세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

Published 8/30/2007
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Biology

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Summary

우리는 잘 정의된 microenvironment의 공간 및 시간적 그라디언트를 생성할 수있는 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 microfabrication을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 그라디언트 생성 microfluidic 장치가 감독 셀 마이 그 레이션, embryogenesis, 상처 치유, 및 암 전이를 공부하는 데 사용할 수 있습니다.

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Chung, B. G., Manbachi, A., Saadi, W., Lin, F., Jeon, N. L., Khademhosseini, A. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271, doi:10.3791/271 (2007).

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Abstract

세포 행위를 연구에 대한 제조 및 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 작동을 설명합니다. 그것이 정확하게, 유체 흐름을 조작하는 높은 처리량 실험을 활성화하고 안정적​​인 용해 농도 그라디언트를 생성할 수 있기 때문에 microfluidic 플랫폼, 활성화 실험 도구입니다. 기존의 기울기 발전기, 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)에 비해 기반의 microfluidic 장치는 잘 정의된 프로필 성장 요인의 안정적인 농도 기울기를 생성할 수 있습니다. 여기, 우리는 별도의 세 가지 인레츠와 간단한 그라디언트 생성 microfluidic 장치를 개발했다. 세 microchannels은 농도 기울기를 생성 한 microchannel에 결합. 성장 인자의 그라디언트의 안정성과 형태는 표피 성장 인자 (EGF)와 비슷한 분자량과 플루오레신 isothyiocyanate (FITC) - dextran에 의해 확인되었다. 이 microfluidic 장치를 사용하여, 우리는 EGF의 농도 기울기에 노출된 섬유아 세포가 높은 농도쪽으로 마이 그 레이션 것을 보여주었다. 마이 그 레이션 세포의 세포 마이 그 레이션 및 운동성의 방향 방향은 양적 세포 추적 분석에 의해 평가되었다. 따라서,이 그라디언트 생성 microfluidic 장치 마이 그 레이션 세포의 동작을 연구하고 분석을 위해 유용할 수 있습니다.

Protocol

그라디언트 생성 microfluidic 장치의 A.의 Microfabrication

  1. 시 웨이퍼는 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)로 처리됩니다.
  2. 부정적인 포토 레지스트 (SU - 8 50 Microchem, MA)가시 웨이퍼 1 분 1,000 RPM에서 스핀 - 코팅입니다.
  3. 웨이퍼는 부드럽 65 구운 ° 95시 이후에 10 분 및 들면 C ° 열판 30 분 C.
  4. 웨이퍼 30 μm의 최소 기능 크기가 투명 마스크를 통해 3 분위한 자외선 (200W)에 노출됩니다.
  5. 웨이퍼 65에서 구운 게시물 ° 1 분 및 95에서 C ° 10 분 C. 것입니다
  6. 100 μm의 두께 채​​널시 마스터 금형은 SU - 8 포토 레지스트 개발을 사용하여 개발되고 있습니다.
  7. microchannels를 포함하는 웨이퍼는 페트리 접시에 - 배치됩니다.
  8. 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) 금형은 혼합 실리콘 엘라스토머 및 치료 에이전트 (10시 1분 비율)에 의해 가공됩니다.
  9. PDMS 혼합물은시 마스터 금형에 부어있다.
  10. 시 마스터 금형 10 분 거품을 제거하는 진공 건조기에 배치됩니다.
  11. PDMS는 1 ~ 2 시간 동안 70 ° C에서 치료됩니다.
  12. PDMS 금형은시 마스터 금형으로부터 떨어져 벗겨 수 있습니다.

B. 실험 설정

  1. PDMS 기반 microfluidic 장치의 세포 유입, 아울렛, 그리고 일으키는 인레츠는 날카로운 punchers를 사용하여 천공하고 있습니다.
  2. 장치 및 유리 슬라이드 (2 × 3 인치) irreversibly 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)에 의해 결합됩니다.
  3. 폴리에틸렌 튜브 (PE 20 백톤 Dickinon, MD)은 microfluidic 장치의 일으키는 인레츠에 삽입 후 주사기 펌프에 연결되어 있습니다.
  4. 플루오레신 isothiocyanate (FITC) - dextran (MW = 10kD, 10 μm의, 시그마)와 버퍼 (PBS, Invitrogen, CA) 유체 장치 내부의 안정적인 그라디언트를 확인 microfluidic 장치에 들어갈 수 있습니다.
  5. 세포외 매트릭스 (ECM) (즉, fibronectin)는 인큐베이터에서 1 시간 (37 ° C)에 대한 microfluidic 장치 내부에 코팅됩니다.
  6. NIH 3T3 fibroblast 세포는 trypsinized 및 dissociated 있습니다.
  7. Dissociated 세포 2의 세포 밀도 × 10 6 세포 / ML에서 microfluidic 장치 (800 μm의 폭)에로드됩니다.
  8. 2 ML 미디어 50 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF)는 주사기 펌프 (0.05 μl / 분)를 사용하여 가용성 그라디언트 창출을위한 microfluidic 장치로 주입됩니다.
  9. 전지는 실시간으로 바뀌 현미경 (니콘 TE 2000)를 사용하여 모든 5 분 감시하고 있습니다.

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Discussion

세포가 높은 농도쪽으로 마이 그 레이션 microfluidic 장치에서 EGF의 안정적인 농도 기울기에 노출. 셀 마이 그 레이션, chemotactic 지수, 마이 그 레이션하는 세포의 운동성의 방향 방향은 셀 추적 분석에 의해 조사되었다. 따라서,이 그라디언트 생성 microfluidic 플랫폼은 암 전이, embryogenesis, 그리고 축삭지도를 공부하는 데 유용 수 있습니다.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Dextran-FITC Reagent Sigma-Aldrich FD10S Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD)
hr-EGF Invitrogen 13247-051 human recombinant Epidermal growth factor
PDMS K.R. Anderson Co. 2065622 Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
Negative photoresist MicroChem Corp. SU-8 50
Si wafer silicone wafer, 4 inch
Petri dishes
Polyethylene tubing BD Biosciences PE 20
PBS Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3 cell-line fibroblast cells
Inverted microscope Nikon Instruments TE 2000

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References

  1. Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
  2. Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
  3. Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
  4. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
  5. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).

Comments

1 Comment

  1. I wanna try it on my cells. Can you give me some ready-to-use devices?

    Reply
    Posted by: Grace C.
    April 21, 2009 - 9:24 PM

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