세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Immunology and Infection

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Summary

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

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Chen, J., Grieshaber, S., Mathews, C. E. Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (52), e2724, doi:10.3791/2724 (2011).

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Abstract

제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 - 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 - 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제.

효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된

Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT - 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT - 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다.

400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT - 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT - 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 세포의 준비

  1. 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT - 1 NIT - 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 - 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 당 5x10 4 8 - 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass의 씨앗 세포, 그리고 세포 독성 실험에 사용하기 전에 48 시간 성장할 수 있습니다.
  2. 제어 T 세포 라인 문화 : 부정적인 제어로 (ATCC, 인 경우에는 3 번 CD + 인간 림프구 세포주) Jurkat 세포주를 사용하십시오. RPMI1640의 문화 Jurkat 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM의 HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate.

2. 효과기 CD8 + T autoreactive 세포의 수집 및 활성화

NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4a]와 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]는 잭슨 연구실 (바 하버, ME)에서 구입했다 저희 마우스 시설에서 자란. 와 NOD - AI4a의 matings에서 F1 잡종 자손 NOD - AI4b [NOD - AI4a / B] 시대의 3~5주에서 당뇨병을 개발합니다. 모든 생쥐는 무균 시설에서 보관되어 및 관련 기관의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

  1. CO 2를 사용하여 3~4주 오래된 NOD - AI4a / B 쥐를 안락사.
  2. 생쥐의 spleens를 수집합니다. Euthanized 생쥐는 에탄올 스프레이로 준비하고 수술 후드 아래에 열립니다. Spleens은 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼에 넣어 있습니다.
  3. 7 ML 유리 균질 화기를 사용하여 비장 세포를 수집합니다. 두 세 spleens 각각 차가운 HBSS 5 ML 넣고 7 ML 유리 균질 화기로 균질하고 있습니다. Homogenate 4에서 5 분 동안 1200rpm에서 수집 및 centrifuged 있습니다 ° C Sorvall RT7 + 원심 분리기를 사용하여. 세포 펠렛을 수집하고 있습니다.
  4. hypotonic 솔루션 치료를 사용하여 적혈구를 제거합니다. 우박이 5 분 얼음 솔루션 / 비장 5 ML hypotonic로 처리되며, 다음 HBSS의 동일한 음량을 추가하여 무력화. 위에서, 원심 분리하여 세포를 수집, 50 ML HBSS에 resuspend. 셀 스트레이너를 통해 정지 세포를 통과하고 TrypanBlue의 얼룩과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다.
  5. 세포를 활성화합니다. RPMI1640에서 0.1 μm의 AI4 mimotope (아미노산 서열 YFIENYLEL) 25 U / ML IL - 2와 3 일간의 문화를 사용하여 5x10 6 / ML 및 활성화에 Resuspend 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate.

3. 51 피크 자료 분석은 CML를 검토

  1. 라벨 대상 세포 : 3 시간 μCi / 음과 문화 1 세포를 대상으로, 문화 매체로 3 번 씻어 51 피크를 추가합니다.
  2. 최종 볼륨이 각각 잘에 추가 있도록 단계 2.5에서 언급한로 RPMI 1640 배지에 효과기 세포를 일시 중지하면 200 μl 있습니다.
  3. 비율 : 표시 대상 세포의 최종 세척 후, (T E)를 대상으로 원하는 이펙터에서 대상 셀 문화 활성화 효과기 세포를 추가합니다. 0.4:1, 1시 1분, 2시 1분, 5시 1분, 10시 1분, 20시 1분과 50:1에서 T 비율 : 우리는 일반적으로 E를 사용합니다.
  4. 자연 용해 제어 역할을 타겟 세포 6 웰스 신선한 수정 RPMI 1640 매체 (단계 2.5 참조) 추가합니다.
  5. 16시간 공동 문화 효과기 및 대상 세포.
  6. 6x50 mm 라임 유리 튜브에 뜨는 수집
  7. 100μl 2% SDS를 추가하고 부드럽게 여러 번 pipetting하여 세포를 Lyse.
  8. 6x50 mm 라임 유리 튜브의 다른 집합에 세포 lysate를 수집합니다.
  9. 깨끗한 H 2 O로 한 우물을 세척하고 세포 lysate 튜브에 세척을 추가합니다.
  10. 감마 카운터를 사용하여 supernatants 및 세포 lysates 카운트.
  11. 다음과 같이 구체적인 용해를 계산 :
    방정식 1

4. 라이브 셀 이미징에 대한 세포의 스테 이닝

가장 일반적으로 사용되는 mitochondrial 막 잠재적인 염료 중 TMRM는 최소한 mitochondrial 독성을 전시하고 있습니다. 따라서 3 이러한 라이브 셀 이미징 연구 TMRM을 선택합니다.

  1. -20 ° C.에 DMSO와 저장소에 40 MM 주식 TMRM 솔루션을 준비 [25 NM] NIT - 1 세포 배양 1 모든 보충제와 페놀 레드없는 DMEM에 신선한 작업 솔루션을 확인하십시오.
  2. 37 30 분 TMRM 25 NM과 목표 NIT - 1 세포를 얼룩 ° C.
  3. 염료 4 평형 분포를 유지하기 위해 TMRM 5 nm의를 포함하는 새로운 미디어로 미디어를 교체합니다.
  4. hematocytometer를 사용하여 활성화 효과기 AI4 T 세포를 계산합니다.
  5. 1 μl / ML Picogreen 위해 함께 활성화 효과기 T 세포 AI4 스테인5 상온에서 분 페놀 레드없는 문화 중간 3 회와 함께 씻으십시오.

5. 라이브 셀 이미징을 사용하여 평가 T 림프구 - 중재 베타 세포를 파괴

  1. 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경의 무대에 스테인드 NIT 세포와 chambered의 coverglass를 탑재합니다. dremmel 및 가스 etheline 산화와 chambered 유리를 소독과 탭을 제거합니다. 무대는 온도 37 ° C 제어 및 5% 수분과 CO 2.이 살아있는 세포 이미징 챔버를 갖추고 있습니다
  2. 활성화 추가 및 다른 전자에서 지정 방으로 스테인드 T 세포 : T 비율.
  3. 제어 방으로 스테인드 Jurkat 세포의 같은 번호를 추가했습니다.

6. 라이브 셀 이미지를 얻기

현미경 우리가 반복 실험의 시간이 코스를 통해 자동으로 동일한 또는 다른 회의소와는 다른 위치에서 이미지를 얻기위한 허용 전동 무대를 갖추고 있습니다.

  1. 63x 오일 객관적인 렌즈를 사용하여, 위치 300 프레임의 총 매 3 분 간격으로 이미지를 가져가라.
  2. 방출 565-619 NM 위해 여기 파장 543 nm의 길이 및 필터 집합을 사용하여 TMRM의 염색법을 감지
  3. 자극 488 NM 및 방출 500-630 nm의에 대한 필터 설정을 사용하여 Picogreen의 얼룩을 감지합니다. 비디오 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다.

7. 게시를 위해 비디오 변환

  1. 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 AVI 포맷으로 압축되지 않은 동영상 파일을 만듭니다.
  2. 출판 형식으로 비디오를 변환하려면, 소프트웨어 패키지 피지 (로 동영상을 가져올 http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / 엘제이 / LOCI (에서 Bioformats 플러그인 사용) 배포 http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
  3. 녹색과 빨간색 신호와 프레임 속도는 애니메이션 옵션 메뉴를 사용하여 두 프레임 / 초로 설정되었습니다 균형을 밝기 및 대비 설정을 조정합니다.
  4. 압축되지 않은 AVI 파일로 512 X 512 픽셀과 수출하기 위해 동영상을 자르기.
  5. 소프트웨어 퀵타임 7 (애플 컴퓨터, 쿠퍼 티노, CA)에서이 AVI 파일을 열고 압축 및 1200 KBS / 초에서 열린 비디오 파일 형식 H264/MPEG-4으로 내보낼 수 있습니다.

8. 대표 결과 :

  1. 51 피크 CML 분석의 대표적인 결과. 대상 비율 (X 축) 증가 : 그림 1은 %의 구체적인 용해 (Y 축)는 효과기 증가 CML 분석의 대표 결과를 보여줍니다. 대상 세포 immunodeficient NOD으로부터 격리 기본 아일 레츠 아르 Rag1 - / -. 생쥐 51 피크로 표시. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 Splenocytes는 분리 단계 위의 2에서 설명한대로 활성화됩니다. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 위의 단계에서 설명한대로 3.11 %의 구체적인 용해가 계산됩니다.
  2. T 세포 - 매개 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 손실의 두 대표 (긍정적이고 부정적인) 결과가 표시됩니다. 세포가 묻은하고 반응은 4 단계, 5 이상 6 설명한대로 기록, 비디오 파일은 7 단계에서와 같이 만들어집니다. 비디오 1 : 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드되었습니다. 50:1의 비율 T : 활성화, CD8 + T autoreactive는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)를 E에서 이러한 NIT - 1 세포와 공동 교양되었습니다. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재력은 400 분 동안 점차 소산 기간,하지만 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 인치 비디오 2 : 제어 실험으로 NIT - 1 세포 TMRM 및 E에 Picogreen 스테인드 Jurkat 세포 공동 교양 물들일되었습니다 50:1의 비율 T. Jurkat 세포는 MHC 일치되는 인간의 T 세포 라인입니다. NIT - 1 세포가 공동 잠복기 400 분 전체 기간에 걸쳐 mitochondrial 막 잠재력을 유지. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서, 살인 유도하지 않습니다.

그림 1
그림 1 CML의 대표 결과가 immunodeficient NOD.Rag1 - / 격리 대상 세포 기본 아일 레츠로 사용 -. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 마우스 및 splenocytes. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 퍼센트 특정 용해는 효과기 증가 : 대상 비율이 증가합니다.

비디오 1. 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드했습니다. 활성 autoreactive CD8 + T는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)이 NIT - 1 E의 전지와 함께 공동 교양되었습니다 50:1의 비율 T. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재 dissipa테드는 점차 400 분 기간 동안,하지만 녹색 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 것은. 비디오를 볼하려면 여기를 클릭하십시오 .

비디오 1 Picogreen 스테인드 인간의 T 세포 라인 Jurkat 공동 양식에 설명된대로 동영상 2. NIT - 1 세포가 같은 얼룩되었습니다. NIT - 1 세포는 mitochondrial 막 잠재력 400분 기간을 생각을 유지할 수 있었다. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서 살인을 유발하지 않습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 - 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 - 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 ​​때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변화에 집중했다. Mitochondrial 막 잠재적인 소실은 apoptosis 8 이어지는 mitochondrial 기능 변경하는 동안 일찍 되돌릴 단계입니다. 공촛점 현미경 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 autoreactive T lymphocytes와 상호 작용하는 동안 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 소실을 시각화 수 있었다. 이 실험 설정은 T1D의 개발 기간 동안 베타 세포에 무슨 일이 일어 나는지 최소한 부분을 모방한 것이었 지요. 이 실험의 한계는 다음과 같습니다 : 우리 자이스 혈구 현미경을 갖춘 라이브 셀 이미징에 대한 가열 삽입은 랩 - 탁 II chambered coverglass (동시 처리의 기록 및 컨트롤), 손잡이 8 잘 사용하는 경우 따라서, 3.5 cm 배양 접시를 위해 설계되었습니다 chambered의 coverglass에 현미경의 삽입에 맞게하기 위해 제거되어야합니다. 또한, 우리는 8 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass를 사용하면 가열 삽입이 35mm 페트리 접시, 설계이기 때문에, 우리는 센터 4 우물로 제한했다. 이 제한은 쉽게 특별히 자이스 혈구의 랩 - 탁 II chambered coverglass위한 난방 삽입의 설치에 의해 해결될 수 있습니다. 대상 세포를 공격하는 유전자 형광 효과기 T 세포를 사용하거나, 크린 시토킨 또는 셀 세포 상호 작용의 신호 경로를 테스트를 포함하여이 실험의 가능성이 수정. T1D의 pathogenesis에서 베타 세포 죽음은, 복잡한 과정을 포함하여 여러 경로를 포함하지만, Granzyme 및 perforin 9 파 / 파 리간드 9 크린 시토킨 10에 국한되지 않습니다. caspases 및 상용 granzyme의 B에 대한 형광 기판이있다, 이러한 선택 사항은 경로와 베타 세포를 파괴하는 동안 이벤트의 순서를 연구하는 것이 가능합니다.

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Disclosures

동물 실험은 플로리다 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

Acknowledgements

이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cr-51 PerkinElmer, Inc. NEZ030500IMC
PBS Cellgro 21-040-60
Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) Invitrogen T668
Picogreen Invitrogen P7581
AI4 mimotope mimotopes.com amino acid sequence: YFIENYLEL
IL-2 R&D Systems 485-MI
DMEM Invitrogen 11885
FBS Hyclone SH30071.03
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8412
HEPES Cellgro 25-060-Cl
MEM Non-Essential Amino Acids GIBCO, by Life Technologies 11140
Penicillin/Streptomycin Gemini Bio Products 400-109
Phenol red-free DMEM Sigma-Aldrich D5303
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Inc. HeraCell 150i Kept sterile for cell culture
Biological safety cabinet Thermo Fisher Scientific, Inc. Forma 1440
Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass Fisher Scientific 14-958-A
Gamma Counter PerkinElmer, Inc. Wizard 1470 Automatic Gamma Counter
Confocal microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 510 Meta Confocal With motorized stage and live cell chamber
Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) Eppendorf
Tubes (Amber) Fisher Scientific 50819772
Centrifuge Sorvall, Thermo Scientific 75004377
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
Upright Microscope Carl Zeiss, Inc. Axioskop40
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice Jackson Laboratory 004347
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice Jackson Laboratory 004348
NOD-AI4α/ β F1 mice N/A N/A Bred in UF animal facility

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References

  1. Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
  2. Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. (2010).
  3. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  4. Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
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  6. Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. 235-240 (2001).
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