Eletrolítico Veia Cava Inferior Model (EIM) de trombose venosa

Medicine
 

Summary

A indução eletrolítico de ativação endotelial na superfície interna da Vena Cava Inferior resultados na formação venosa tipo trombo devido à ativação endotelial e parciais a estagnação do sangue, dois componentes da tríade de Virchow.

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Diaz, J. A., Wrobleski, S. K., Hawley, A. E., Lucchesi, B. R., Wakefield, T. W., Myers, Jr., D. D. Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis. J. Vis. Exp. (53), e2737, doi:10.3791/2737 (2011).

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Abstract

Modelos animais desempenham um papel vital na pesquisa trombose venosa profunda (TVP), a fim de estudar a formação de trombo resolução, trombo e para testar potenciais compostos terapêuticos (1). Novos compostos para serem utilizados no tratamento e prevenção de TVP estão sendo desenvolvidos atualmente. A entrega do potencial antagonista de compostos terapêuticos para uma veia afetada thrombosed tem sido problemática. No contexto de aplicações terapêuticas, um modelo que usa parcial estase e consistente gera trombos dentro de uma veia importante foi recentemente estabelecida. O Eletrolítico veia cava inferior Model (EIM) é o modelo do rato de TVP que permite a formação de trombos na presença de fluxo de sangue contínuo. Este modelo permite que os agentes terapêuticos para estar em contato com o trombo de forma dinâmica, e é mais sensível do que outros modelos de TVP (1). Além disso, este modelo de trombose simula situações clínicas de formação de trombos e é ideal para estudar venosa ativação da célula endotelial, migração de leucócitos, trombogênese venosa, e para testar aplicações terapêuticas (1). O modelo de EIM é tecnicamente simples, facilmente reprodutível, cria tamanhos consistentes trombos e permite uma grande amostra (ie trombo e parede da veia) que é necessário para fins analíticos.

Protocol

1. Anestesia Procedimentos do mouse

  1. Os animais são removidos de suas gaiolas e colocados em uma câmara de indução anestésica pré-operatória para a indução de gás em isoflurano a 2% e 100% de oxigênio a uma vazão de 0,5 litros por minuto (vaporizador controlada).
  2. Os ratos são sedados na câmara de indução anestésica, removido da câmara e do abdômen ventral é raspada com tosquiadeiras elétricas, ou mantidos dentro da câmara se um creme depilatório cabelo é usado (1 min).
  3. Enquanto ainda sob sedação, eles são pesados, os olhos são lubrificados com pomada oftálmica estéril e, em seguida, colocado em recumbancy dorsal em um dispositivo de aquecimento de água quente circulando sob anestesia geral com um cone de nariz usando isoflurano e oxigênio. Neste ponto, a taxa de oxigênio é reduzida para 0,2 litros por minuto.
  4. O abdômen é pulverizado com solução de clorexidina (diacetato de clorexidina é rapidamente bacterialcidal e persistente) e limpo com gaze estéril ou até três vezes o local da cirurgia está limpo.

2. Rato Micro-cirúrgico e procedimentos de recuperação

  1. A incisão mediana ventral (2 cm) é feita com tesoura de íris através da pele e parede abdominal expondo o abdome. Um 2x2 salina estéril embebido em gaze é usada para refletir os intestinos para o lado esquerdo do animal. Um limitador do mouse é colocado no lugar permitindo a visualização da veia cava inferior (VCI).
  2. Neste ponto, o isoflurano é reduzida a um nível de manutenção de 2% ea taxa de oxigênio permanece em 0,2 litros por minuto para o restante do procedimento cirúrgico.
  3. Dissecção romba é facilitada utilizando um cotonete aplicador estéril e extra delicadas meia íris pinça curva. Cuidados devem ser tomados no manuseio do mouse para tecidos que são extremamente frágeis.
  4. Todos os ramos laterais IVC, a partir das veias renais até a bifurcação ilíaca, estão ligados com 7-0 suturas não-reativo prolene. Ramos volta permaneceu patente.
  5. No eletrolítico IVC modelo (EIM), uma agulha de aço inoxidável 25G, conectado a um fio de cobre revestido de prata (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ) é inserido na exposição caudal da VCI (Figura 1) e posicionado contra a parede anterior (ânodo).
  6. Outro fio é implantado por via subcutânea completando o circuito (cátodo).
  7. Uma corrente de 250 μAmps mais de 15 minutos foi aplicado utilizando um estimulador Grass S48 onda quadrada e uma unidade de corrente constante (Tecnologias Grass, Um Astro-Med, Inc., West Warwick, RI). Os resultados de corrente direta na formação de produtos tóxicos de eletrólise que corroem a superfície endotelial do IVC promoção de um ambiente trombogênico e formação de trombos subseqüentes.
  8. Após 15 minutos, a agulha é removida e um chumaço de algodão é realizada suavemente em contato com a área para prevenir hemorragias
  9. Em animais sham, a agulha é colocada na VCI e depois removido, sem aplicação da corrente.
  10. O site laparotomia é fechada em uma forma de duas camadas. Nosso laboratório emprega vicryl 5-0, uma sutura sintética, em um padrão contínuo para fechar a parede abdominal. Cola adesivo de pele é usado para fechar a pele. Não há suturas externas para remoção.
  11. Ratos são então recuperados em uma gaiola de rato individual, observado de perto no pós-operatório (45 minutos a 2 horas), sob uma lâmpada de aquecimento (min distância 24 centímetros de distância da gaiola), em seguida, voltaram para suas unidades habitacionais original. Medicação para dor e anti-inflamatórios podem ser usados ​​se não interferir com o objetivo do estudo. Justificação científica de reter medicamentos para a dor, veterinária, e aprovação ICUCA são necessários. Nosso laboratório descobriu que a buprenorfina ,0.05-0 0,1 mg / kg ² é um analgésico excelente pré-e pós-operatório para os ratos. Além disso, Lidocaína a 4mg/kg (0,4 ml / kg de uma solução a 1%) pode ser infundida no local da incisão, quando analgésicos sistêmicos possam confundir os resultados experimentais.
  12. Nós normalmente não experiência pós-operatório efeitos adversos devido à TVP. No entanto, adversos pós-operatório pode incluir efeitos anestésicos morte espontânea, perda de sangue cirúrgico, e paresia parcial devido ao trauma do nervo. Animais que são lentas para se recuperar pode ser alimentado nutria gel ou ter ração úmida colocada no chão da gaiola para facilitar a recuperação do animal. Animais com sever complicações pós-operatórias devem ser humanamente eutanasiados.
  13. No ponto de tempo determinado, a eutanásia é realizada de forma humana, em conformidade com as recomendações estabelecidas pela American Veterinary Medical Association orientações sobre a eutanásia para roedores.

3. Resultados representante

O EIM é um modelo que formas trombo na presença de fluxo de sangue contínuo. As figuras abaixo mostram os parâmetros investigados neste novo modelo.

Figura 1
Figura 1 definesthe área anatômica onde uma 25G de aço inoxidávelagulha, conectada a um fio de cobre revestido de prata (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ) é inserido. Note que um nó linfático é quase presente e ajuda como um marco para encontrar o IVC caudal.

Figura 2
Figura 2: peso do trombo 2 dias após EIM em diferentes linhagens. Como esperado, o peso do trombo foi menor no PAI-1 camundongos KO e maiores em hipercoagulabilidade Delta CT camundongos (^ CT).

Figura 3
Figura 3: P-selectina solúvel, um fabricante de trombose venosa profunda, foi medida em diferentes linhagens. Os níveis mais baixos foram encontrados em PAI-1 camundongos KO enquanto os níveis mais altos foram encontrados em ratos de hipercoagulabilidade delta CT.

Figura 4
Figura 4 Correlação entre o peso do trombo e P-selectina solúvel foi encontrado em diferentes linhagens. De nota, no grupo que gerou o menor tamanho do trombo, a P-selectina solúvel detectado foi a mais baixa (PAI-1 camundongos KO). No grupo que gerou o maior tamanho do trombo, a P-selectina solúvel detectado foi o maior (hipercoagulabilidade delta CT).

Figura 5
Figura 5: A fim de demonstrar a presença do fluxo de sangue, ultra-sonografia foi realizada em ratos submetidos a EIM. A Figura 5 mostra o ultra-som realizado em um rato de 2 dias após EIM. Em seguida, o espécime foi colheita. Observe o que a forma trombo sugerem a formação de trombos na presença de fluxo

Discussion

O mouse é uma ferramenta excelente para pesquisa em experimentos in vivo. Assim, o desenvolvimento de modelos de mouse que simulam doenças ou condições patológicas são necessárias. Diversos modelos de mouse trombose venosa têm sido usados ​​para estudar a TVP, incluindo: fotoquímica (2), estase (3-4) e trauma mecânico (5-6). No entanto, nenhum destes modelos utilizam um estímulo interno endoteliais para gerar trombo na presença de fluxo de sangue contínuo. A EIM, a partir de estímulo eletrolítica dentro do IVC, promove trombogênese venosa pela ativação endotelial na presença de fluxo sanguíneo (1). É tecnicamente simples, facilmente reprodutível e tem uma elevada taxa de sobrevivência (99%). Apesar do fato de que uma corrente elétrica é usado para criar a eletrólise, o calor não é gerado (1). O modelo simula EIM TVP clínicos e, portanto, serve como uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos intrínsecos de formação de trombos e resolução. O modelo de EIM também é útil para o avanço de novas abordagens terapêuticas contra a doença trombose.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Suportado pelo NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Core animal A, 1 NIH K01 HL080962-01A2 (Myers, PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

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References

  1. Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
  2. Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
  3. Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
  4. Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
  5. Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
  6. Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).

Comments

2 Comments

  1. "After 15 minutes, the needle is removed and a cotton swab is held gently in contact with the area to prevent bleeding. "
    How about bleeding in the PAI mice group?

    In sham animals, the needle is placed into the IVC and then removed, without application of the current.
    How many minutes keep the needle in IVC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:19 PM
  2. No bleeding was observed in PAI-1 KO mice.
    In order to mimic the experimental group, a needle was placed within the IVC for 15 minutes, without current administration in shams.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:48 PM

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