out the change in TMRM fluorescence due to artifacts.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 17, 2012 - 11:54 PM
  12. Thanks. Another question is whether you can easily convert the fluoresce intensity ratio to absolute membrane voltage.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 24, 2012 - 2:22 PM
  13. We can not convert the TMRM fluorescence into absolute membrane voltage. The difference in TMRM fluorescence intensity is always a relative change between the experimental groups.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 24, 2012 - 11:13 PM
  14. But I still have some queries . In your article only described the determination of mitochondrial membrane potential and oxygen species in primary cortical neurons, my query is if I want to know the relationship of my target drug and its concentration to the result , how should I go on my study? Which step should I give my compound to the cell? How can I determine the appropriate concentration? I really appreciate you can give me some advice. I am looking forward for your reply. Wish you have a nice day. Many thinks~

    Reply
    Posted by: longjun z.
    February 25, 2013 - 9:40 PM
  15. First, you will have to optimize the dye as well as the drug concentration in the cells independently. I would suggest optimizing the dye loading conditions first, then do dose dependent changes in the fluorescence of either TMRM or DCF to get an optimal drug concentration to start with. Once you have the optimized conditions, you can measure the ROS and membrane potential in two ways. 1. Incubate the cells with the probe; image them before and after the addition of drug. ². You can incubate the cells with drug and then load the cells with probe to monitor the effect of your drug. If longer incubation of drug is required, second method is preferred. Both the methods are well documented in the literature.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    February 28, 2013 - 1:23 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics