Elettrolitico vena cava inferiore Model (EIM) della Trombosi Venosa

Medicine
 

Summary

L'induzione elettrolitica di attivazione endoteliale sulla superficie interna della vena cava risultati in formazione tipo trombo venoso a causa di attivazione endoteliale e parziale stasi del sangue, due componenti della triade di Virchow.

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Diaz, J. A., Wrobleski, S. K., Hawley, A. E., Lucchesi, B. R., Wakefield, T. W., Myers, Jr., D. D. Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis. J. Vis. Exp. (53), e2737, doi:10.3791/2737 (2011).

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Abstract

I modelli animali hanno un ruolo vitale nella trombosi venosa profonda (TVP) ricerca per studiare la formazione di trombi, la risoluzione del trombo e per testare potenziali composti terapeutici (1). Nuove mescole da utilizzare nel trattamento e nella prevenzione della TVP sono attualmente in fase di sviluppo. La consegna dei potenziali composti antagonista terapeutico ad una vena interessata trombizzata è stato problematico. Nel contesto delle applicazioni terapeutiche, un modello che utilizza parziale stasi e genera costantemente trombi all'interno di un filone importante è stato di recente istituzione. Il elettrolitica vena cava inferiore Model (EIM) è un modello murino di TVP che permette la formazione di trombi in presenza di flusso di sangue continuo. Questo modello consente agli agenti terapeutici di essere in contatto con il trombo in modo dinamico, ed è più sensibile rispetto ad altri modelli di trombosi venosa profonda (1). Inoltre, questo modello simula trombosi da vicino situazioni cliniche di formazione di trombi ed è ideale per studiare l'attivazione delle cellule endoteliali venose, la migrazione dei leucociti, trombogenesi venoso, e per testare le applicazioni terapeutiche (1). Il modello di EIM è tecnicamente semplice, facilmente riproducibile, crea coerente dimensioni trombi e consente un ampio campione (cioè trombo e parete venosa) che è richiesto per scopi di analisi.

Protocol

1. Topo Anestesia Procedure

  1. Gli animali vengono rimossi dal loro gabbia e messi in anestesia pre-operatoria camera di induzione per l'induzione di gas al 2% isoflurano e il 100% di ossigeno ad un flusso di 0,5 litri al minuto (vaporizzatore controllato).
  2. I topi sono sedato nella camera di induzione dell'anestesia, rimosso dalla camera e l'addome ventrale è rasata con cesoie elettriche, o mantenuti all'interno della camera se un depilatorio capelli è usato (1 min).
  3. Mentre ancora sotto sedazione, sono pesati, gli occhi sono lubrificati con pomata oftalmica sterile e, poi messa in recumbancy dorsale su un dispositivo di riscaldamento ad acqua calda in circolazione in anestesia generale con un cono con isoflurano e ossigeno. A questo punto il tasso di ossigeno si riduce a 0,2 litri al minuto.
  4. L'addome viene spruzzato con una soluzione di clorexidina (clorexidina diacetato è rapidamente bacterialcidal e persistente) e si asciugò con garza sterile o tre volte fino a quando il sito chirurgico è pulito.

2. Micro Mouse-chirurgici e procedure di ripristino

  1. Una incisione linea mediana ventrale (2 cm) è fatto con le forbici iris attraverso la pelle e la parete addominale esporre l'addome. Una sterile 2x2 garze imbevute di soluzione salina viene utilizzato per riflettere l'intestino alla sinistra dell'animale. Un dispositivo di immobilizzazione mouse è messo in atto a consentire la visualizzazione della vena cava inferiore (IVC).
  2. A questo punto, l'isoflurano è ridotto ad un livello di manutenzione del 2% e il tasso di ossigeno resta a 0,2 litri al minuto per il resto della procedura chirurgica.
  3. Dissezione Blunt è facilitato utilizzando un tampone sterile applicatore ed extra delicato tessuto dell'iride pinze mezzo curvo. Bisogna fare attenzione nel maneggiare il mouse per tessuti sono estremamente fragili.
  4. Tutti i rami laterali IVC, dalle vene renali alla biforcazione iliaca, sono legatura con 7-0 punti di sutura non reattivi prolene. Rami sono rimasti indietro di brevetto.
  5. Nel elettrolitico IVC modello (EIM), un 25G in acciaio inossidabile ago, attaccato ad un filo di rame ricoperto d'argento (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ) è inserito nel esposti caudale IVC, (Figura 1) e posizionato contro la parete anteriore (anodo).
  6. Un altro filo è impiantato per via sottocutanea completare il circuito (catodo).
  7. Una corrente di 250 μAmps di 15 minuti è stato applicato usando un Grass S48 stimolatore ad onda quadra e una unità di corrente costante (Tecnologie Erba, Un Astro-Med, Inc., West Warwick, RI). I risultati a corrente nella formazione di prodotti tossici di elettrolisi che erodono la superficie endoteliale della IVC promozione di un ambiente trombogenico e la successiva formazione di trombi.
  8. Dopo 15 minuti, l'ago viene rimosso e un batuffolo di cotone si tiene delicatamente in contatto con l'area per prevenire le emorragie
  9. Negli animali sham, l'ago viene inserito nella IVC e poi rimosso, senza applicazione della corrente.
  10. Il sito laparotomia è chiuso in due strati di moda. Il nostro laboratorio utilizza Vicryl 5-0, una sutura sintetica, in un modello continuo per chiudere la parete addominale. Colla pelle adesivo utilizzato per chiudere la pelle. Non ci sono suture esterne per la rimozione.
  11. I topi sono poi recuperati in una gabbia di topo individuale, strettamente osservate post-operatoria (45 minuti a 2 ore) sotto una lampada riscaldante (distanza minima 24 cm di distanza dalla gabbia), poi tornati alle loro abitazioni originale. Farmaci antidolorifici e antinfiammatori può essere utilizzato se non interferisce con l'obiettivo di studio. Giustificazione scientifica per trattenere farmaci per il dolore, veterinario, e l'approvazione ICUCA sono necessari. Il nostro laboratorio ha scoperto che Buprenorfina ,0.05-0 0,1 mg / kg SQ è un analgesico ottimo pre-e post-operatoria per i topi. Inoltre, a 4mg/kg lidocaina (0,4 ml / kg di una soluzione all'1%) può essere infusa nel sito di incisione, quando gli analgesici sistemici possono confondere i risultati sperimentali.
  12. Noi in genere non si verificano effetti negativi post-operatoria a causa di TVP. Tuttavia, avversa post-operatoria effetti possono includere spontaneo morte sotto anestesia, perdita di sangue chirurgiche e paresi parziale a causa di un trauma nervoso. Gli animali che sono lenti per recuperare possono essere alimentati nutria gel o umidi chow posto sul pavimento della gabbia per facilitare il recupero dell'animale. Gli animali con sever complicanze post-operatorie dovrebbero essere umanamente eutanasia.
  13. Al punto di tempo assegnato, l'eutanasia viene eseguita con umanità conformemente alle raccomandazioni stabilite dalla American Veterinary Medical Association Linee guida sull'eutanasia per i roditori.

3. Rappresentante Risultati

L'EIM è un modello trombo che si forma in presenza di flusso di sangue continuo. Le figure seguenti mostrano i parametri indagati in questo modello di romanzo.

Figura 1
Figura 1 zona definesthe anatomiche in cui un 25G in acciaio inoxago, attaccato ad un filo d'argento di rame ricoperto (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ) è inserito. Si noti che un nodo linfatico è quasi presente e aiuta come punto di riferimento per trovare la caudale IVC.

Figura 2
Figura 2: peso Trombo 2 giorni dopo EIM in diversi ceppi. Come previsto, il peso trombo era più bassa nel PAI-1 nei topi KO e più grande in ipercoagulabilità Delta CT topi (^ CT).

Figura 3
Figura 3: P-selectina solubile, un creatore di trombosi venosa profonda, è stata misurata in diversi ceppi. I livelli più bassi sono stati trovati nel PAI-1 nei topi KO, mentre i più alti livelli sono stati trovati in ipercoagulabilità delta topi CT.

Figura 4
Figura 4 Correlazione tra peso trombo e P-selectina solubile è stato trovato in diversi ceppi. Da segnalare, nel gruppo che ha generato la dimensione più corta del trombo, il P-selectina solubile è stata rilevata la più bassa (PAI-1 nei topi KO). Nel gruppo che ha generato la più grande dimensione del trombo, il P-selectina solubile è stata rilevata la più alta (ipercoagulabilità delta CT).

Figura 5
Figura 5: Al fine di dimostrare la presenza di flusso di sangue, l'ecografia è stata eseguita nei topi sottoposti a EIM. La Figura 5 mostra l'ecografia eseguita in un mouse 2 giorni dopo EIM. Poi il campione è stato raccolto. Si noti che la forma del trombo suggeriscono la formazione di trombi in presenza di flusso

Discussion

Il mouse è uno strumento di ricerca di eccellenza per esperimenti in vivo. Così, lo sviluppo di modelli murini che assomigliano malattie o condizioni patologiche sono necessari. Diversi modelli murini trombosi venosa sono stati utilizzati per studiare TVP tra cui: fotochimico (2), stasi (3-4) e traumi meccanici (5-6). Tuttavia, nessuno di questi modelli utilizzano uno stimolo interno endoteliale per generare trombo in presenza di flusso di sangue continuo. L'EIM, utilizzando stimolo elettrolitico all'interno della IVC, promuove trombogenesi venosa mediante l'attivazione endoteliale in presenza di flusso di sangue (1). È tecnicamente semplice, facilmente riproducibile ed ha un elevato tasso di sopravvivenza (99%). Nonostante il fatto che una corrente elettrica viene utilizzato per creare l'elettrolisi, il calore non viene generato (1). Il modello simula EIM TVP strettamente clinico, e costituisce pertanto uno strumento prezioso per studiare i meccanismi intrinseci di formazione di trombi e risoluzione. Il modello EIM è utile anche per l'avanzamento di nuovi approcci terapeutici contro il morbo di trombosi.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Supportato da NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Animal Nucleo A, NIH 1 K01 HL080962-01A2 (Myers, PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

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References

  1. Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
  2. Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
  3. Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
  4. Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
  5. Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
  6. Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).

Comments

2 Comments

  1. "After 15 minutes, the needle is removed and a cotton swab is held gently in contact with the area to prevent bleeding. "
    How about bleeding in the PAI mice group?

    In sham animals, the needle is placed into the IVC and then removed, without application of the current.
    How many minutes keep the needle in IVC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:19 PM
  2. No bleeding was observed in PAI-1 KO mice.
    In order to mimic the experimental group, a needle was placed within the IVC for 15 minutes, without current administration in shams.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:48 PM

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