Elektrolytische Inferior Vena Cava Model (EIM) von Venenthrombosen

Medicine
 

Summary

Die elektrolytische Induktion der endothelialen Aktivierung der inneren Oberfläche der Inferior Vena Cava Ergebnisse im venösen Typ Thrombusbildung durch eine endotheliale Aktivierung und teilweisen Blut-Stase, zwei Komponenten der Virchow-Trias.

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Diaz, J. A., Wrobleski, S. K., Hawley, A. E., Lucchesi, B. R., Wakefield, T. W., Myers, Jr., D. D. Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis. J. Vis. Exp. (53), e2737, doi:10.3791/2737 (2011).

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Abstract

Tiermodelle dienen eine wichtige Rolle in tiefe Venenthrombose (DVT) Forschung, um Thrombenbildung Thrombus Auflösung zu untersuchen und mögliche therapeutische Verbindungen (1) zu testen. Neue Verbindungen in der Behandlung und Prävention von TVT ausgenutzt werden derzeit entwickelt. Die Auslieferung der potenziellen therapeutischen Antagonist Verbindungen an ein betroffenes thrombosierten Vene wurde problematisch. Im Rahmen der therapeutischen Anwendungen, ein Modell, das partielle Stasis nutzt und konsequent erzeugt Thromben innerhalb einer großen Vene wurde vor kurzem gegründet. Die elektrolytische Inferior Vena Cava Model (EIM) ist Mausmodell der DVT, dass Thrombusbildung in Gegenwart von kontinuierlichen Blutfluss ermöglicht. Dieses Modell erlaubt Therapeutika in Kontakt mit dem Thrombus in einer dynamischen Art und Weise sein, und ist empfindlicher als andere Modelle der DVT (1). Darüber hinaus dieses Thrombose-Modell eng simuliert klinische Situationen der Thrombusbildung und ist ideal, um venöse Endothelzellaktivierung, Leukozytenmigration, venösen Thrombosen, zu studieren und therapeutischen Anwendungen (1) zu testen. Die EIM-Modell ist technisch einfach, leicht reproduzierbar, schafft einheitliche Thromben Größen und ermöglicht einer großen Stichprobe (dh Thrombus und Venenwand), die für analytische Zwecke erforderlich ist.

Protocol

1. Maus Anästhesieverfahren

  1. Die Tiere sind aus ihrem Käfig genommen und in ein Betäubungsmittel präoperativen Induktion Kammer für Gas Induktion mit 2% Isofluran und 100% Sauerstoff mit einer Flussrate von 0,5 Liter pro Minute (Verdampfer gesteuert).
  2. Mäuse sind in der Narkoseeinleitung Kammer sediert, entfernt von Kammer-und der ventralen Bauch ist mit elektrischen Haarschneider rasiert, gepflegt oder in der Kammer, wenn ein Haar Enthaarungsmittel verwendet wird (1 min).
  3. Noch unter Sedierung, sie wogen, werden die Augen mit einer sterilen Augensalbe und dann in Rückenlage recumbancy an einem warmen Wasser zirkuliert Heizgerät gelegt unter Vollnarkose mit einer Nase Konus mit Isofluran und Sauerstoff geschmiert. An diesem Punkt der Sauerstoffmenge auf 0,2 Liter pro Minute reduziert.
  4. Der Bauch ist mit Chlorhexidin-Lösung besprüht (Chlorhexidindiacetat schnell bacterialcidal und persistent) und wischte sich mit steriler Gaze dreimal oder bis zum OP-Gebiet ist sauber.

2. Maus Micro-chirurgischen und Recovery-Verfahren

  1. Ein ventralen Mittellinie Schnitt (2 cm) ist mit Iris Schere durch die Haut und Bauchwand Freilegung der Bauch gemacht. Ein steriler Kochsalzlösung getränkt 2x2 in Gaze wird verwendet, um den Darm des Tieres linken Seite widerspiegeln. Eine Maus restrainer ist in Ort ermöglicht die Visualisierung der unteren Hohlvene (IVC) setzen.
  2. An diesem Punkt ist die Isofluran zu einer Wartung Niveau von 2% reduziert und der Sauerstoff bleibt bei 0,2 Liter pro Minute für den Rest des chirurgischen Eingriffs.
  3. Stumpfe Präparation wird erleichtert, mit einem sterilen Tupfer Applikator und extra zarte Iris halbgebogen Gewebe Zange. Es muss im Umgang mit Maus Gewebe für sie äußerst fragil eingenommen werden.
  4. Alle IVC Seitenäste, von der Nierenvenen der iliakalen Bifurkation, werden mit 7-0 nicht-reaktiven Prolene Fäden ligiert. Zurück Niederlassungen blieb Patent.
  5. Bei der elektrolytischen IVC-Modell (EIM), eine 25G Edelstahl-Nadel, die an einer versilberten Kupferdraht (KY-30 bis 1-GRN, Electrospec, Dover, NJ) in der exponierten caudal IVC, (Abbildung 1) eingefügt und gegen die vordere Wand (Anode) positioniert.
  6. Ein weiterer Draht wird subkutan implantiert Abschluss der Schaltung (Kathode).
  7. Ein Strom von 250 μAmps über 15 Minuten wurde mit einem Grass S48 Rechtecksignal Stimulator und ein konstanter Strom-Einheit (Grass Technologies, ein Astro-Med, Inc., West Warwick, RI). Der Gleichstrom führt zur Bildung von toxischen Produkten der Elektrolyse, dass die Endothel-Oberfläche des IVC zur Förderung einer thrombogenen Umwelt und nachfolgende Thrombusbildung erodieren.
  8. Nach 15 Minuten wird die Nadel entfernt und ein Wattestäbchen wird sanft in Kontakt mit der Umgebung, um die Blutung zu verhindern statt
  9. In sham Tieren ist die Nadel in die IVC gelegt und dann entfernt, ohne Anwendung des Stroms.
  10. Die Laparotomie Website wird in einem Zwei-Schicht verschlossen. Unser Labor verwendet 5-0 Vicryl, ein synthetisches Nahtmaterial, in einem kontinuierlichen Muster, um die Bauchdecke zu schließen. Adhesive Hautleim wird verwendet, um die Haut zu schließen. Es gibt keine externen Nähte für die Herausnahme.
  11. Mäuse werden dann in einer individuellen Maus Käfig wieder, dicht postoperativ (45 Minuten bis 2 Stunden) unter einer Wärmelampe (min Abstand 24 cm entfernt von Käfig) beobachtet, dann wieder an ihren ursprünglichen Wohneinheiten. Schmerzmittel und entzündungshemmende Mittel können verwendet werden, wenn sie nicht mit Studienziel nicht stören. Wissenschaftliche Begründung für Schmerzmittel vorenthalten, Veterinär-und ICUCA Genehmigung erforderlich sind. Unser Labor hat festgestellt, dass Buprenorphin ,0.05-0 .1 mg / kg SQ ein ausgezeichnetes pre-und post-operative Analgetikum für Mäuse ist. Darüber hinaus kann Lidocain bei 4mg/kg (0,4 ml / kg einer 1% igen Lösung) in die Inzisionsstelle infundiert werden, wenn systemische Analgetika können experimentelle Ergebnisse zu verwechseln.
  12. Wir in der Regel nicht erleben postoperativen Beeinträchtigungen durch DVT. Allerdings können negative post-operative Effekte sind spontane Anästhesie Tod, chirurgische Blutverlust und partielle Parese aufgrund Nerventrauma. Tiere, die nur langsam regenerieren können eingespeist Nutria Gel oder feuchten chow auf dem Boden des Käfigs, das Tier die Genesung zu erleichtern platziert. Tiere mit sever postoperative Komplikationen human eingeschläfert werden.
  13. Am zugewiesen Zeitpunkt ist die Euthanasie menschlich in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der American Veterinary Medical Association Richtlinien zur Euthanasie für Nager gesetzt durchgeführt.

3. Repräsentative Ergebnisse

Die EIM ist ein Modell, Thrombus bildet in Gegenwart von kontinuierlichen Blutfluss. Die folgenden Abbildungen zeigen Parameter in diesem Roman Modell untersucht.

Abbildung 1
Abbildung 1 definesthe anatomischen Bereich in dem ein 25G EdelstahlNadel, an einem versilberten Kupferdraht (KY-30 bis 1-GRN, Electrospec, Dover, NJ) eingesetzt wird. Beachten Sie, dass ein Lymphknoten fast vorhanden ist und hilft als ein Wahrzeichen der kaudalen IVC zu finden.

Abbildung 2
Abbildung 2: Thrombus Gewicht von 2 Tagen nach EIM in verschiedene Stämme. Wie erwartet, war Thrombusgewichts niedriger PAI-1 KO-Mäuse und größere in Hyperkoagulabilität Delta CT-Mäuse (^ CT).

Abbildung 3
Abbildung 3: Löslich P-Selektin, einem Hersteller für tiefe Venenthrombose, wurde in verschiedenen Stämmen gemessen. Die niedrigsten Werte wurden in PAI-1 KO Mäusen gefunden, während die höchsten in Hyperkoagulabilität delta CT-Mäusen gefunden wurden.

Abbildung 4
Abbildung 4 Zusammenhang zwischen Thrombus Gewicht und löslichen P-Selektin wurde in verschiedene Stämme gefunden. Zu beachten ist, in die Gruppe, desto kürzer Thrombus Größe erzeugt, wurde das lösliche P-Selektin nachgewiesen dem niedrigsten (PAI-1 KO-Mäuse). In der Gruppe, der größte Thrombus Größe erzeugt, wurde das lösliche P-Selektin erkannt höchsten (Hyperkoagulabilität delta CT).

Abbildung 5
Abbildung 5: Um die Anwesenheit von Blut fließen zu demonstrieren, Ultraschall wurde in Mäusen unterziehen EIM durchgeführt. Abbildung 5 zeigt die Ultraschall in einem Maus-2 Tage nach EIM durchgeführt. Dann wurde die Probe zu ernten. Beachten Sie die, dass der Thrombus Form Thrombusbildung schlage in Anwesenheit von Flow

Discussion

Die Maus ist eine hervorragende Recherche-Tool für in vivo-Experimente. So sind die Entwicklung von Mausmodellen, die genau imitieren Krankheiten oder pathologischen Bedingungen notwendig. Mehrere Venenthrombose Mausmodellen wurden verwendet, um DVT einschließlich Studie: photochemische (2), Stase (3-4) und mechanisches Trauma (5-6). Allerdings verwenden keines dieser Modelle eine interne endothelial Reiz Thrombus in Gegenwart von kontinuierlichen Blutfluss erzeugen. Die EIM, mit Elektrolyt-Stimulus in der IVC, fördert den venösen Thrombosen durch endotheliale Aktivierung in Gegenwart des Blutflusses (1). Es ist technisch einfach, leicht reproduzierbar und hat eine hohe Überlebensrate (99%). Trotz der Tatsache, dass ein elektrischer Strom verwendet wird, um die Elektrolyse zu schaffen, wird die Wärme nicht erzeugt (1). Die EIM-Modell eng simuliert klinische DVT, und dient daher als ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der inneren Mechanismen der Thrombusbildung und Auflösung. Die EIM-Modell ist auch für die Weiterentwicklung neuer Therapieansätze gegen Thrombose Krankheit nützlich.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Unterstützt durch NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Animal-Core A, NIH 1 K01 HL080962-01A2 (Myers, PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

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References

  1. Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
  2. Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
  3. Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
  4. Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
  5. Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
  6. Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).

Comments

2 Comments

  1. "After 15 minutes, the needle is removed and a cotton swab is held gently in contact with the area to prevent bleeding. "
    How about bleeding in the PAI mice group?

    In sham animals, the needle is placed into the IVC and then removed, without application of the current.
    How many minutes keep the needle in IVC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:19 PM
  2. No bleeding was observed in PAI-1 KO mice.
    In order to mimic the experimental group, a needle was placed within the IVC for 15 minutes, without current administration in shams.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:48 PM

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