Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Neuroscience
 

Summary

Wir demonstrieren die Anwendung der Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in kortikalen Neuronen, die relativen Veränderungen in TMRM Fluoreszenzintensität vor und nach der Anwendung eines bestimmten Stimulus zu bestimmen. Wir zeigen auch die Anwendung der Fluoreszenz-Sonde H

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Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (51), e2704, doi:10.3791/2704 (2011).

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Abstract

Mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktion der Atmungskette zur ATP zu generieren. Ein signifikanter Verlust von ΔΨm macht Zellen von Energie mit anschließender Tod erschöpft. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind wichtige Signalmoleküle, aber ihre Häufung in pathologischen Zuständen führt zu oxidativem Stress. Die beiden wichtigsten Quellen von ROS in der Zelle sind Umweltgifte und den Prozess der oxidativen Phosphorylierung. Mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress in der Pathophysiologie vieler Krankheiten in Verbindung gebracht, daher die Fähigkeit, ΔΨm und ROS bestimmen kann wichtige Hinweise über die physiologischen Zustand der Zelle und die Funktion der Mitochondrien liefern.

Mehrere Fluoreszenzsonden (Rhodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) kann verwendet werden, um Δψm in einer Vielzahl von Zelltypen zu bestimmen, und viele Fluoreszenz-Indikatoren (Dihydroethidium, Dihydrorhodamin 123, H 2 DCF-DA) kann verwendet werden, um ROS bestimmen . Fast alle der verfügbaren Fluoreszenz-Sonden verwendet werden, um ΔΨm oder ROS beurteilen einzigen Wellenlänge Indikatoren, die erhöhen oder verringern ihre Fluoreszenzintensität proportional auf einen Stimulus, erhöht oder verringert die Höhe der ΔΨm oder ROS. So ist es unerlässlich, die Fluoreszenz-Intensität dieser Sonden an der Grundlinie auf und nach der Anwendung eines spezifischen Reiz zu messen. Dies erlaubt es, den Prozentsatz der Änderung in der Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie Ebene und einen Stimulus zu bestimmen. Diese Änderung in der Fluoreszenz-Intensität spiegelt die Veränderung der relativen Werte von ΔΨm oder ROS. In diesem Video zeigen wir, wie die Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in Ratte kortikalen Neuronen beziehen sich auf die prozentuale Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie auf und nach der Anwendung FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler zu bestimmen. Die unteren Ebenen der TMRM Fluoreszenz aus FCCP Behandlung spiegeln die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials. Wir zeigen auch, wie die Fluoreszenz-Sonde H 2 DCF-DA beziehen sich auf die Ebene von ROS in kortikalen Neuronen, zuerst an der Basislinie zu beurteilen und dann nach der Anwendung von H 2 O 2. Dieses Protokoll (mit kleinen Änderungen) kann auch verwendet werden, um Änderungen in ΔΨm und ROS in verschiedenen Zelltypen und in Neuronen von anderen Hirnregionen isoliert zu bestimmen.

Protocol

1. Zellkultur

  1. Kortikalen Neuronen isoliert und gezüchtet Verwendung der vorher beschriebenen Techniken und plattiert auf Kulturschalen mit Glasboden (MatTek Corporation, Ashland, MA) mit Poly-D-Lysin und Laminin 1 beschichtet.

2. Vorbereitung der Stammlösungen für die fluoreszierenden Sonden TMRM und H 2 DCF-DA

  1. Bereiten Sie eine 10-mM Stammlösung von TMRM durch Auflösen von 5,0 mg TMRM in 1 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid. Vortex es für 1 min. Dann machen Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C, vor Licht schützen, und innerhalb von 1 Monat.
  2. Als nächstes bereiten ein 10-mM Stammlösung von H 2 DCF-DA durch Auflösen von 4,87 mg H 2 DCF-DA in 1 ml wasserfreiem DMSO. Ebenso Vortex es für 1 min. Dann machen Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C, vor Licht schützen, und innerhalb von einer Woche.

3. Loading Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2 DCF-DA

TMRM ist eine potentiometrische, zellpermeablen fluoreszierenden Indikator dafür, dass in der stark negativ geladenen Inneren der Mitochondrien akkumuliert. Es ist wichtig, die geringen Konzentrationen (10-50 nM-Bereich) von TMRM nutzen, um auto-Abschrecken der mitochondrialen TMRM zu vermeiden. Dann kann das Fluoreszenzsignal TMRM direkt Zusammenarbeit im Zusammenhang mit ΔΨm über die innere Membran der Mitochondrien. Ein Verlust von ΔΨm Ursachen TMRM von Mitochondrien, woraus ein Verlust der Fluoreszenzintensität auslaufen. H 2 DCF-DA ist zellpermeablen Sonde in DCF-DA durch intrazelluläre Esterasen umgewandelt, und die Oxidation führt in fluoreszierenden DCF. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA liegt zwischen 2-10 um und es sollte empirisch in Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen abgeleitet getestet werden, da hohe Belastung Konzentrationen in der Sättigung des DCF-Fluoreszenz auch in Abwesenheit von H 2 O 2 entstehen könnten. Das Vorhandensein einer endogenen oder exogenen Oxidationsmittel (z. B. Stickstoffmonoxid, Wasserstoffperoxid) erhöht DFC Fluoreszenzintensität. Nachfolgend stellen wir ein Protokoll für die Be-Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2 DCF-DA.

  1. Zum Laden der Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM zunächst, waschen Sie die kultivierten Neuronen 3-mal mit Tyrode-Puffer (Text-Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukose, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES; pH-Wert auf 7,4 mit NaOH). Dann bereiten 20 nM von TMRM durch Verdünnen der 10 mM TMRM Lager 1 / 1000 mal in TB und fügen Sie dann 2 ul verdünnt TMRM pro 1 ml TB. Inkubieren Sie die Neuronen mit TMRM für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 45 min, montieren Sie die Kulturschale auf der Bühne des Mikroskops und starten Bildgebung.
  2. Zum Laden der Ratte kortikalen Neuronen mit H 2 DCF-DA, waschen Sie die kultivierten Neuronen 3-mal mit TB. Als nächstes bereiten 2 uM von H 2 DCF-DA durch Verdünnen der 10 mM H 2 DCF-DA Lager 1 / 10 mal in TB und fügen Sie dann 2 ul der verdünnten H 2 DCF-DA pro 1 ml TB. Dann inkubieren die Neuronen mit H 2 DCF-DA für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 45 min, waschen Sie die Neuronen 4 mal mit TB, um überschüssige Fluoreszenzindikator vor Gewinnung von Bildern zu entfernen.

4. Live-Darstellung von Neuronen mit TMRM inkubiert, um ΔΨm bestimmen

  1. So führen Sie Live-Aufnahmen von Neuronen mit TMRM, konfokale Laser Scanning Mikroskopie (Text-Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc.) inkubiert, mit der Anwendung von Live-Time-Serie Programm verwendet wird. Bewerben mit niedriger Auflösung und gedämpft Laserleistung (Text-Overlay: niedrige Auflösung: 256 x 256; Laserleistung: 1%), um die benötigte Zeit, um Bilder zu erhalten und zu vermeiden, Bleichen zu minimieren.
  2. . Als nächstes stellen Sie den Fokus des montierten Neuronen mit TMRM geladen mit reflektiertem Licht. Untersuchen Sie die TMRM Fluoreszenz-Beleuchtung bei 514 nm und Detektion bei 570 nm. Stellen Sie die Erkennung Gewinn von einer Kamera direkt unterhalb der Sättigung.
  3. Wenn alle Parameter, die Auflösung, Laserleistung, Erkennung Gewinn von einer Kamera, und Zeitraffer-Intervall gehören zu erlangen Bilder gesetzt werden; nicht ändern diese Einstellungen zwischen den Experimenten. Als nächstes ändern Sie das Feld. Starten Sammeln von Bildern.
  4. Um zu testen, Änderungen in ΔΨm, können Reize wie 1 uM FCCP oder 2 pg / ml Oligomycin, angewandt werden, die deutlich depolarisieren oder hyperpolarisieren des mitochondrialen Membranpotentials, bzw.. Diese Veränderungen werden durch einen Rückgang in TMRM Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangswert Fluoreszenzintensität bei FCCP, oder eine Erhöhung der TMRM Fluoreszenzintensität bei Oligomycin reflektiert werden.

5. Live-Darstellung von Neuronen mit H 2 DCF-DA inkubiert, um festzustellen, ROS

  1. So führen Sie Live-Aufnahmen von Neuronen mit H 2 DCF-DA zunächst inkubiert, montieren Sie die Kulturschale auf der Bühne eines Mikroskops. Stellen Sie den Fokus der Zellen unsIng. reflektierte Licht. Untersuchen DCF-Fluoreszenz durch Anregung bei 488 nm und Emission bei 515 nm.
  2. Als nächstes stellen Sie die Laserleistung auf 5-7%, Detektor zu gewinnen, und die Auflösung von 256 x 256. Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten. Dann legen Sie die Frequenz für den Erhalt von Live-Bildern mit der Zeitreihen-Programm.
  3. Wählen Sie ein neues Feld und beginnen Erfassen von Bildern. Um Veränderungen in ROS Ebenen zu behandeln Zellen mit 100-200 um H 2 O 2. Dies wird durch einen Anstieg der DCF-Fluoreszenz-Intensität im Vergleich zum Ausgangswert Ebene reflektiert werden.

6. Datenanalyse

  1. Verwenden region of interest (Text-Overlay: ROI)-Tool aus dem LSM-Programm, um die Bereiche auszuwählen. Dann messen Sie die TMRM oder ROS Fluoreszenzintensitäten. Wählen Sie ROIs von mitochondrialen Regionen oder ROIs aus dem gesamten Zellkörper in abgebildet Zellen, die Fluoreszenz-Intensitäten der TMRM oder ROS bzw. zu messen.
  2. Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz-Intensitäten von allen ROIs jeder Zelle für TMRM oder aus ganzen Zellkörper für alle abzubildenden Zellen für ROS für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Regionen neben den Zellen, die Hintergrund-Fluoreszenz-Intensität zu berechnen. Nehmen Sie mehrere Messungen und Berechnung der durchschnittlichen Hintergrund Intensität.
  3. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität von durchschnittlich Fluoreszenzintensitäten ROIs in jeder Zelle für jeden Zeitpunkt mit Microsoft Excel. Nach Abzug Hintergrund Intensität, normalisieren die TMRM oder DCF-Fluoreszenz-Intensität auf die Grundlinie Fluoreszenz mit dieser Formel (Text-Overlay: AF = FF o / F o x 100, wobei F = Fluoreszenz-Intensität zu jedem Zeitpunkt, Fo = baseline Fluoreszenz). Verwenden Sie dann die Sigma Plot Programm, um die grafische Darstellung der Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität im Laufe der Zeit zu generieren.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt ein Fluoreszenz-Bild der Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM inkubiert. Die Zugabe von FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler, führt zu mitochondrialen Depolarisation und einen Verlust von TMRM Fluoreszenzintensität (Abb. 1B). Die Baseline TMRM Fluoreszenz Ebene bleibt vor der Zugabe von FCCP (die ersten 350 sec.; Abb. 1C) stabil. Quantitative Analyse der TMRM Fluoreszenz ändert sich im Laufe der Zeit zeigt eine signifikante Abnahme in TMRM Fluoreszenz nach Zugabe von FCCP (Abb. 1C).

1D zeigt die Fluoreszenz-Bild der Ratte kortikalen Neuronen mit DCF geladen. Die Zugabe von H 2 O 2 führt zu einer erhöhten DCF Fluoreszenz-Intensität in Zellkörper (Abb. 1E). Die Baseline-DCF-Fluoreszenz-Ebene bleibt unverändert (die ersten 120 sec) vor dem Auftragen von H 2 O 2. Zeitraffer-Messungen der DCF-Fluoreszenz zeigen seine stetige Ebenen, die Zunahme nach H 2 O 2-Behandlung (Abb. 1F).

Abbildung 1
Abbildung 1. Einschätzung der mitochondrialen Membranpotentials und ROS Ebenen in lebenden Ratte kortikalen Neuronen. (A) Repräsentative Fluoreszenzbild der kortikalen Neuronen mit TMRM geladen. Nach dem Scannen der Grundlinie TMRM Fluoreszenz wurden Neuronen mit dem protonophore FCCP (1 uM) behandelt. Auf der rechten Seite ist eine Falschfarbendarstellung Intensität bar TMRM Fluoreszenz mit leuchtend gelben und schwarzen vertreten maximalen und minimalen Intensität, jeweils. Der Verlust von TMRM Fluoreszenz von der mitochondrialen Regionen zeigt den Zusammenbruch des ΔΨm auf FCCP Behandlung (Panel B). Die quantitative Darstellung der Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach FCCP Behandlung ist in Panel C (D) Fluoreszenzbild Ratte kortikalen Neuronen mit H2DCF-DA geladen angezeigt. Nach der Bestimmung der Baseline-DCF-Fluoreszenz wurden die Zellen mit 200 uM H 2 O 2 behandelt, und die Veränderung der DCF-Fluoreszenz wurde beurteilt. Eine Erhöhung des DCF-Fluoreszenz spiegelt der Anstieg der ROS Ebenen auf H 2 O 2-Behandlung (E). Quantitative Analyse des Wandels in DCF-Fluoreszenz vor und nach der H 2 O 2-Behandlung ist in Panel F. Skala bar = 10 pm gezeigt

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
Live Cell Imaging von TMRM in kortikalen Neuronen vor und nach FCCP zusätzlich mit 40X-Objektiv. Die Falschfarben-Intensität zeigt ein Maximum (leuchtend gelb, bevor FCCP Addition) und zurück (rote Farbe, nach FCCP Addition) TMRM Fluoreszenzintensität nach FCCP hinaus. Klicken Sie hier, um Video anzusehen

Video. 7,5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Live Cell Imaging von DCF in kortikalen Neuronen vor und nach der H 2 O 2-Zugabe mit 40X-Objektiv. Die Baseline-DCF-Fluoreszenz hat hellgrüne Farbe in Zellkörper und H2O2 Zusätzlich erhöht sich die DCF Fluoreszenzintensität auf leuchtend grüne Farbe. Klicken Sie hier, um Video anzusehen

Discussion

Wir haben eine Schritt-für-Schritt-Verfahren beschreiben, wie ΔΨm und ROS in Ratte kortikalen Neuronen mit dem fluoreszierenden Indikatoren TMRM und H 2 DCF-DA, bzw. festzustellen, vorgestellt. Für andere Zelltypen, ist es wichtig, empirisch bestimmt die endgültige Konzentration und Ladezeit für TMRM oder H 2 DCF-DA. Im Allgemeinen TMRM Konzentrationen liegen im Bereich von 20 bis 200 nM, und die Zelle Inkubationszeit mit TMRM variiert von 20 bis 60 min. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA reicht von 2-10 um, und die Inkubation von Zellen in einem Laden-Lösung mit diesem Indikator variiert von 30 bis 45 min.

Es ist wichtig, die Laserleistung und Scan-Geschwindigkeit von unter die Bilder, um sowohl photo-Toxizität für die Zellen und Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (z. B. Flackern TMRM Fluoreszenz) in Ermangelung einer Stimulus zu vermeiden optimieren. Das optimierte optische Einstellungen sollten in einem Fluoreszenz-Signal, das nicht über oder unter gesättigten (Schwelle) in Abwesenheit des Stimulus führen. Die optimalen Bedingungen, um die Bilder aus einem ausgewählten Feld an einer bestimmten Laserleistung und eine Scan-Geschwindigkeit sammeln werden erzielt, wenn es keine Änderungen in der Fluoreszenz-Intensität der Sonde in das Fehlen jeglicher Anreiz für 10-15 min von Live-Bildgebung.

Andere Fluoreszenz-Sonden an ΔΨm bestimmen, sind Rhodamin 123 und Tetra methyl Rhodamin Ethylester (TMRE). Allerdings waren sie zu finden, um die Atemwege Prozesse in isolierten Mitochondrien 2 hemmen. Wichtig ist, dass TMRM keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung bei niedrigen Konzentrationen 2 und hat einen geringen Phototoxizität und Ausbleichen 3 im Vergleich mit anderen Sonden. H 2 DCF-DA ist ein guter Indikator für ROS, wie sie ist gut in den Zellen erhalten und erkennt verschiedene Oxidantien, wie Peroxide, Superoxide und Salpetersäure Oxid 4.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (K22NS050137 zu JCB) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass bottom culture dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
NbActive4 BrainBits NbActive4
TMRM Invitrogen T668
H2DCF-DA Invitrogen C400
NaCl Sigma-Aldrich S6191
KCl Sigma-Aldrich P3911
CaCl2∙2H2O Sigma-Aldrich C3306
MgCl2∙6H2O Sigma-Aldrich M2670
D-Glucose Sigma-Aldrich G6152
HEPES Invitrogen 15630

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References

  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Comments

15 Comments

  1. I have ² queries:

    1. U ddid not mention washing off of the TMRM containing media before imaging. DŒs that mean that there is TMRM present in the imaging media?

    ². If DCFDA is washed off and imaging being done, upon addition of H²O², how can the DCF fluorescence increase?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 3:02 AM
  2. 1. We did not wash the neurons after TMRM loading. TMRM makes equilibrium between compartments (mitochondria-cytosol- extracellular buffer) in response to negative membrane potentials and a very low concentration of the dye has to be present in the imaging buffer throughout the experiment.
    ². The principle of H²DCF-DA is different as it is cell-permeable probe and trapped into the cytosol once the acetate group is cleaved by intracellular esterases. The access of dye from extracellular medium has to be washed out. Intracellular oxidation of DCF-DA by reactive oxygen species (generated by H²O² addition) results an increased DCF fluorescence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2012 - 12:42 AM
  3. Thanks for the response. However regarding DCFDA, if the dye is washed off, and then H²O² added to increase the ROS inside cells, where is the dye to react with the newly formed ROS? How will the fluorescence increase if there are no more molecules of DCF available for reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 9:42 AM
  4. When we incubate cells with H²DCFDA for an optimal time period, most of the dye molecules are trapped in cytosol and excess of dye has to be washed from extracellular buffer. The cytosolic dye will have enough molecules to produce many fold increase of fluorescence upon oxidation. Due to basal ROS activity some of the dye molecule gets oxidized but not all until cells undergo some stress which causes ROS formation. It is well known that H²O² addition to the cells result intracellular ROS formation and even H²O² itself can diffuse through the cell membrane and oxidize the cytosolic dye to increase the fluorescence.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 3, 2012 - 12:43 AM
  5. Changes in plasma membrane potential will also lead to a decrease in both the mitochondrial and cytosolic TMRM signals, (because there is a step-wise concentration gradient mitochondrial > cytosol > medium). How do you think is the best way distinguish between a loss of signal due to mitochondrial depolarization vs. loss of signal due to plasma membrane depolarization?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 9:28 PM
  6. A previous lab member has used KCl in the media to keep the plasma membrane potential constant so that changes in TMRM fluorescence are reflective of changes in mitochondrial potential only rather than a combination of both.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 1:57 AM
  7. In non- quenched method (1 to 50nM, should be optimized for a particular cell type) majority of the TMRM fluorescence arise from mitochondria and any change in TMRM fluorescence (either single mitochondrion or entire cell) can be directly correlated to polarized state of mitochondria. Alternately the ratio of TMRM fluorescence from mitochondrial and non-mitochondrial regions in cell can be normalized to ratio of TMRM fluorescence at baseline and after FCCP addition. A parallel control experiment to monitor the TMRM fluorescence under plasma membrane depolarization (such as in presence of 30mM KCl) also can be performed.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 7, 2012 - 12:50 PM
  8. For the DCFDA experiments, is the use of verapamil advisable to inhibit the efflux of DCF from cells?

    Can both TMRM and DCFDA be used at the same time or will one affect the read-out of the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 2:31 AM
  9. We never tried using verapamil in our experiments but there are reports using this drug in DCFDA experiments.
    Yes TMRM and DCFDA can be used at the same time to monitor ROS formation and mitochondrial membrane potential.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 11, 2012 - 1:30 AM
  10. Hi, I am curious how stable the preparation is in order to measure membrane potential. We have a 4 h protocol applied to cells in culture and at the end of this treatment we'd like to assess the membrane potential. Would you recommend loading TMRM before or after the 4 h procedure? I am afraid the membrane potential might change during the 45 min incubation. Therefore, it seems better to load TMRM before perhaps.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 16, 2012 - 11:37 PM
  11. TMRM incubation time varies from one cell type to another. However, once the equilibrium is reached, TMRM fluorescence remains quite stable for long time. You can try loading TMRM before treatment and keep a parallel control loading without any treatment to rule out the change in TMRM fluorescence due to artifacts.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 17, 2012 - 11:54 PM
  12. Thanks. Another question is whether you can easily convert the fluoresce intensity ratio to absolute membrane voltage.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 24, 2012 - 2:22 PM
  13. We can not convert the TMRM fluorescence into absolute membrane voltage. The difference in TMRM fluorescence intensity is always a relative change between the experimental groups.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 24, 2012 - 11:13 PM
  14. But I still have some queries . In your article only described the determination of mitochondrial membrane potential and oxygen species in primary cortical neurons, my query is if I want to know the relationship of my target drug and its concentration to the result , how should I go on my study? Which step should I give my compound to the cell? How can I determine the appropriate concentration? I really appreciate you can give me some advice. I am looking forward for your reply. Wish you have a nice day. Many thinks~

    Reply
    Posted by: longjun z.
    February 25, 2013 - 9:40 PM
  15. First, you will have to optimize the dye as well as the drug concentration in the cells independently. I would suggest optimizing the dye loading conditions first, then do dose dependent changes in the fluorescence of either TMRM or DCF to get an optimal drug concentration to start with. Once you have the optimized conditions, you can measure the ROS and membrane potential in two ways. 1. Incubate the cells with the probe; image them before and after the addition of drug. ². You can incubate the cells with drug and then load the cells with probe to monitor the effect of your drug. If longer incubation of drug is required, second method is preferred. Both the methods are well documented in the literature.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    February 28, 2013 - 1:23 PM

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