लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग siRNA मध्यस्थता जीन मुंह बंद के साथ संयुक्त Ca पहचानता 2 + ईआर झिल्ली में रिसाव चैनल और उनके विनियामक तंत्र

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

endoplasmic जालिका प्रोटीन और कैल्शियम homeostasis में biogenesis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हम एक प्रायोगिक प्रणाली है कि हमें सीए 2 + रिसाव चैनलों की भूमिका का पता करने के लिए अनुमति देता है और उनके ख्यात विनियामक तंत्र विशेषताएँ स्थापना की है. इस प्रणाली को siRNA की मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने और सेल रहते सीए 2 + इमेजिंग शामिल है.

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Lang, S., Schäuble, N., Cavalié, A., Zimmermann, R. Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730, doi:10.3791/2730 (2011).

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Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं में, endoplasmic जालिका (ईआर) प्रोटीन biogenesis में के रूप में अच्छी तरह के रूप में कैल्शियम एक संकेत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है . ईआर झिल्ली में heterotrimeric Sec61 जटिल ईआर के लुमेन में नव संश्लेषित polypeptides के लिए एक जलीय पथ प्रदान करता है. विभिन्न प्रयोगशालाओं से हाल ही में काम का सुझाव दिया है कि इस heterotrimeric जटिल भी क्षणिक 2 Ca + रिसाव चैनलों 2-8 फार्म का हो सकता है. इस धारणा के लिए महत्वपूर्ण अवलोकन ribosome और Sec61 जटिल द्वारा puromycin ईआर + 2 सीए के क्षणिक रिहाई के लिए सुराग से नवजात polypeptides कि रिलीज किया गया था. इसके अलावा, यह इन विट्रो में मनाया गया था कि ईआर luminal प्रोटीन बीप Sec61 जटिल 9,10 के स्तर पर आयन पारगम्यता को रोकने में शामिल है . हम एक प्रायोगिक प्रणाली है कि हमें सीधे संभावित Ca 2 + रिसाव चैनल के रूप में जटिल Sec61 की भूमिका का पता करने के लिए अनुमति देता है और अपनी ख्यात विनियामक तंत्र 11-13 विशेषताएँ स्थापना की है. इस प्रणाली को siRNA की मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने और सेल रहते Ca 2 + 13 इमेजिंग जोड़ती है. कक्ष siRNAs कि कोडिंग और untranslated क्षेत्र (UTR), क्रमशः, या SEC61A1 जीन की एक नकारात्मक नियंत्रण siRNA के खिलाफ निर्देशित कर रहे हैं के साथ व्यवहार कर रहे हैं. Complementation विश्लेषण में, कोशिकाओं एक वेक्टर IRES - GFP कि siRNA प्रतिरोधी wildtype SEC61A1 जीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट. फिर कोशिकाओं ratiometric 2 Ca + सूचक FURA-2 के साथ लोड कर रहे हैं साइटोसोलिक Ca 2 में एक साथ परिवर्तन + एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से कोशिकाओं की संख्या में एकाग्रता की निगरानी. साइटोसोलिक Ca 2 के निरंतर माप + भी अनुमति देता विभिन्न एजेंटों के प्रभाव, 2 + रिसाव Ca जैसे puromycin, छोटे अणु inhibitors, और thapsigargin का मूल्यांकन. यह प्रायोगिक प्रणाली हमें अद्वितीय अवसर देता है है मैं) अलग ईआर झिल्ली प्रोटीन के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, द्वितीय में ईआर से निष्क्रिय Ca 2 + तपका) योगदान का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटीन और तंत्र है कि यह निष्क्रिय 2 Ca सीमा तपका + विशेषताएँ, और iii) प्रासंगिक घटकों में रोग जुड़े परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन.

Protocol

1. शेयर समाधान की तैयारी

  1. तैयार कैल्शियम मुक्त बफर (140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिमी EGTA, 10 मिमी 10 मिमी HEPES KOH में ग्लूकोज (7.35 पीएच)).
  2. Solubilize FURA DMSO में 2 AM 1 मिमी शेयर समाधान प्राप्त है. एक भंवर का उपयोग कर जब तक समाधान homogenously हल्के पीले रंग की है मिक्स. प्रकाश से कप को सुरक्षित रखें. पतला FURA-2 एक मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) HELA कोशिकाओं की लोडिंग के लिए 4 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त में शेयर समाधान AM.
  3. आसुत जल (7.0 पीएच) में 12.5 मिमी puromycin शेयर समाधान तैयार है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots पतला 12.5 मिमी कैल्शियम मुक्त बफर में puromycin शेयर 500 सुक्ष्ममापी puromycin के अंतिम एकाग्रता का हल.
  4. DMSO में thapsigargin भंग करने के लिए 1 मिमी स्टॉक समाधान प्राप्त.
  5. 1 मिलीग्राम 20 μl क्लोरोफॉर्म में एक और, बाद में, 25 μl DMSO के साथ मिश्रण ophiobolin solubilize. microcentrifuge ट्यूब खुला रहता है जब तक क्लोरोफॉर्म सुखाया है. इस प्रकार अंतिम ophiobolin एकाग्रता 100 मिमी है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots पहले का उपयोग करें, कैल्शियम मुक्त बफर में शेयर 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता समाधान जलमिश्रित. इस प्रकार, जीना सेल इमेजिंग के लिए अंतिम DMSO एकाग्रता 0.1% से अधिक नहीं करता है.
  6. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिमी और दुकान aliquots के एक एकाग्रता के लिए DMSO में trifluoperazine भंग कैल्शियम मुक्त बफर में शेयर समाधान पहले 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता उपयोग करने के लिए पतला. इस प्रकार जीना सेल इमेजिंग के लिए अंतिम DMSO एकाग्रता, ophiobolin एक के लिए की तरह, 0.1% से अधिक नहीं करता है.
  7. SiRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA और नियंत्रण siRNA) RNase मुफ्त पानी में भंग करने के लिए एक 20 सुक्ष्ममापी शेयर समाधान तैयार है . एक भंवर का उपयोग मिक्स और आंख से solubilization निरीक्षण. स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 μl aliquots

2. HELA कोशिकाओं में जीन मुंह बंद

आदेश में एक खास प्रोटीन के ईआर Ca 2 + तपका के लिए अपने योगदान के अध्ययन के लिए, संबंधित जीन कुशलता से दो अलग अलग siRNAs (1 छवि) के साथ खामोश हो गया है. इसके अलावा, मुंह बंद करने के प्रभाव के लिए संबंधित जंगली प्रकार के जीन की अभिव्यक्ति से दूर हो गया है. आमतौर पर हम siRNAs कि कोडन और गैर कोडन क्षेत्र (UTR), हित के जीन की क्रमशः के खिलाफ निर्देशित कर रहे हैं का उपयोग करें. UTR निर्देश siRNA रोजगार complementation के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है.

  1. 5.2 बीज x 10 5 एक 25 मिमी कवर पर्ची पर (1 ज के लिए 200 पाली - एल lysine (1 मिलीग्राम / एमएल) की μl के साथ पूर्व इलाज) के साथ एक 6 सेमी संस्कृति डिश में HELA कोशिकाओं (ATCC नहीं. सीसीएल -2) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2 (अंतिम मात्रा 3.9 मिलीलीटर) के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1 पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 37% और सेते डिग्री सेल्सियस में .
  2. SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA, या एक नकारात्मक नियंत्रण के निर्माता के निर्देशों (: 20 एनएम siRNA के अंतिम एकाग्रता) के अनुसार HiPerFect अभिकर्मक का उपयोग कर siRNA के साथ कोशिकाओं transfect. संक्षेप में, siRNAs हौसले से एक अलग microcentrifuge ट्यूब में वास्तविक अभिकर्मक प्रक्रिया के लिए पहले तैयार: 20 μl HiPerFect अभिकर्मक अभिकर्मक प्रत्येक siRNA के 4 μl (20 सुक्ष्ममापी) कि OptiMEM के 80 μl में भंग कर रहा है जोड़ें. इस मिश्रण धीरे और vortexed है और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated. SiRNA (104 μl) मिश्रण वरीयता प्राप्त 5.2 x 10 5 HELA कोशिकाओं (3.9 मिलीलीटर) के लिए dropwise जोड़ें.
  3. 24 घंटे के बाद, मध्यम (3.9 मिलीलीटर) और एक ही siRNA मिश्रण (104 μl) के साथ एक दूसरी बार के लिए कोशिकाओं transfect.
  4. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मुंह बंद मूल्यांकन. यह 80% से ऊपर होना चाहिए. में सेल संस्कृति डिश कोशिकाओं से धो खारा (पीबीएस) फॉस्फेट buffered और उन्हें DMEM में फसल. काउंटेस स्वचालित सेल काउंटर रोजगार से कोशिकाओं की गणना. सेल lysis बफर में कोशिकाओं lyse (10 मिमी NaCl, 10 Tris - एचसीएल, पीएच 8.0 मिमी, 3 मिमी 2 MgCl, 0,5 NP40%) एक कॉकटेल protease अवरोध करनेवाला (3 μg / एमएल Pepstatin ए, 3 μg / के साथ पूरक मिलीलीटर Leupeptin, 3 μg / मिलीलीटर Antipain, 3 μg / Chymastatin मिलीलीटर) और एसडीएस नमूना बफर (के साथ मिश्रण Tris - एचसीएल 60 मिमी, 6.8 पीएच, एसडीएस 2%, 10% ग्लिसरॉल, 5% β-mercaptoethanol, 0.01% नीले bromphenol ) 10.000 कोशिकाओं / μl के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए. हीट नमूने 56 पर ° 15 मिनट के लिए सी और बाद में, टुकड़ा डीएनए के लिए कुछ glas माला और 20 मिनट के लिए भंवर जोड़ने. एक Laemmli प्रकार एसडीएस PAGE (आमतौर पर 15% अलग जेल के लिए polyacrylamid) द्वारा अलग 20 प्रत्येक नमूना के μl. एक PVDF झिल्ली पर लगातार 400 मा पर ("गीला धब्बा") 3 घंटे या स्थानांतरण बफर में रात में (100 Glycin मिमी, 12.5 मिमी Tris - एचसीएल) के लिए electroblotting से अलग प्रोटीन स्थानांतरण. बाद में, 5% (w / v) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कम वसा पीबीएस में सूखे दूध और तब के साथ ब्लॉक प्राथमिक खरगोश से Sec61α सी टर्मिनस के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के दाग को बेनकाब और एक विरोधी β-actin माउस से एंटीबॉडी. पीबीएस - TritonX-100 में दाग धो (0.05%) और टीपीबीएस में 5 मिनट के लिए क्रमशः wice,. ईसीएल Plex बकरी विरोधी खरगोश का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी कल्पना आईजीजी Cy5 या ईसीएल Plex बकरी विरोधी माउस आईजीजी - Cy3 संयुग्म और आंधी तिकड़ी के साथ संयोजन छवि क्वांट TL सॉफ्टवेयर 7.0 में इमेजिंग प्रणाली. SEC61A1 जीन के मामले में, अधिकतम मुंह बंद प्रभाव आम तौर पर पहली अभिकर्मक के बाद 96 घंटे देखा. एक प्रतिनिधि प्रयोग छवि में दिखाया गया है. 2.

3. HELA कोशिकाओं के complementation

आदेश में SEC61A1 मुंह बंद करने के phenotype बचाव करने के लिए, SEC61A1 सीडीएनए pCDNA3 आंतरिक ribosomal प्रविष्टि साइट के एकाधिक क्लोनिंग (एमसीएस) साइट (IRES) GFP वेक्टर कि cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर, एमसीएस निहित में डाला गया था, IRES, प्लस हरी fluoresecent प्रोटीन (GFP) अनुक्रम कोडन.

  1. पहली siRNA अभिकर्मक के बाद 48 घंटे, मुद्रा (3.9 मिलीलीटर) एक दूसरी बार के लिए मध्यम और या तो खाली वेक्टर या SEC61A1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति निर्माता प्रोटोकॉल (वेक्टर के अंतिम Fugene एच.डी. अनुपात 4 μg के अनुसार Fugene एच.डी. का उपयोग के साथ कोशिकाओं को बदलने 16 μl Fugene एच.डी. वेक्टर). संक्षेप में, plasmids हौसले से एक अलग microcentrifuge ट्यूब में परिवर्तन प्रक्रिया से पहले तैयार: प्रत्येक प्लाज्मिड कि OptiMEM के 80 μl में भंग कर रहा है 4 μg 16 μl Fugene HD परिवर्तन अभिकर्मक जोड़ें. धीरे भंवर इस मिश्रण और 10 मिनट के लिए सेते कमरे के तापमान पर. प्लाज्मिड मिश्रण (0.1 मिलीलीटर) 5.2 वरीयता प्राप्त करने के लिए dropwise x 10 5 HELA कोशिकाओं (3.9 मिलीलीटर) जोड़ें.
  2. प्लाज्मिड अभिव्यक्ति, कैल्शियम इमेजिंग और कटाई के लिए पूर्व प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अधीन संस्कृति व्यंजन के 48 घंटे के बाद. पीबीएस द्वारा बेहतर प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए यदि आवश्यक हो DMEM जगह. एक प्रतिदीप्ति ठंडा सीसीडी कैमरे के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर प्रतिदीप्ति छवियों को रिकार्ड. परिवर्तन दक्षता brightfield मोड में गिना और 80% से ऊपर होना चाहिए कोशिकाओं द्वारा GFP प्रतिदीप्ति प्रदर्शित कोशिकाओं की संख्या में विभाजित करके निर्धारित किया जा सकता है. एक ठेठ परिणाम छवि में दिखाया गया है. 3.

4. लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग

  1. माप के लिए पहले, एक अलग 3.5 सेमी संस्कृति डिश में ट्रांसफ़ेक्ट HELA कोशिकाओं के साथ लेपित कवर पर्ची हस्तांतरण. 4 सुक्ष्ममापी FURA 25 ° सी अंधेरे 11,12 में 45 मिनट के लिए 2 1 मिलीलीटर DMEM AM साथ कोशिकाओं लोड .
  2. फिक्स iMIC धातु कक्ष में एक 25 मिमी कवर पर्ची और कोशिकाओं को दो बार धोने और एक कैल्शियम मुक्त बफर (हर बार 300 μl) में सेते हैं.
  3. एकांतर से 340 एनएम और 380 एनएम पर रोमांचक द्वारा एक विचित्र वी के साथ iMIC खुर्दबीन पर डेटा इकट्ठा करने और 510 एनएम (beamsplitter, emitter, 605/70 एनएम: 565 एनएम फ़िल्टर सेट) में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति मापने शुरू करो. नमूना युक्त 20-50 कोशिकाओं / फ्रेम हर 3 एस छवियों F340/F380 अनुपात, जहां F340 और F380 340 और 380 एनएम में पृष्ठभूमि घटाया प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुरूप है, क्रमशः के रूप में कीर्तिमान FURA 2 संकेतों.
  4. 1 मिनट के बाद, कैल्शियम मुक्त बफर में या एक ही बफर के साथ puromycin के साथ कोशिकाओं (500 सुक्ष्ममापी) का इलाज. वैकल्पिक रूप से, एक छोटा सा अणु अवरोध करनेवाला (जैसे 10 सुक्ष्ममापी trifluoperazine या 100 सुक्ष्ममापी ophibolin एक के रूप में) के साथ या कैल्शियम से मुक्त बफर के साथ कोशिकाओं का इलाज.
  5. Ratiometric माप के बाद 2 या 10 मिनट के लिए बाहर किया जाता है, thapsigargin जोड़ने (1 सुक्ष्ममापी) और जारी रखने के माप.
  6. आखिरकार, cytoslic [ca 2 +] अनुपात माप से एक की स्थापना की अंशांकन विधि द्वारा अनुमान है. 2 Excel 2007 और 6.1 उत्पत्ति द्वारा डेटा विश्लेषण.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

अब तक, हम कि SEC61A1 जीन का मुंह बंद कैल्शियम को प्रभावित करता है के प्रश्न (2 Ca +) ईआर (छवि 1) से रिसाव को संबोधित किया. SEC61A1 जीन 96 घंटे के लिए HELA कोशिकाओं में दो अलग अलग siRNAs द्वारा खामोश था. जबकि शायद ही प्रभावित सेल के विकास और व्यवहार्यता मुंह बंद, अर्द्ध permeabilized कोशिकाओं के ईआर में प्रोटीन परिवहन लगभग पूरी तरह से हिचकते हैं. इसके अलावा, SEC61A1 खामोश कोशिकाओं Ca ईआर से 2 + रिसाव के लिए सम्मान के साथ बुरी तरह प्रभावित हुए थे . मुंह बंद जीन के प्रभाव SEC61A1 जीन की अभिव्यक्ति से उलट था. इस प्रकार, Sec61 परिसरों कि सभी nucleated कोशिकाओं के ईआर झिल्ली में मौजूद हैं Ca 2 + रिसाव चैनलों कि 2 CA में एक महत्वपूर्ण भूमिका + homeostasis खेलने के लिए उम्मीद की जा सकती के रूप में. हालांकि, बड़े, अनियंत्रित आयन पारगम्यता के साथ पानी भरा pores, के रूप में ईआर झिल्ली में Sec61 परिसरों द्वारा गठित की उपस्थिति, गंभीरता + ईआर लुमेन से cytosol, intracellular के लिए एक आवश्यक तंत्र में 2 Ca विनियमित रिलीज के साथ हस्तक्षेप करेगा संकेतन. हम साइटोसोलिक स्तनधारी Sec61α एन टर्मिनस में calmodulin (सीएएम) बाध्यकारी आकृति की पहचान की है कि बाध्य कैम लेकिन नहीं Ca 2 nanomolar आत्मीयता और अनुक्रम विशिष्टता के साथ + मुक्त apocalmodulin. सेलुलर स्तर पर, दो अलग अलग कैम गरम Ca प्रेरित (4 और 5 अंजीर) के अभाव में नहीं उपस्थिति में ईआर से जारी. बाद जब Sec61 चैनलों उपस्थित थे कि Sec61α की बुद्धि आकृति में परिवर्तन निहित नहीं मनाया गया. इस प्रकार, 2 Ca + कैम सीमित Ca 2 + ईआर (छवि 6) से रिसाव में शामिल है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रवाह चार्ट. विवरण के लिए पाठ देखें.

चित्रा 2
चित्रा 2 दक्षता मुंह बंद करने के लिए डेटा विश्लेषण. मुंह बंद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग एंटीबॉडी कि Sec61α और β-actin लोड हो रहा है (नियंत्रण) के खिलाफ निर्देशित थे द्वारा मूल्यांकन किया गया था. प्राथमिक एंटीबॉडी ईसीएल Plex माध्यमिक एंटीबॉडी और प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके कल्पना थे.

चित्रा 3
चित्रा 3 अभिकर्मक दक्षता के लिए डेटा विश्लेषण. छवियाँ एक प्रतिदीप्ति ठंडा सीसीडी कैमरे के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर दर्ज किया गया. परिवर्तन दक्षता brightfield मोड में गिना कोशिकाओं द्वारा GFP प्रतिदीप्ति प्रदर्शित कोशिकाओं की संख्या में विभाजित करके निर्धारित किया जा सकता है.

चित्रा 4
चित्रा 4 स्क्रीन शॉट्स से नियंत्रण या SEC61A1 siRNA और कैम प्रतिपक्षी ophiobolin ए HELA कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति की मौजूदगी में HELA कोशिकाओं के सेल रहते कैल्शियम इमेजिंग SEC61A1 (बी) या एक के खिलाफ निर्देशित siRNA साथ इलाज किया गया नकारात्मक नियंत्रण siRNA (ए) 96 घंटे के रूप में संकेत दिया. इन कोशिकाओं में कैल्शियम सूचक AM FURA-2 के साथ भरी हुई थी और एक 2 Ca में incubated + मुक्त बफर बफर में 0.5 मिमी EGTA, तो बफर या ophiobolin एक (एक Ophio) युक्त जोडी था और ऊष्मायन फिर से शुरू. 10 मिनट के बाद, Ca 2 + रिलीज बाहरी Ca 2 के अभाव में thapsigargin (टीजी) लागू करने के द्वारा शुरू किया गया था + और ​​ऊष्मायन जारी रखा गया . निरंतर कैल्शियम इमेजिंग से स्क्रीन शॉट्स संकेत समय पर लिया गया.

चित्रा 5
चित्रा 5 लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए डेटा विश्लेषण. (ए) के रूप में छवि में दिखाया गया प्रयोगों की एक श्रृंखला के काइनेटिक और मात्रात्मक विश्लेषण. 4A. Cytoslic [2 Ca +] एक स्थापित अंशांकन 2 विधि द्वारा माप के अनुपात से अनुमान लगाया था. thapsigargin के प्रभाव दंड चित्र के रूप में दिखाया गया है. कक्ष (बी) नियंत्रण या 48 घंटे के लिए siRNA संकेत SEC61A1 - siRNA के साथ इलाज किया गया और तब या तो नियंत्रण वेक्टर (सी), या प्लाज्मिड अभिव्यक्ति SEC61A1 (सी), या उत्परिवर्ती SEC61A1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति (डी) के रूप में इंगित के साथ बदल. के बाद 48 घंटे, कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों से बाहर किए गए के रूप में 4 और 5A अंजीर . साइटोसोलिक Ca 2 में परिवर्तन के सांख्यिकीय विश्लेषण + में प्रस्तुत एक दिखाया जैसे प्रयोगों में thapsigargin के अलावा के बाद एकाग्रता . पी मूल्यों 0.001 <unpaired टी परीक्षण द्वारा महत्वपूर्ण के रूप में परिभाषित किया गया और तीन (***), तारांकनों एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है के द्वारा संकेत कर रहे हैं. कोशिकाओं है कि विश्लेषण किया गया की संख्या का संकेत कर रहे हैं. औसत मान दिया जाता है, त्रुटि सलाखों अर्थ है (sem) के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम ध्यान दें कि इन उदाहरणों रेफरी से अनुकूलित किया गया है. 13.

चित्रा 6
चित्रा 6 इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि Sec61 जटिल से नवजात चेन की रिहाई वास्तव में ईआर और Sec61 परिसर के साइटोसोलिक मुँह के चारों ओर एक कैल्शियम nanodomain के गठन से कैल्शियम की रिहाई के लिए जाता है. यह कैल्शियम calmodulin से बाध्य है और कैल्शियम calmodulin Sec61 जटिल बंद कर देता है. "

Discussion

स्तनधारी कोशिकाओं में, endoplasmic जालिका (ईआर) प्रोटीन biogenesis में के रूप में अच्छी तरह के रूप में कैल्शियम संकेतन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यहाँ, हम एक प्रायोगिक प्रणाली है कि हमें सीधे एक संभावित Ca 2 + रिसाव चैनल की भूमिका का पता करने के लिए अनुमति देता है और अपने ख्यात विनियामक 13 तंत्र विशेषताएँ वर्णित है. यह प्रायोगिक प्रणाली हमें अद्वितीय अवसर देता है है मैं) अलग ईआर झिल्ली प्रोटीन के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, द्वितीय में ईआर से निष्क्रिय Ca 2 + तपका) योगदान का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटीन और तंत्र है कि यह निष्क्रिय 2 Ca सीमा तपका + विशेषताएँ, और iii) प्रासंगिक घटकों में रोग जुड़े परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन.

हम केवल व्यवहार्य कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाना चाहिए ध्यान दें कि समग्र व्यवहार्यता 80% से ऊपर होना चाहिए. इसलिए, सेल व्यवहार्यता नियमित निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार परमाणु आईडी / नीले हरे सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक काम करने के लिए मूल्यांकन किया जाता है. इसके अलावा, साइटोसोलिक Ca 2 में परिवर्तन के सांख्यिकीय विश्लेषण + एकाग्रता अनिवार्य है. इसलिए, प्रयोगों कोशिकाओं के चार अलग अलग बैचों और दो coverslips के लिए बाहर किया जा के साथ कम से कम 20 कोशिकाओं को एक ही प्रयोग में प्रत्येक शर्त के लिए विश्लेषण किया है. हम ध्यान दें कि विभिन्न प्रयोगों के लिए कवर फिसल जाता है पर बोने के बाद एक ही समय में बाहर किया जा है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

SL DFG (ग्रेजुएट रिसर्च स्कूल 845) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था. इस काम DFG (SFB 530/C1 और 967 के लिए) से अनुदान द्वारा और HOMFOR के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM+GlutaMAX Invitrogen 31966
OptiMEM+GlutaMAX Invitrogen 51985
FBS Biochrom AG S0115
Penicillin/ Streptomycin PAA Laboratories P11-010
HiPerFect Qiagen 301707
Fugene HD Roche Group 04709713
Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent Enzo Life Sciences ENZ-53004
FURA-2 AM Invitrogen F-1221
Puromycin Sigma-Aldrich P 7255
Thapsigargin Invitrogen T-7459
Ophiobolin A Enzo Life Sciences ALX-270-109
Trifluoperazine Sigma-Aldrich T 6062
Countess® Automated Cell Counter Invitrogen
Typhoon-Trio imaging system GE Healthcare
TE2000-S microscopewith DS-5Mc camera Nikon Instruments
iMIC microscope with polychrome V Till Photonics

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References

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