श्रेणी बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की जांच के लिए 'bioluminescent' रिपोर्टर फेज

Immunology and Infection

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Summary

प्राथमिकता बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की पहचान के लिए एक सरल तरीका अनुवांशिक इंजीनियर संवाददाता फेज का उपयोग करने के लिए है. ये रिपोर्टर फेज है, जो उनके विशेष मेजबान प्रजातियों के लिए विशिष्ट हैं तेजी से bioluminescent संकेत मेजबान कोशिकाओं के जवाब transducing में सक्षम हैं. इस के साथ साथ, हम रिपोर्टर का पता लगाने के लिए फेज का उपयोग का वर्णन

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Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740, doi:10.3791/2740 (2011).

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Abstract

Protocol

1. वाई. pestis थाली टीका

  1. स्ट्रीक वाई pestis (BeiResources NR15 #) A1122 Luria - Bertani पर शेयर संस्कृतियों (पौंड) अगर (मिलर). बाँझ तकनीक का प्रयोग करें और सभी वाई प्रदर्शन एक वर्ग द्वितीय प्रकार एक जैव सुरक्षा कैबिनेट वाई pestis जोड़तोड़ pestis A1122 जैवसुरक्षा (BSL) स्तर 2 अपवर्जित चयन एजेंट तनाव है. यह दोनों 75 केबी जोड़ी प्रतिक्रिया कम कैल्शियम (LCR) प्लाज्मिड डाह, और PGM बिन्दुपथ है कि डाह के लिए आवश्यक हैं का अभाव है. वाई आगे बढ़ें 28 में pestis ° सी एक स्थिर हवा इनक्यूबेटर नियंत्रित तापमान में 48 घंटे के लिए . वाई की विकास दर pestis की 1.25 घंटे 9 पीढ़ी के समय के साथ धीमी है .

2. वाई. pestis तरल मीडिया टीका

  1. एक एकल वाई स्थानांतरण pestis कॉलोनी में एक बाँझ 17 x 100 मिमी संस्कृति लेग शोरबा 2 एमएल एक बाँझ धातु टीका पाश का उपयोग युक्त ट्यूब . एक बस्ती है कि आकार में एक समान है का चयन करें, अन्य कालोनियों का संकेत है, और स्पष्ट रूप से थाली पर कालोनियों के बाकी से अलग है. भंवर संक्षिप्त ट्यूब और 28 में संस्कृति बढ़ने डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर (225 आरपीएम) में लगभग 20 घंटे के लिए.

3. वाई. pestis परिणाम, संवाददाता फेज इसके अलावा, और bioluminescent पता लगाने

  1. रातोंरात वाई पतला pestis एक 50 एमएल बाज़ ट्यूब में ताजा लेग शोरबा (उदाहरण के लिए, माध्यम की 9.5 एमएल में 500 कक्षों की μL) में संस्कृति 1:20 और 28 ° मिलाते (225 आरपीएम) के साथ सी में बढ़ने . 600 एनएम (600 ए) पर 0.2 का एक ऑप्टिकल घनत्व है पहुँच (लगभग 5 घंटे) तक हो जाओ. सक्रिय रूप से बढ़ कोशिकाओं फेज की क्षमता एक bioluminescent प्रतिक्रिया transduce मेजबान जीवाणु की व्यवहार्यता और फिटनेस के लिए सहसंबद्ध है के बाद पता लगाने के लिए बेहतर हैं. फिर भी, पहचान प्रणाली के विकास 7 चक्र के सभी चरणों में काटा कोशिकाओं के साथ संगत होना दिखाया गया है.
  2. एक 2% n - डीन का समाधान तैयार करके bioluminescent प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सब्सट्रेट उत्पन्न करता है. लेग शोरबा के 9.8 एमएल के साथ n के डीन का 200 μL मिक्स. 5 एस के लिए सख्ती भंवर प्रधानमंत्री 2% 2 n - डीन का समाधान एमएल के साथ microplate luminometer इंजेक्टर. Luminometer प्रत्येक microplate के लिए डीन का समाधान का 67 μL autoinject को अच्छी तरह से और फिर तुरंत एस के लिए 10 नमूने पढ़ने के लिए पूर्व की स्थापना
  3. 3 संस्कृति ट्यूबों में लेग शोरबा 1 एमएल aliquots बांटना. प्रत्येक ट्यूब संवाददाता फेज शेयर समाधान (5 x 10 9 पट्टिका के गठन इकाइयों के शेयर [Pfu] / एमएल) का 20 μL जोड़ें, फेज और मीडिया अकेले नमूने एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. वाई के अभाव में pestis कोशिकाओं, रिपोर्टर फेज के अलावा एक bioluminescent प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं चाहिए.
  4. वाई के 1 एमएल aliquots बांटना 6 संस्कृति ट्यूबों में pestis संस्कृति (3.1 कदम से). 3 संस्कृतियों (परीक्षण संस्कृतियों) के लिए संवाददाता फेज शेयर के 20 μL जोड़ें. शेष 3 संस्कृतियों कोशिकाओं 'अकेले' नकारात्मक नियंत्रण (पृष्ठभूमि autobioluminescence) के रूप में सेवा करते हैं. संक्षिप्त vortexing मिक्स संस्कृतियों, और प्रत्येक नमूने से फसल 200 μL (0 समय पढ़ने के लिए) और एक सफेद 96 अच्छी तरह microtiter प्लेट में बांटना. 28 में शेष संस्कृति सेते ° मिलाते हुए (225 rpm) के साथ सी.
  5. समय (रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों, RLU) bioluminescence microplate luminometer का उपयोग करने के लिए उपाय 0 नमूने.
  6. हार्वेस्ट 10 के बाद प्रत्येक नमूने के 200 μL, 20, 30, 40, 50, और 60 मिनट के बाद संवाददाता फेज इसके अलावा, और bioluminescence के लिए नमूना उपाय. यदि वाई pestis कोशिकाओं मौजूद हैं, रिपोर्टर फेज विशेष रूप से सेल करने के लिए बाध्य होगा, इसकी डीएनए इंजेक्षन करने के लिए, और मेजबान और translational मशीनरी transcriptional नक़ल करना और luxAB रिपोर्टर जीन (चित्रा 1) अनुवाद का उपयोग करने के लिए.
  7. सिग्नल की शक्ति और संकेत प्रतिक्रिया समय कक्षों की संख्या वर्तमान के लिए आनुपातिक है. कोशिकाओं (5 10 -10 / 8 CFU एमएल), RLU में एक महत्वपूर्ण नियंत्रण की तुलना में वृद्धि की उच्च सांद्रता में 20 मिनट के भीतर स्पष्ट किया जाना चाहिए . कम सांद्रता में सेल, (2 10 4 -10 / CFU एमएल), RLU में एक उल्लेखनीय वृद्धि 40-60 मिनट के भीतर स्पष्ट किया जाना चाहिए .
  8. वैकल्पिक रूप से, वाई के लिए आवश्यकता के बिना पता लगाने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए pestis, एक नया विकसित की थाली से एक कॉलोनी परिणाम सीधे लेग संवाददाता फेज शरण शोरबा के 200 μL के साथ एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में (vortexing द्वारा) मिश्रित हो सकता है . एक microtiter प्लेट की एक अच्छी तरह से मिश्रण / सेल फेज में बांटना. 28 डिग्री सेल्सियस पर microtiter प्लेट सेते हैं और 60 मिनट (एक बार बिंदु केवल) के बाद bioluminescence के लिए नमूना पढ़ें.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

रिपोर्टर फेज का एक प्रतिनिधि समय बेशक प्रयोग वाई के पता लगाने मध्यस्थता pestis चित्रा 2 में दिखाया गया है. 1 के नकारात्मक नियंत्रण) फेज अकेले (कोई कोशिकाओं), या 2) अकेले कोशिकाओं (नहीं फेज) 60 मिनट inc भर में लगभग 20 RLU के bioluminescence का आधारभूत स्तर प्रदान करते हैंubation (आधारभूत स्तर luminometer विशिष्ट हैं). इसके विपरीत, परीक्षण के नमूने (संवाददाता फेज और कोशिकाओं) के लिए bioluminescence में वृद्धि हुई है इसके अलावा फेज के बाद 15 मिनट में स्पष्ट है. सिग्नल की शक्ति में तेजी से 60 मिनट से अधिक वृद्धि करनी चाहिए. Incubations लंबे समय अवधि (80 से अधिक मिनट) के लिए, एक संकेत है कि मेजबान कोशिकाओं की मध्यस्थता lysis फेज के कारण चोटी संकेत से गिरावट आई है में परिणाम देगा. 37 के ऊष्मायन तापमान पर इसी तरह के परिणाम प्राप्त कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस भले ही वाई के लिए इष्टतम तापमान pestis वृद्धि 28 डिग्री सेल्सियस 9 है.

चित्रा 2
चित्रा 2. फेज की मध्यस्थता वाई के bioluminescent पता लगाने pestis 0 समय, संवाददाता फेज और कोशिकाओं मिश्रित थे, 28 डिग्री सेल्सियस पर incubated, और bioluminescence (RLU) समय पर नजर रखी थी. RLU (* छात्र टी परीक्षण, <0.05 पी) में एक उल्लेखनीय वृद्धि 15 मिनट के भीतर स्पष्ट है.

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Discussion

इस विधि संवाददाता फेज करने के लिए तेजी से वाई का पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है संवाददाता फेज के बाद pestis एक bioluminescent संकेत सुसंस्कृत वाई के जवाब transduce कर सकते हैं फेज इसके अलावा के बाद 20 मिनट के भीतर pestis कोशिकाओं . संवाददाता फेज भी सीधे वाई का पता लगाने के लिए सक्षम नैदानिक ​​matrices में pestis, अलगाव और बाद में खेती 7 की शर्त के बिना. मानक फेज lysis assays जो आम तौर पर पूरा करने के लिए 48 घंटे की आवश्यकता की तुलना में, यह काफी पता लगाने के लिए समय कम हो जाती है.

पिछले अध्ययनों से दिखा दिया है कि जंगली प्रकार ΦA1122 फेज लगभग सभी प्राकृतिक वाई lyse कर सकते हैं pestis आइसोलेट्स, और वाई के लिए 'विशिष्ट' pestis 6,10,11, तथापि, कुछ वाई pseudotuberculosis उपभेदों ΦA1122 अतिसंवेदनशील हो सकता है जब 20 डिग्री सेल्सियस 6,10,12 ऊपर तापमान पर हो दिखाया गया है. तापमान के प्रति संवेदनशील अंतर संवेदनशीलता के लिए कारण अज्ञात है, लेकिन संभवतः कोशिका की सतह परतों / संरचना में तापमान पर निर्भर परिवर्तन के कारण है. इसलिए, संवाददाता फेज पहचान प्रणाली के एक संभावित चेतावनी से निकट से संबंधित प्रजातियों वाई उपभेदों के साथ एक झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया की संभावना है pseudotuberculosis. प्रतिबंधात्मक तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) में संवाददाता फेज परख प्रदर्शन नमूने है कि वाई शामिल हो सकता है में एक झूठी सकारात्मक संकेत को रोकने जाएगा pseudotuberculosis. इस प्रकार, विशिष्टता कड़ाई से नियंत्रित हो सकता है जब एक विशिष्ट तापमान पर हो पृथक संस्कृतियों का उपयोग कर सकते हैं.

सारांश, तेजी से और वाई का पता लगाने के निदान में pestis प्लेग के बाद से एक सकारात्मक रोग का निदान, विशेष रूप से फेफड़े का प्लेग के लिए आवश्यक है, लगभग हमेशा घातक है अगर इलाज के लक्षण उभरने के बाद पहले 24 घंटे के भीतर नहीं दिलाई है. इस विधि सुसंस्कृत आइसोलेट्स की पहचान की पुष्टि के लिए या नैदानिक ​​प्रासंगिक matrices के भीतर इन जरूरतों को पूरा करने की क्षमता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के लघु व्यापार नवाचार अनुसंधान कार्यक्रम (NIAID, 1R43AI082698-01) और खाद्य और कृषि USDA राष्ट्रीय संस्थान (NIFA, 2009-33610-20028) के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco LB agar, Miller VWR international 90003-346
Difco LB broth, Miller VWR international 90003-350
17 x 100 mm culture tubes USA Scientific, Inc. 1485-0810
n-Decanal Sigma-Aldrich D7384
Veritas microplate luminometer Turner Biosystems 9100-001
Microlite microtiter 96-well plate VWR international 62402-984

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References

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