Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Neuroscience
 

Summary

Biz belirli bir uyaran uygulamasından önce ve sonra, TMRM floresan yoğunluğu göreceli değişiklikleri belirlemek için kortikal nöronlarda, floresan gösterge, TMRM uygulama göstermektedir. Ayrıca floresan prob H uygulanmasını göstermek

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (51), e2704, doi:10.3791/2704 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mitokondrial membran potansiyeli (ΔΨm) ATP üretmek için solunum zinciri fizyolojik fonksiyonu korumak için kritik öneme sahiptir. ΔΨm önemli bir kaybı ölüme enerji tükenmiş hücreleri vermektedir. Reaktif oksijen türleri (ROS), önemli sinyal molekülleri, ancak patolojik durumların kendi birikimi oksidatif strese yol açar. Hücrelerde ROS iki önemli kaynakları, çevresel toksinler ve oksidatif fosforilasyon sürecinde. Mitokondriyal disfonksiyon ve oksidatif stres birçok hastalığın patofizyolojisinde suçlanmıştır, bu nedenle ΔΨm ve ROS belirleme yeteneği hücre ve mitokondri fonksiyonu fizyolojik durumu hakkında önemli ipuçları sağlayabilir.

Birkaç floresan probları (rodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) hücre tiplerinin çeşitli Δψm belirlemek için kullanılır ve çok sayıda floresan göstergeleri (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) ROS belirlemek için kullanılabilir . Neredeyse tüm ΔΨm veya ROS değerlendirmek için kullanılan floresan probları ΔΨm veya ROS düzeylerini artırır veya azaltır bir uyarıcı ile orantılı olarak floresan yoğunluğu artırmak veya azaltmak tek dalga boyu göstergeleri. Bu nedenle, temel düzeyde ve belirli bir uyaran uygulamasından sonra bu problar floresan yoğunluğu ölçmek için zorunludur. Bu bir değişim, temel seviye ve bir uyarıcı arasında floresan yoğunluğu oranını belirlemek için izin verir. Bu değişiklik, floresan ΔΨm veya ROS göreli seviyeleri değişimi yansıtır. Bu video, biz, başlangıç ​​düzeyi arasında ve FCCP, mitokondriyal uncoupler uyguladıktan sonra TMRM floresan yoğunluğu yüzde değişimi belirlemek için fare kortikal nöronların floresan gösterge, TMRM, nasıl uygulanacağını göstermektedir. TMRM floresan FCCP tedavi kaynaklanan düşük seviyelerde mitokondriyal membran potansiyelinin depolarizasyon yansıtmaktadır. Ayrıca floresan prob H 2 DCF-DA sonra H 2 O 2 uygulaması başlangıçta ilk kortikal nöronlarda ROS düzeyi, değerlendirmek ve nasıl uygulanacağını gösteriyor. Bu protokol aynı zamanda (küçük değişiklikler ile) farklı hücre tipleri ve diğer beyin bölgeleri izole nöronların ΔΨm ve ROS değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir.

Protocol

1. Hücre kültürü

  1. Kortikal nöronların izole ve önceden açıklanan teknikler ve poli-D-lizin ve laminin 1 ile kaplanmış bir cam alt (Mattek Corporation, Ashland, MA) ile kültür kaplarına kaplama kullanılarak yetiştirilir.

2. Floresan probları TMRM ve H 2 DCF-DA için stok çözümler hazırlanması

  1. TMRM, 5.0 mg 1 ml susuz dimethylsülfoksit eriterek TMRM 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Vortex 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir ay içinde kullanın.
  2. Sonra, susuz DMSO 1 ml H 2 DCF-DA 4.87 mg eriterek H 2 DCF-DA 10 mM stok solüsyon hazırlanır. Benzer şekilde, vorteks 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir hafta içinde kullanabilirsiniz.

3. TMRM ve H 2 DCF-DA ile yükleme sıçan kortikal nöronların

TMRM mitokondri son derece negatif yüklü iç birikir potansiyometrik, hücre-geçirgen floresan gösterge. Mitokondriyal TMRM otomatik söndürme önlemek için TMRM düşük konsantrasyonlarda (10-50 nM aralık) kullanmak önemlidir. Sonra TMRM, floresan sinyal iç mitokondrial membran genelinde ΔΨm doğrudan işbirliği ile ilgili olabilir. ΔΨm kaybı floresan yoğunluğu kaybı ile sonuçlanan mitokondri sızması TMRM neden olur. H 2 DCF-DA hücre geçirgen prob, hücre içi esterazlar tarafından DCF-DA dönüştürülür ve floresan DCF oksidasyon sonuçları . Yüksek yükleme konsantrasyonları DCF floresan doygunluk H 2 O 2 yokluğunda bile neden olabilir DCF-DA, 2-10 mcM ve arasında değişmektedir H 2 farklı beyin bölgelerinden elde edilen nöronların nihai konsantrasyonu ampirik olarak test edilmelidir . Herhangi bir endojen veya eksojen oksidan varlığı (örneğin, nitrik oksit, hidrojen peroksit) DFC floresan yoğunluğu artacaktır. Aşağıda, TMRM ve H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yükleme için bir protokol sağlar.

  1. TB:: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukoz, 1.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ve 10 TMRM ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, ilk, Tyrode Kullanıcı tampon (Paylaşımlı Metin kültürlü nöronlar 3 kere yıkayın mM HEPES;) NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın. Ardından, TB 1 / 1000 kere 10 mM TMRM stok seyreltilmesiyle TMRM 20 nM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına 1 ml seyreltilmiş TMRM ul ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta TMRM nöronlar inkübe edin. 45 dakika sonra, mikroskop sahnede kültür çanak montaj ve görüntüleme başlayın.
  2. H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, TB kültür nöronlar 3 kez yıkayın. Sonra, TB 10 mM H 2 DCF-DA stok 1 / 10 kez seyreltilmesi ile H 2 DCF-DA 2 mcM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına seyreltilmiş 1 ml H 2 DCF-DA ul ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 45 dakika karanlıkta H 2 DCF-DA nöronlar kuluçkaya yatmaktadır. 45 dakika sonra, görüntüleri almadan önce aşırı floresan gösterge kaldırmak için TB nöronlar 4 kere yıkar.

4. ΔΨm belirlemek için TMRM ile inkübe nöron görüntüleme Canlı

  1. TMRM, konfokal lazer tarama mikroskobu (Metin Yerleşimi: EKK 510, Carl Zeiss A.Ş.) ile inkübe nöronların canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, canlı zaman serisi programı uygulaması ile kullanılır. Görüntüleri elde etmek ve photobleaching önlemek için gerekli zamanı en aza indirmek için; düşük çözünürlüklü ve zayıflatılmış lazer gücü (düşük çözünürlüklü lazer gücü:% 1: 256 x 256 Metin Dağılımı) uygulayın.
  2. . Sonra, yansıyan ışık kullanılarak TMRM yüklü monte nöronların odağı ayarlayın. TMRM floresan aydınlatma ve 514 nm 570 nm dalga boyunda tespit inceleyin. Doygunluk seviyesinin altında sadece bir kamera tespit kazanç ayarlayın.
  3. Görüntüleri elde etmek için çözünürlük, lazer gücü, bir kamera tespit kazanç ve zaman atlamalı aralığını içeren tüm parametreleri sonra; deneyler arasındaki bu ayarları değişmez. Ardından, alan değiştirmek. Görüntü toplamaya başlayın.
  4. FCCP veya 2 mcg / oligomycin ml, 1 mcM gibi uyaranlara ΔΨm değişiklikleri sınamak için, önemli ölçüde sırasıyla, mitokondriyal membran potansiyeli depolarize veya hyperpolarize hangi uygulanan olabilir. Bu değişiklikler TMRM floresan FCCP durumunda bazal floresan veya oligomycin durumunda TMRM floresan yoğunluğunda bir artış ile karşılaştırıldığında bir düşüş yansıyacaktır.

5. ROS belirlemek için H 2 DCF-DA ile inkübe nöronlar Canlı görüntüleme

  1. Inkübe nöronlar H 2 DCF-DA, ilk canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, bir mikroskop aşamasında kültür çanak monte edin. Hücrelerinin odağı ayarlayıning yansıyan ışık. 488 nm eksitasyon ve 515 nm dalga boyunda emisyon DCF floresan inceleyin.
  2. Sonra% 5-7, dedektör kazanç ve 256 x 256 çözünürlükte, lazer gücü ayarlayın. Deneyler arasındaki bu ayarları değiştirebilirsiniz etmeyin. Sonra, zaman serisi programını kullanarak canlı görüntüler elde etmek için frekansını ayarlayın.
  3. Yeni bir alan seçin ve görüntüleri almak başlayabilirsiniz. ROS düzeylerinde değişiklikler tespit için, 100-200 mcM H 2 O 2 hücre tedavisi. Bu başlangıç ​​seviyesi ile karşılaştırıldığında DCF floresan yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır.

6. Veri analizi

  1. LSM program aracı: ilgi bölgesi (ROI Metin Dağılımı) alanlarını seçmek için kullanın. Sonra, TMRM veya ROS floresan yoğunlukları ölçmek. Mitokondriyal bölgelerde veya TMRM veya ROS floresan yoğunlukları sırasıyla ölçmek için görüntülü hücrelerinde tüm hücre gövdesi ROI'ler ROI'ler seçin.
  2. TMRM veya her zaman noktası için ROS için tüm görüntülü hücreleri için bütün hücre gövdeleri her hücrenin bütün ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları hesaplayın. Eşiğe yoğunluğunu hesaplamak için hücrelerin yanında bölgeleri seçin. Çeşitli ölçümler ve ortalama arka planda yoğunluğunu hesaplamak.
  3. Microsoft Excel kullanarak her zaman noktası için her hücrede ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları, ortalama bir arka plan floresan çıkarın. Arka plan yoğunluğu çıkarılarak sonra, bu formülü (: mesafe kadar taşınmış = FF o / F o x 100, F = bazal floresan için herhangi bir zaman noktasında = floresan yoğunluğu, Paylaşımlı Metin) kullanarak temel floresan TMRM veya DCF floresan yoğunluğu normale Sonra, zaman içinde floresan yoğunluğunda değişiklik gösteren arsa üretmek için Sigma Arsa programı kullanın.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1A TMRM ile inkübe fare kortikal nöronların bir floresan görüntüyü gösterir. FCCP eklenmesi, mitokondriyal uncoupler, mitokondriyal depolarizasyon ve TMRM floresan yoğunluğu (Şekil 1B) kaybına yol açar. Bazal TMRM floresan seviyesi FCCP ek önce (Şekil 1C ilk 350 sn) sabit kalır. Kantitatif analiz, zaman içinde TMRM floresan değişiklikler TMRM floresan FCCP (Şekil 1C) eklenmesinden sonra önemli bir azalma gösterir.

Şekil 1D DCF yüklü fare kortikal nöronların floresan görüntüyü gösterir. H 2 O 2 sonuç eklenmesi (Şekil 1E) hücre gövdeleri DCF floresan yoğunluğu arttı. Bazal DCF floresan seviyesi H 2 O 2 uygulama öncesi (ilk 120 sn) değişmez. Time-lapse DCF floresans ölçümleri istikrarlı düzeyleri gösterisi, H 2 O 2 tedavisi (Şekil 1F) sonra artış.

Şekil 1
Şekil 1 mitokondriyal membran potansiyeli ve canlı sıçan kortikal nöronların ROS düzeylerinin değerlendirilmesi. (A) kortikal nöronların Temsilcisi floresan görüntü TMRM yüklendi. Temel TMRM floresan taradıktan sonra, nöronlar protonophore FCCP (1 mcM) ile tedavi edildi. Sağda, parlak sarı ve siyah temsil maksimum ve minimum yoğunluğu, sırasıyla TMRM floresan Pseudocolor yoğunluğu bar. Mitokondriyal bölgelerden TMRM floresan kaybı FCCP tedavi (panel B) üzerine ΔΨm çöküşünü gösterir. Farklı zaman noktalarında TMRM floresan yoğunluğu değişim kantitatif gösterimidir FCCP tedavi öncesi ve sonrasında H2DCF-DA yüklü sıçan kortikal nöronların Floresan görüntü paneli C. (D). Temel DCF floresan belirlendikten sonra, hücrelerin 200 mcM H 2 O 2 ile tedavi edildi ve DCF floresan değişimi değerlendirildi. DCF floresan bir artış H 2 O 2 tedavisi (E) üzerine ROS düzeylerinde artış yansıtır. DCF floresan değişimi nicel analizi, H 2 O 2 tedavi öncesi ve sonrası paneli F. Ölçek çubuğu = 10 mm gösterilir

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
FCCP Ayrıca 40X objektif kullanarak öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda TMRM hücre görüntüleme yaşayın. Pseudocolor yoğunluğu maksimum (FCCP toplamadan önce parlak sarı) ve (kırmızı renk, FCCP eklenmesinden sonra) FCCP eklenmesinden sonra TMRM floresan yoğunluğu azalmış Videoyu izlemek için buraya tıklayın

Video. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
40X objektif kullanılarak, H 2 O 2 ek öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda DCF hücre görüntüleme yaşayın. DCF floresan bazal hücre gövdeleri, açık yeşil renkli ve H2O2 Ayrıca DC artırırF parlak yeşil renkli floresan videoyu görmek için buraya tıklayın

Discussion

Biz ΔΨm ve ROS floresan göstergeler sırasıyla TMRM ve H 2 DCF-DA kullanarak fare kortikal nöronlarda nasıl belirleneceğini anlatan bir adım-adım prosedürü sundu. Diğer hücre türleri için, ampirik TMRM veya H 2 DCF-DA için nihai konsantrasyonu ve yüklenme zamanını belirlemek çok önemlidir. Genel olarak, 20-200 nM TMRM konsantrasyonlarının aralığı ve TMRM hücre inkübasyon süresi 20 ila 60 dakika arasında değişir. H 2 final konsantrasyon DCF-DA 2-10 mcM aralıkları ve Bu gösterge içeren bir yükleme çözüm hücreler inkübasyon 30-45 dakika arasında değişir.

Herhangi bir uyaran yokluğunda hücreleri ve floresan yoğunluğu değişiklikleri (örneğin TMRM floresan titremeyi) hem fotoğraf toksisitesini önlemek için fotoğraf çekmek, lazer gücü ve yüksek tarama hızı optimize etmek için çok önemlidir. Optimize edilmiş optik ayarları uyaran yokluğunda (eşik) doymuş altında veya üstünde bir floresan sinyal sonuçlanması gerekiyor. 10-15 dakika canlı görüntüleme için herhangi bir uyarıcı olmaması halinde prob floresan yoğunluğu herhangi bir değişiklik olduğunda, belirli bir lazer güç ve tarama hızı Seçilen bir alandan görüntü toplamak için en uygun koşulları elde edilmektedir.

Diğer ΔΨm belirlemek için floresans problar rodamin 123 ve tetra metil rodamin etil ester (TMRE) içerir. Ancak, izole mitokondri 2 solunum proseslerini inhibe etmek bulundu. Önemlisi, TMRM düşük konsantrasyonlarda 2 mitokondriyal solunum üzerine etkisi yoktur ve düşük fototoksisite ve diğer problar ile karşılaştırıldığında 3 photobleaching vardır. H 2 DCF-DA hücrelerde muhafaza edilir ROS için iyi bir göstergedir ve bu peroksitler gibi bazı oksidan türlerin, süper oksitler ve nitrik oksit 4 tanır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (JCB K22NS050137) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass bottom culture dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
NbActive4 BrainBits NbActive4
TMRM Invitrogen T668
H2DCF-DA Invitrogen C400
NaCl Sigma-Aldrich S6191
KCl Sigma-Aldrich P3911
CaCl2∙2H2O Sigma-Aldrich C3306
MgCl2∙6H2O Sigma-Aldrich M2670
D-Glucose Sigma-Aldrich G6152
HEPES Invitrogen 15630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Comments

15 Comments

  1. I have ² queries:

    1. U ddid not mention washing off of the TMRM containing media before imaging. DŒs that mean that there is TMRM present in the imaging media?

    ². If DCFDA is washed off and imaging being done, upon addition of H²O², how can the DCF fluorescence increase?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 3:02 AM
  2. 1. We did not wash the neurons after TMRM loading. TMRM makes equilibrium between compartments (mitochondria-cytosol- extracellular buffer) in response to negative membrane potentials and a very low concentration of the dye has to be present in the imaging buffer throughout the experiment.
    ². The principle of H²DCF-DA is different as it is cell-permeable probe and trapped into the cytosol once the acetate group is cleaved by intracellular esterases. The access of dye from extracellular medium has to be washed out. Intracellular oxidation of DCF-DA by reactive oxygen species (generated by H²O² addition) results an increased DCF fluorescence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2012 - 12:42 AM
  3. Thanks for the response. However regarding DCFDA, if the dye is washed off, and then H²O² added to increase the ROS inside cells, where is the dye to react with the newly formed ROS? How will the fluorescence increase if there are no more molecules of DCF available for reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 9:42 AM
  4. When we incubate cells with H²DCFDA for an optimal time period, most of the dye molecules are trapped in cytosol and excess of dye has to be washed from extracellular buffer. The cytosolic dye will have enough molecules to produce many fold increase of fluorescence upon oxidation. Due to basal ROS activity some of the dye molecule gets oxidized but not all until cells undergo some stress which causes ROS formation. It is well known that H²O² addition to the cells result intracellular ROS formation and even H²O² itself can diffuse through the cell membrane and oxidize the cytosolic dye to increase the fluorescence.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 3, 2012 - 12:43 AM
  5. Changes in plasma membrane potential will also lead to a decrease in both the mitochondrial and cytosolic TMRM signals, (because there is a step-wise concentration gradient mitochondrial > cytosol > medium). How do you think is the best way distinguish between a loss of signal due to mitochondrial depolarization vs. loss of signal due to plasma membrane depolarization?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 9:28 PM
  6. A previous lab member has used KCl in the media to keep the plasma membrane potential constant so that changes in TMRM fluorescence are reflective of changes in mitochondrial potential only rather than a combination of both.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 1:57 AM
  7. In non- quenched method (1 to 50nM, should be optimized for a particular cell type) majority of the TMRM fluorescence arise from mitochondria and any change in TMRM fluorescence (either single mitochondrion or entire cell) can be directly correlated to polarized state of mitochondria. Alternately the ratio of TMRM fluorescence from mitochondrial and non-mitochondrial regions in cell can be normalized to ratio of TMRM fluorescence at baseline and after FCCP addition. A parallel control experiment to monitor the TMRM fluorescence under plasma membrane depolarization (such as in presence of 30mM KCl) also can be performed.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 7, 2012 - 12:50 PM
  8. For the DCFDA experiments, is the use of verapamil advisable to inhibit the efflux of DCF from cells?

    Can both TMRM and DCFDA be used at the same time or will one affect the read-out of the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 2:31 AM
  9. We never tried using verapamil in our experiments but there are reports using this drug in DCFDA experiments.
    Yes TMRM and DCFDA can be used at the same time to monitor ROS formation and mitochondrial membrane potential.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 11, 2012 - 1:30 AM
  10. Hi, I am curious how stable the preparation is in order to measure membrane potential. We have a 4 h protocol applied to cells in culture and at the end of this treatment we'd like to assess the membrane potential. Would you recommend loading TMRM before or after the 4 h procedure? I am afraid the membrane potential might change during the 45 min incubation. Therefore, it seems better to load TMRM before perhaps.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 16, 2012 - 11:37 PM
  11. TMRM incubation time varies from one cell type to another. However, once the equilibrium is reached, TMRM fluorescence remains quite stable for long time. You can try loading TMRM before treatment and keep a parallel control loading without any treatment to rule out the change in TMRM fluorescence due to artifacts.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 17, 2012 - 11:54 PM
  12. Thanks. Another question is whether you can easily convert the fluoresce intensity ratio to absolute membrane voltage.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 24, 2012 - 2:22 PM
  13. We can not convert the TMRM fluorescence into absolute membrane voltage. The difference in TMRM fluorescence intensity is always a relative change between the experimental groups.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 24, 2012 - 11:13 PM
  14. But I still have some queries . In your article only described the determination of mitochondrial membrane potential and oxygen species in primary cortical neurons, my query is if I want to know the relationship of my target drug and its concentration to the result , how should I go on my study? Which step should I give my compound to the cell? How can I determine the appropriate concentration? I really appreciate you can give me some advice. I am looking forward for your reply. Wish you have a nice day. Many thinks~

    Reply
    Posted by: longjun z.
    February 25, 2013 - 9:40 PM
  15. First, you will have to optimize the dye as well as the drug concentration in the cells independently. I would suggest optimizing the dye loading conditions first, then do dose dependent changes in the fluorescence of either TMRM or DCF to get an optimal drug concentration to start with. Once you have the optimized conditions, you can measure the ROS and membrane potential in two ways. 1. Incubate the cells with the probe; image them before and after the addition of drug. ². You can incubate the cells with drug and then load the cells with probe to monitor the effect of your drug. If longer incubation of drug is required, second method is preferred. Both the methods are well documented in the literature.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    February 28, 2013 - 1:23 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics