一个渐变产生的微流体装置,细胞生物学

Biology

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Summary

我们描述了一个协议梯度产生的微流体装置,可以产生良好定义的微环境中的空间和时间的梯度微细。在这种方法中,梯度产生的微流体装置可用于研究细胞定向迁移,胚胎发育,伤口愈合,癌症转移。

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Chung, B. G., Manbachi, A., Saadi, W., Lin, F., Jeon, N. L., Khademhosseini, A. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271, doi:10.3791/271 (2007).

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Abstract

的制造和研究细胞行为的一个梯度产生的微流体装置的操作说明。微流体平台是一个有利的实验工具,因为它可以精确地操纵流体流动,使高通量的实验,并产生稳定的水溶性的浓度梯度。相比传统的梯度发生器,聚二甲基硅氧烷(PDMS)的基于微流体装置,可以产生生长因子具有良好定义的配置文件稳定的浓度梯度。在这里,我们开发了三个独立的进气口简单的梯度产生的微流体装置。三微合并成一个微产生浓度梯度。 isothyiocyanate荧光素(FITC)-葡聚糖的分子量类似表皮生长因子(EGF),生长因子梯度的稳定和形状被证实。我们表明,使用这种微流体装置,暴露表皮生长因子的浓度梯度成纤维细胞对高浓度的迁移。细胞迁移和细胞迁移运动的方向定位,定量评估细胞跟踪分析。因此,该梯度产生的微流体装置,可能是有益的研究和分析细胞迁移的行为。

Protocol

A.梯度产生的微流体装置微细

  1. 硅晶片被视为与活性氧离子(Harrick科学30W,5分钟,NY)。
  2. 负型光刻胶(SU - 8 50,Microchem,MA)是在一个硅晶片上的1分钟1000转的旋涂。
  3. 晶圆是软的烤在65 ° C为10分钟,随后在95 ° C为30分钟一个电磁炉。
  4. 晶圆暴露在紫外线灯(200W),通过一个30微米的最小特征尺寸的透明度面具3分钟。
  5. 晶圆是出炉后在65 ° C为1分,在95 ° C为10分钟。
  6. 四掌握模具100微米厚的渠道是开发利用SU - 8光刻胶开发。
  7. 含微晶圆被放置在一个Petri盘。
  8. 聚二甲基硅氧烷(PDMS)中(Sylgard 184)模具制造混合的有机硅弹性体和固化剂(10:1)。
  9. 泗母模的PDMS混合物倒入。
  10. 四母模是放在真空干燥器除去10分钟的气泡。
  11. PDMS的是固化在70 ° C,1〜2小时。
  12. 从四母模的PDMS模具揭下。

B.实验装置

  1. 细胞的入口,出口,并注入进气口的PDMS微设备使用锋利打孔器打孔。
  2. 是不可逆转的保税的活性氧等离子(Harrick科学30W,5分钟,纽约州)的设备和载玻片(2 × 3英寸)。
  3. 聚乙烯管(PE 20,流式细胞Dickinon,MD)被插入到微流体装置注入进气口,随后连接到一个注射器泵。
  4. 异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖(MW = 10kD,10μM,Sigma公司)和缓冲液(PBS,Invitrogen公司,CA)注入到微流体装置内的流体设备,以确认稳定的梯度。
  5. 培养箱中培养1小时(37℃)的微流体装置内涂外基质(ECM)(即纤维连接蛋白)。
  6. 的NIH 3T3成纤维细胞,胰酶消化分离。
  7. 游离细胞被加载到微流体装置(宽800微米),在细胞密度2 × 10 6细胞/ ml 。
  8. 注入2毫升媒体和50 ng / mL表皮生长因子(EGF)是一个微流体装置,使用注射泵(0.05微升/分钟)生成可溶性梯度。
  9. 细胞实时监测每5分钟,通过倒置显微镜(尼康TE的2000)。

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Discussion

细胞暴露于稳定的表皮生长因子的浓度梯度,在向着更高浓度的迁移一个微流体装置。细胞跟踪分析,细胞迁移,趋化指数,细胞迁移运动的方向定位进行了调查。因此,该梯度产生的微流体平台可用于研究癌细胞转移,胚胎发育和轴突导向。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Dextran-FITC Reagent Sigma-Aldrich FD10S Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD)
hr-EGF Invitrogen 13247-051 human recombinant Epidermal growth factor
PDMS K.R. Anderson Co. 2065622 Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
Negative photoresist MicroChem Corp. SU-8 50
Si wafer silicone wafer, 4 inch
Petri dishes
Polyethylene tubing BD Biosciences PE 20
PBS Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3 cell-line fibroblast cells
Inverted microscope Nikon Instruments TE 2000

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References

  1. Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
  2. Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
  3. Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
  4. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
  5. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).

Comments

1 Comment

  1. I wanna try it on my cells. Can you give me some ready-to-use devices?

    Reply
    Posted by: Grace C.
    April 21, 2009 - 9:24 PM

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