Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Neuroscience
 

Summary

Tonen we de toepassing van de fluorescentie-indicator, TMRM, in corticale neuronen van de relatieve veranderingen in TMRM fluorescentie-intensiteit te bepalen voor en na toepassing van een specifieke stimulus. We tonen ook de toepassing van de fluorescentie sonde H

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (51), e2704, doi:10.3791/2704 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mitochondriale membraan potentiaal (ΔΨm) is van cruciaal belang voor het behoud van de fysiologische functie van de luchtwegen keten ATP te genereren. Een significant verlies van ΔΨm maakt cellen uitgeput van energie met daaropvolgende dood. Reactive oxygen species (ROS) zijn belangrijke signaalmoleculen, maar hun accumulatie in pathologische condities leidt tot oxidatieve stress. De twee belangrijkste bronnen van ROS in de cellen zijn milieu-toxines en het proces van oxidatieve fosforylering. Mitochondriale dysfunctie en oxidatieve stress zijn betrokken in de pathofysiologie van vele ziekten, daarom de mogelijkheid om ΔΨm en ROS te bepalen kan belangrijke aanwijzingen over de fysiologische status van de cel en de functie van de mitochondriën.

Verschillende fluorescerende probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) kan gebruikt worden om te bepalen Δψm in een verscheidenheid van celtypes, en vele fluorescentie-indicatoren (Dihydroethidium, dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) kan worden gebruikt om de ROS te bepalen . Bijna alle van de beschikbare fluorescentie probes gebruikt om ΔΨm of ROS te beoordelen zijn single-golflengte indicatoren, die verhogen of verlagen van hun fluorescentie-intensiteit evenredig is aan een stimulus die verhoogt of verlaagt het niveau van ΔΨm of ROS. Zo is het noodzakelijk om de fluorescentie-intensiteit van deze probes te meten op het basisniveau en na de toepassing van een specifieke stimulus. Dit maakt het mogelijk om vast te stellen het percentage van de verandering in de fluorescentie-intensiteit tussen het basisniveau en een stimulans. Deze verandering in de fluorescentie-intensiteit weerspiegelt de verandering in de relatieve niveaus van ΔΨm of ROS. In deze video laten we zien hoe de fluorescentie-indicator, TMRM, toe te passen in de rat corticale neuronen aan de procentuele verandering in TMRM fluorescentie-intensiteit tussen de baseline-niveau en na het toepassen van FCCP, een mitochondriale ontkoppelrail te bepalen. De lagere niveaus van TMRM fluorescentie als gevolg van FCCP behandeling afspiegeling van de depolarisatie van de mitochondriale membraanpotentiaal. We hebben ook laten zien hoe je de fluorescentie sonde H 2 DCF-DA van toepassing zijn op het niveau van de ROS in corticale neuronen, eerst bij aanvang vervolgens beoordelen en na toepassing van H 2 O 2. Dit protocol (met kleine wijzigingen) kan ook worden gebruikt om veranderingen in ΔΨm en ROS in verschillende celtypes en in neuronen geïsoleerd van andere hersengebieden te bepalen.

Protocol

1. Celcultuur

  1. Corticale neuronen worden geïsoleerd en gekweekt met behulp van eerder beschreven technieken en uitgeplaat op de cultuur gerechten met een glazen bodem (MatTek Corporation, Ashland, MA) bekleed met poly-D-lysine en laminine 1.

2. De voorbereiding van de voorraad-oplossingen voor de fluorescerende probes TMRM en H 2 DCF-DA

  1. Bereid een 10-mM voorraad oplossing van TMRM door het oplossen van 5,0 mg TMRM in 1 ml watervrij dimethylsulfoxide. Vortex het voor 1 minuut. Maak dan aliquots en bewaar ze bij -20 ° C, beschermen tegen licht, en het gebruik binnen een maand.
  2. Vervolgens bereiden een 10-mM voorraad oplossing van H 2 DCF-DA door het oplossen van 4,87 mg van H 2 DCF-DA in 1 ml watervrij DMSO. Ook vortex het voor 1 minuut. Maak dan aliquots en bewaar ze bij -20 ° C, beschermen tegen licht en gebruik binnen een week.

3. Het laden van rat corticale neuronen met TMRM en H 2 DCF-DA

TMRM is een potentiometrische, cel-permeabele fluorescentie-indicator, dat zich ophoopt in de sterk negatief geladen interieur van mitochondriën. Het is belangrijk om de lage concentraties (10-50 nM bereik) van TMRM te gebruiken om auto-quenching van de mitochondriale TMRM te voorkomen. Vervolgens kan de fluorescentie-signaal van TMRM direct verband houden met co-ΔΨm over het binnenste mitochondriale membraan. Een verlies van ΔΨm oorzaken TMRM lekken van mitochondriën leidt tot een verlies van fluorescentie-intensiteit. H 2 DCF-DA is cel-permeabele sonde omgezet in DCF-DA door intracellulaire esterasen, en de oxidatie leidt tot fluorescerende DCF. De uiteindelijke concentratie van H 2 DCF-DA varieert tussen 20 tot 10 uM en het moet empirisch worden getest in neuronen uit verschillende gebieden van de hersenen omdat hoge concentraties van het laden kan resulteren in de verzadiging van de DCF-fluorescentie, zelfs in de afwezigheid van H 2 O 2. De aanwezigheid van een endogene of exogene oxidant (zoals stikstofoxide, waterstof peroxide) zal toenemen DFC fluorescentie-intensiteit. Hieronder geven we een protocol voor het laden van rat corticale neuronen met TMRM en H 2 DCF-DA.

  1. Voor het laden van de rat corticale neuronen met TMRM de eerste plaats was de gekweekte neuronen drie keer met buffer Tyrode's (Text Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl 2, en 10 mM HEPES, de pH instellen op 7,4 met NaOH). Dan, bereiden 20 nM van TMRM door verdunning van de 10 mM TMRM voorraad 1 / 1000 keer in TB en voeg dan 2 pi van de verwaterde TMRM per 1 ml van de TB. Incubeer de neuronen met TMRM gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Na 45 min, monteren de cultuur schotel op het podium van de microscoop en begin beeldvorming.
  2. Voor het laden van de rat corticale neuronen met H 2 DCF-DA, was de gekweekte neuronen drie keer met TB. Vervolgens bereiden 2 uM van H 2 DCF-DA door verdunning van de 10 mm H 2 DCF-DA voorraad 1 / 10 keer in TB en voeg dan 2 pl verdund H 2 DCF-DA per 1 ml van de TB. Dan, incubeer de neuronen met H 2 DCF-DA voor 45 min in donker bij kamertemperatuur. Na 45 minuten, was de neuronen vier keer met TB om het overtollige fluorescentie-indicator te verwijderen voordat u om beelden te verkrijgen.

4. Live-beeldvorming van neuronen geïncubeerd met TMRM om te bepalen ΔΨm

  1. Voor het uitvoeren van live-beelden van de neuronen geïncubeerd met TMRM, confocale laser scanning microscopie (Text Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc), met de toepassing van de live-tijd-serie programma, wordt gebruikt. Toe te passen met een lage resolutie en verzwakt laservermogen (Text Overlay: lage resolutie: 256 x 256; laservermogen: 1%) om de tijd die nodig is om beelden te verkrijgen en om te voorkomen dat fotobleking te minimaliseren.
  2. . Pas vervolgens de focus van de gemonteerde neuronen geladen met TMRM met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de TMRM fluorescentie door belichting bij 514 nm en detectie bij 570 nm. Stel de detectie te krijgen van een camera net onder het verzadigingsniveau.
  3. Zodra alle parameters die resolutie, laservermogen, detectie te krijgen van een camera, en time-lapse-interval zijn te verkrijgen beelden zijn vast te stellen; niet veranderen deze instellingen tussen de experimenten. Vervolgens verandert het veld. Beginnen met het verzamelen beelden.
  4. Voor het testen van veranderingen in de ΔΨm, kan stimuli zoals een uM van FCCP of 2 ug / ml van oligomycin, worden toegepast, die aanzienlijk zal depolariseren of hyperpolarize de mitochondriale membraanpotentiaal respectievelijk. Deze wijzigingen zullen worden weerspiegeld door een afname in TMRM fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de baseline fluorescentie-intensiteit in het geval van FCCP, of een toename in TMRM fluorescentie-intensiteit in het geval van oligomycin.

5. Live-beeldvorming van neuronen geïncubeerd met H 2 DCF-DA naar ROS te bepalen

  1. Voor het uitvoeren van live-beelden van de neuronen geïncubeerd met H 2 DCF-DA in de eerste, mount de cultuur schotel op het podium van een microscoop. Pas de scherpstelling van de cellen onsING gereflecteerde licht. Onderzoek DCF fluorescentie door excitatie bij 488 nm en emissie bij 515 nm.
  2. Daarna pas het laservermogen tot 5-7%, detector te krijgen, en de resolutie van 256 x 256. Niet wijzigen van deze instellingen tussen de experimenten. Stel vervolgens de frequentie voor het verkrijgen van live-beelden met behulp van de tijdreeks programma.
  3. Selecteer een nieuw veld en start het verwerven van beelden. Voor het detecteren van veranderingen in de ROS levels, te behandelen cellen met 100 tot 200 uM van H 2 O 2. Dit wordt weergegeven door een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van baseline-niveau.

6. Data-analyse

  1. Gebruik region of interest (Text Overlay: ROI) gereedschap uit de LSM-programma om de gebieden te selecteren. Dan, het meten van de TMRM of ROS fluorescentie-intensiteiten. Selecteer de ROI van mitochondriaal regio's of ROI's uit de hele cel lichaam in beeld gebracht cellen om de fluorescentie-intensiteit van TMRM of ROS, respectievelijk te meten.
  2. Bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van alle ROI van elke cel voor TMRM of van whole cell instanties voor alle belichte cellen voor ROS voor elk tijdstip. Selecteer de regio naast de cellen naar de achtergrond fluorescentie-intensiteit te berekenen. Enkele metingen uit en bereken het gemiddelde achtergrond intensiteit.
  3. Trek de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de ROI in elke cel van elk tijdstip met behulp van Microsoft Excel. Na aftrek van achtergrond intensiteit, normaliseren de TMRM of DCF fluorescentie-intensiteit van de baseline fluorescentie met deze formule (Text Overlay: AF = FF o / F o x 100, waarbij F = fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip, Voor = baseline fluorescentie). Gebruik dan de Sigma Plot programma om het perceel waarop de veranderingen in fluorescentie-intensiteit in de tijd te genereren.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1A toont een beeld van de fluorescentie rat corticale neuronen geïncubeerd met TMRM. Toevoeging van FCCP, een mitochondriale ontkoppelrail, leidt tot mitochondriale depolarisatie en een verlies van TMRM fluorescentie-intensiteit (Fig. 1B). De baseline TMRM fluorescentie niveau blijft stabiel voor toevoeging van FCCP (de eerste 350 seconden;. Figuur 1C). Kwantitatieve analyse van TMRM fluorescentie verandert in de tijd toont een significante afname in TMRM fluorescentie na toevoeging van FCCP (Fig. 1C).

Figuur 1D toont de fluorescentie beeld van de rat corticale neuronen geladen met DCF. Toevoeging van H 2 O 2 resulteert in een verhoogde DCF fluorescentie-intensiteit in cel organen (fig. 1E). De baseline DCF fluorescentie niveau is ongewijzigd (de eerste 120 sec) vóór de toepassing van H 2 O 2. Time-lapse metingen van DCF fluorescentie geven aan haar vaste niveaus, die toenemen na H 2 O 2 behandeling (fig. 1F).

Figuur 1
Figuur 1. Beoordeling van de mitochondriale membraanpotentiaal en ROS levels in levende rat corticale neuronen. (A) Vertegenwoordiger fluorescentie beeld van de corticale neuronen geladen met TMRM. Na het scannen van de baseline TMRM fluorescentie, werden behandeld met de neuronen protonophore FCCP (1 uM). Aan de rechterkant is een pseudokleur intensiteit bar van TMRM fluorescentie met fel geel en zwart die maximum en minimum intensiteit, respectievelijk. Het verlies van TMRM fluorescentie van de mitochondriale regio's geeft de ineenstorting van ΔΨm op FCCP behandeling (panel B). De kwantitatieve vertegenwoordiging van verandering in TMRM fluorescentie-intensiteit op verschillende tijdstippen voor en na FCCP behandeling wordt getoond in paneel C. (D) Fluorescentie beeld van de rat corticale neuronen geladen met H2DCF-DA. Na het bepalen van de baseline DCF fluorescentie, werden de cellen behandeld met 200 uM H 2 O 2, en de verandering in de DCF fluorescentie werd beoordeeld. Een toename van de DCF fluorescentie weerspiegelt de toename van de ROS levels bij H 2 O 2 behandeling (E). Kwantitatieve analyse van verandering in de DCF fluorescentie, voor en na de H 2 O 2 de behandeling, wordt weergegeven in paneel F. Schaal bar = 10 urn

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
Live-cell imaging van TMRM in corticale neuronen voor en na FCCP Naast het gebruik van 40X doelstelling. De pseudocolor intensiteit toont een maximum (fel geel, voor FCCP toevoeging) en verminderde (rode kleur, na FCCP toevoeging) TMRM fluorescentie-intensiteit na FCCP toevoeging. Klik hier om de video te bekijken

Video. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Live-cell imaging van de DCF in corticale neuronen voor en na H 2 O 2 Naast het gebruik van 40X doelstelling. De baseline DCF fluorescentie heeft lichtgroene kleur in cel organen en H2O2 Daarnaast verhoogt de DCF fluorescentie-intensiteit te felle groene kleur. Klik hier om video te bekijken

Discussion

We hebben gepresenteerd een stap-voor-stap procedure beschrijft hoe u ΔΨm en ROS bepalen rat corticale neuronen met behulp van de TL-indicatoren TMRM en H 2 DCF-DA, respectievelijk. Voor andere celtypen, is het belangrijk om empirisch vast te stellen is de uiteindelijke concentratie en laden tijd voor TMRM of H 2 DCF-DA. In het algemeen, TMRM concentraties range 20 tot 200 nM, en de cel incubatie tijd met TMRM varieert van 20 tot 60 minuten. De uiteindelijke concentratie van H 2 DCF-DA varieert 2-10 uM, en incubatie van cellen in een laad-oplossing die deze indicator varieert van 30-45 min..

Het is belangrijk om het optimaliseren van de laser kracht en de scansnelheid van het nemen van de beelden, zowel voor foto-toxiciteit te vermijden om de cellen en veranderingen in de fluorescentie-intensiteit (bijvoorbeeld flikkeren van TMRM fluorescentie) in het ontbreken van een stimulus. De geoptimaliseerde optische instellingen moeten resulteren in een fluorescentie-signaal dat is niet meer of minder verzadigd (drempel) in de afwezigheid van de stimulus. De optimale voorwaarden om de beelden te verzamelen van een geselecteerd veld op een bepaalde laservermogen en een scansnelheid worden bereikt als er geen veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de sonde in het ontbreken van een stimulans voor 10-15 minuten van de live imaging.

Andere fluorescentie probes aan ΔΨm bepalen onder meer rhodamine 123 en tetra-methyl-rhodamine ethylester (TMRE). Ze werden echter gevonden om de respiratoire processen in geïsoleerde mitochondria 2 remmen. Belangrijk is dat TMRM heeft geen effect op de mitochondriale ademhaling bij lage concentraties 2 en heeft een lage fototoxiciteit en fotobleking 3 in vergelijking met andere sondes. H 2 DCF-DA is een goede indicator voor de ROS als het is goed bewaard in de cellen en herkent verschillende oxidant soorten, zoals peroxiden, super oxiden, en stikstofoxide 4.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (K22NS050137 naar JCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass bottom culture dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
NbActive4 BrainBits NbActive4
TMRM Invitrogen T668
H2DCF-DA Invitrogen C400
NaCl Sigma-Aldrich S6191
KCl Sigma-Aldrich P3911
CaCl2∙2H2O Sigma-Aldrich C3306
MgCl2∙6H2O Sigma-Aldrich M2670
D-Glucose Sigma-Aldrich G6152
HEPES Invitrogen 15630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Comments

15 Comments

  1. I have ² queries:

    1. U ddid not mention washing off of the TMRM containing media before imaging. DŒs that mean that there is TMRM present in the imaging media?

    ². If DCFDA is washed off and imaging being done, upon addition of H²O², how can the DCF fluorescence increase?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 3:02 AM
  2. 1. We did not wash the neurons after TMRM loading. TMRM makes equilibrium between compartments (mitochondria-cytosol- extracellular buffer) in response to negative membrane potentials and a very low concentration of the dye has to be present in the imaging buffer throughout the experiment.
    ². The principle of H²DCF-DA is different as it is cell-permeable probe and trapped into the cytosol once the acetate group is cleaved by intracellular esterases. The access of dye from extracellular medium has to be washed out. Intracellular oxidation of DCF-DA by reactive oxygen species (generated by H²O² addition) results an increased DCF fluorescence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2012 - 12:42 AM
  3. Thanks for the response. However regarding DCFDA, if the dye is washed off, and then H²O² added to increase the ROS inside cells, where is the dye to react with the newly formed ROS? How will the fluorescence increase if there are no more molecules of DCF available for reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 9:42 AM
  4. When we incubate cells with H²DCFDA for an optimal time period, most of the dye molecules are trapped in cytosol and excess of dye has to be washed from extracellular buffer. The cytosolic dye will have enough molecules to produce many fold increase of fluorescence upon oxidation. Due to basal ROS activity some of the dye molecule gets oxidized but not all until cells undergo some stress which causes ROS formation. It is well known that H²O² addition to the cells result intracellular ROS formation and even H²O² itself can diffuse through the cell membrane and oxidize the cytosolic dye to increase the fluorescence.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 3, 2012 - 12:43 AM
  5. Changes in plasma membrane potential will also lead to a decrease in both the mitochondrial and cytosolic TMRM signals, (because there is a step-wise concentration gradient mitochondrial > cytosol > medium). How do you think is the best way distinguish between a loss of signal due to mitochondrial depolarization vs. loss of signal due to plasma membrane depolarization?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 9:28 PM
  6. A previous lab member has used KCl in the media to keep the plasma membrane potential constant so that changes in TMRM fluorescence are reflective of changes in mitochondrial potential only rather than a combination of both.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 1:57 AM
  7. In non- quenched method (1 to 50nM, should be optimized for a particular cell type) majority of the TMRM fluorescence arise from mitochondria and any change in TMRM fluorescence (either single mitochondrion or entire cell) can be directly correlated to polarized state of mitochondria. Alternately the ratio of TMRM fluorescence from mitochondrial and non-mitochondrial regions in cell can be normalized to ratio of TMRM fluorescence at baseline and after FCCP addition. A parallel control experiment to monitor the TMRM fluorescence under plasma membrane depolarization (such as in presence of 30mM KCl) also can be performed.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 7, 2012 - 12:50 PM
  8. For the DCFDA experiments, is the use of verapamil advisable to inhibit the efflux of DCF from cells?

    Can both TMRM and DCFDA be used at the same time or will one affect the read-out of the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 2:31 AM
  9. We never tried using verapamil in our experiments but there are reports using this drug in DCFDA experiments.
    Yes TMRM and DCFDA can be used at the same time to monitor ROS formation and mitochondrial membrane potential.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 11, 2012 - 1:30 AM
  10. Hi, I am curious how stable the preparation is in order to measure membrane potential. We have a 4 h protocol applied to cells in culture and at the end of this treatment we'd like to assess the membrane potential. Would you recommend loading TMRM before or after the 4 h procedure? I am afraid the membrane potential might change during the 45 min incubation. Therefore, it seems better to load TMRM before perhaps.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 16, 2012 - 11:37 PM
  11. TMRM incubation time varies from one cell type to another. However, once the equilibrium is reached, TMRM fluorescence remains quite stable for long time. You can try loading TMRM before treatment and keep a parallel control loading without any treatment to rule out the change in TMRM fluorescence due to artifacts.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 17, 2012 - 11:54 PM
  12. Thanks. Another question is whether you can easily convert the fluoresce intensity ratio to absolute membrane voltage.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 24, 2012 - 2:22 PM
  13. We can not convert the TMRM fluorescence into absolute membrane voltage. The difference in TMRM fluorescence intensity is always a relative change between the experimental groups.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 24, 2012 - 11:13 PM
  14. But I still have some queries . In your article only described the determination of mitochondrial membrane potential and oxygen species in primary cortical neurons, my query is if I want to know the relationship of my target drug and its concentration to the result , how should I go on my study? Which step should I give my compound to the cell? How can I determine the appropriate concentration? I really appreciate you can give me some advice. I am looking forward for your reply. Wish you have a nice day. Many thinks~

    Reply
    Posted by: longjun z.
    February 25, 2013 - 9:40 PM
  15. First, you will have to optimize the dye as well as the drug concentration in the cells independently. I would suggest optimizing the dye loading conditions first, then do dose dependent changes in the fluorescence of either TMRM or DCF to get an optimal drug concentration to start with. Once you have the optimized conditions, you can measure the ROS and membrane potential in two ways. 1. Incubate the cells with the probe; image them before and after the addition of drug. ². You can incubate the cells with drug and then load the cells with probe to monitor the effect of your drug. If longer incubation of drug is required, second method is preferred. Both the methods are well documented in the literature.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    February 28, 2013 - 1:23 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics