Асептики лаборатории: Объем переводов с Серологические пипетки и Micropipettors

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

При работе в лаборатории, крайне важно, чтобы свести к минимуму источников загрязнения. Асептики относится к процедурам, которые позволяют передачу культуры и реагенты, избегая контакта с нестерильных поверхностей. Серологические пипетки и micropipettors используются для измерения точного объема без ущерба для стерильности решений, используемых в экспериментах.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Микроорганизмы находятся повсюду - в воздухе, почве, и человеческое тело, а также на поверхностях, как неодушевленные лабораторных стендах и компьютерных клавиатур. Широкое распространение микробов создает обильные поставки потенциальных загрязнителей в лабораторных условиях. Для обеспечения экспериментальных успехов, количество загрязняющих веществ на оборудование и рабочие поверхности должны быть сведены к минимуму. Общие многих экспериментов в области микробиологии методики, связанные с измерения и передачи культуры, содержащие бактериальных клеток или вирусных частиц. Чтобы сделать это без обращения нестерильных поверхностей или загрязнения стерильных средах требует (1) подготовка стерильного рабочего, (2) именно установка и точное чтение инструментов для асептического перекачки жидкостей, а также (3) правильно манипулирования инструментами, культуры фляги, бутылки и Трубы в стерильной зоне. Изучение этих процедур требует обучения и практики. Во-первых, действия должны быть медленными, осознанными, и контролируется с целью осуществления для асептического тechnique стать второй натурой при работе на скамейке. Здесь мы представляем шаги для измерения объемов использования серологических пипеток и micropipettors в стерильных поля, создаваемого горелкой Бунзена. Объем варьируется от микролитров (мкл) в миллилитрах (мл) в зависимости от инструмента используются. Жидкости обычно передается включает стерильный бульон или химических растворов, а также бактериальных культур и фагов акций. Следуя этим процедурам, студенты должны уметь:

  • Работа в стерильные поля, создаваемого пламени горелки Бунзена.
  • Использование серологических пипеток без ущерба для инструмента бесплодия.
  • Аспирируйте жидкостей с серологических пипеток, именно чтение калиброванного объема, совместив мениска образованных жидкости окончания знаки на пипетку.
  • Держите культуры бутылки, флаконы, тубы и их крышки стерильной жидкости во время передачи.
  • Определение различных приложений для пункта по сравнению с пластиковым стеклом серологическихettes.
  • Государство точность ограничений на micropipettors.
  • Точно и четко установить объемы на micropipettors.
  • Знать, как правильно использовать первый и второй остановки на micropipettor для аспирации и передачи правильных объемов.

Protocol

1. Подготовить стерильный Workspace

  1. Перед началом любой процедуры стерилизации в вашей рабочей области, тщательно мойте руки с антисептическим мылом и теплой водой.
    • Будьте уверены, чтобы повторно вымыть руки в любое время вы подозреваете, что у вас есть загрязнения с вашей экспериментальной манипуляции.
  2. Убрать все материалы, загромождать рабочее место на лабораторном столе. Удалите предварительно смоченной дезинфицирующей салфеткой из канистры и протрите всю область. Позвольте дезинфицирующее испаряется - не вытереть насухо!
    • Используйте дезинфицирующие средства, такие как спирт (изопропанол или 70% этанола) или фенольных соединений (о-фенилфенол).
    • Для предотвращения аэрозолизации или производства тонкой взвеси, содержащей бактериальные клетки, и распространение микробного загрязнения, избежать выдачи дезинфицирующих средств из бутыли.
    • Сушка микроорганизмов является одним из наиболее эффективных способов обеззараживания поверхностей.
    • Даже если кто-то в последнее время используется лабораторный стол и настольный было протирать дезинфицирующими средствами, всегда начинают свою лабораторию время протирки скамейке.
  3. После того, как дезинфицирующее средство полностью высохла, используйте воспламенитель, чтобы зажечь горелку. Отрегулируйте огонь так, чтобы синий конус можно увидеть в центре пламени. Пламя в настоящее время производит восходящий поток воздуха, или конвекционные потоки воздуха, в которых теплый воздух поднимается вверх и от пламени (рис. 1). Как тепло поднимается, микроорганизмов и частиц пыли вынуждены вверх и в сторону от непосредственно в рабочей зоне. Работа медленно, осторожно, и сознательно в любое время в этой области создан горелку, называют стерильной зоне. Держите горелку на протяжении всей процедуры.
    • Наконечник голубой конус жаркого пламени.
    • Будьте осторожны, чтобы не нарушить восходящий поток быстрыми движениями, которые кардинально изменить айГ токи вокруг лабораторном столе. Создание восходящих потоков воздуха с горелкой Бунзена сводит к минимуму возможность микроорганизмов и пыли падает на скамейку или на открытой бутылки, тубы или колбы в рабочей зоне.
  4. Организовать все материалы, необходимые для процедуры на лабораторном столе возле стерильной зоне. Убедитесь, что все материалы должным образом маркированы.
    • Поставки могут быть серологических пипеток и micropipettors, стерильные пробирки, культуры, стерильные колбы, бутылки СМИ бульон, стерильные пробирки микроцентрифужных, micropipettor советы, стеллажи для труб, бактериальных культурах клеток и фага акций.
    • Жидкие средства массовой информации должны быть стерилизованы в автоклаве при 121 ° C в течение 15 минут на настройку жидкости. Большие объемы средств массовой информации (> 1 л) требуется больше автоклаве раз. Лабораторное следует стерилизовать в автоклаве при 121 ° C в течение 30 минут тяжести (сухой) настройки.
    • В общем, стерильные растворы могут храниться при температуре 4° C в течение 5 месяцев. Обратите внимание, что срок хранения значительно уменьшается для растворов, содержащих неустойчивые компоненты, такие как антибиотики - всегда проверяйте рекомендации производителя.

2. Перенос жидкости Использование Серологические пипетки

  1. Серологические пипетки бывают разных размеров и вариантов: пластик или стекло, одноразовые или многоразовые, подключить или отключить. Они откалиброваны для доставки объемом от 0,1 мл до 25 мл.
    • Общие размеры для серологических пипеток в 5 мл, 10 мл и 25 мл и должны быть использованы для асептической жидкой передачи 0,1 мл и более (панель на рис 2). Там же больше, серологических пипеток, которые могут доставить объемы до 100 мл, однако в центре внимания этого протокола на более общие, меньшего размера пипетки.
    • Предварительно стерилизовать пипетки с вилкой ваты, необходимые для микробиологии и эксперименты культуре ткани. Плагин не должен быть удален от кр пипетки, он предназначен работать как барьер для переполнения пипетки.
    • Различные приложения требуют пластиковые стекла по сравнению серологических пипеток. Стекло необходимо для органических растворителей. Либо могут быть использованы при выполнении BSL-1 Эксперименты на вершине лабораторном столе. Только пластик может быть использован при работе в кабинете биобезопасности с BSL-2, где организмы горелку не могут быть использованы. Кроме того, рекомендуется, чтобы пластик можно использовать для приложений, связанных с передачей расплавленного агара.
    • Серологические пипетки бывают двух типов: TC («содержать») или TD ("доставить"). TC пипетки поставлять весь объем, включая чаевые, и должны быть «сдувается» и промыть, чтобы получить указанный объем. TD Пипетки откалиброваны, чтобы оставить чуть-чуть на кончике, который не должен быть доставлен. Обязательно проверьте этикетку на корпусе пипетки в верхней выяснить, какой тип это (рис. 3). Наиболее часто используемые TD пипетки, которые являются рынкиоттаптывали с двойными кольцами на вершине.
  2. Возьмите стерильные пластиковые серологические пипетки (также называемая объемная передача пипетки) и осторожно удалите бумажном конверте в конце с вилкой ваты путем снятия его прочь, как кожа банан - не удалить всю втулка, защита кончик пипетки которые вступают в контакт с жидкостью, которые будут переданы. Нажмите только в верхней части пипетки (выше выпуска марок) руками.
    • Никогда не ходите в стерильный раствор использовать пипетку, даже если большой заботой было принято держать его стерильным.
    • Стекло серологических пипеток, как правило, хранятся в металлических канистрах (панель B на рис 2). Ослабить верхней части канистры аккуратно снимите крышку и пламя открытых концах крышки и контейнера. Поместите крышку вниз, на его стороне, на скамье дезинфекции. Удалите одну пипетку из канистры, держа ее горизонтально и осторожно встряхивая его так, чтобы вершины одного или двух пипеткиTES торчат около дюйма и может быть легко понять. Лягте канистру на свою сторону и удалить одну пипетку, но будьте осторожны и не прикасайтесь к другим пипетки в контейнере. Не дотрагивайтесь до нижней оконечности пипетки с рук, а также избегать контакта зонда с другими нестерильных поверхностей.
  3. Прикрепите помощи пипетки, таких как лампы, насоса, или пистолет к верхней части серологические пипетки. Удалите бумагу рукав из пластика пипетки. Держите пипетку помощь в правой руке.
    • Если вы используете стеклянную пипетку, пройти нижнюю треть пипетки через синий конус в пламени горелки Бунзена в течение 1-3 секунд. Поверните пипетки 180 °, как она проходит через пламя. Пластиковые пипетки и трубы не может быть пылали.
    • Если левой, держа пипетку помощь в левую руку и проводить последующие манипуляции культуры бутылками и труб с правой рукой.
    • Загрязнение обычно происходит с пластиковой пипетки при снятии окончательного вклГЭС из пипетки из рукава, потому что стерильный наконечник соприкасается с той частью рукава тронуты вашей руки.
  4. Снимите крышку бутылки со стерильным СМИ. Не ставьте крышку на лабораторном столе, но держать его между безымянным пальцем и ладонью правой руки в то время как манипуляции с помощью пипетки большим, указательным и средним пальцами той же руки (рис. 4). Держа бутылку под углом 45 °, проходят краю бутылку через пламя горелки Бунзена, создавая стерильную поле вокруг открытой бутылки.
    • Хотя лучше избегать, если вы должны положить крышку вниз, поместите его лицом вниз на дезинфекцию поверхности. С крышкой, что грозит, есть большой шанс заражения от движения объектов или руками, создавая воздушные потоки, которые вызывают микроорганизмы и частицы пыли, чтобы спуститься к внутренней поверхности крышки.
    • Цель пылающий не стерилизовать, но согреть открытия ое бутылку и создать токи конвекции воздуха и от открытия (например, восходящий поток). Теплая, восходящие потоки воздуха помогает предотвратить частицы пыли и других загрязняющих веществ от входа в бутылку.
    • Держите стерильный контейнер открыт для как можно меньше времени возможно. Важно сохранение пунктов въезда в воздухе микроорганизмов к минимуму в течение всей процедуры.
    • Избегайте кашле, чихании, разговоре, а также другие случайные движения в то время как стерильные контейнеры являются открытыми.
    • Никогда не передавайте руки и пальцы поверх стерильной зоне (например, открытые бутылки или колбы, внутри труб и пробки для бутылок), когда они были переданы через пламя горелки Бунзена.
    • Всегда работать с открытым огнем при открытии стерильные пробирки или бутылки. Никогда не иметь более одной трубки, бутылки, фляги или открытые на скамейке в то время. Горячие должно быть сделано сразу же после открытия и только перед закрытием трубы, бутылки и фляги.
  5. Поместите кончик serological пипетку в бутылку, содержащую стерильный средств массовой информации, то аспирации, или нарисовать образец стерильно, из бутылки. С помощью пипетки помощь, чтобы управлять потоком образца в пипетку. Именно читать объеме вовлекаются в пипетку, совместив мениск образуется в верхней части столба жидкости для выпуска марки на калиброванной пипетки (рис. 5).
    • НЕ РОТ пипетки! Всегда используйте пипетку помощи (насос, лампа, или пистолет).
    • Обратите внимание на последовательность чисел при определении объема атмосферный. Числа могут быть распечатаны чаевые вверх, или наоборот, или зачастую в обоих направлениях.
    • При чтении объеме, всегда держите пипетку вертикально, перпендикулярно земле, а также просматривать мениска жидкости мертвой на уровне глаз.
    • Серологические пипетки только так точны, как наименьшего заметного приращения, которые, как правило, 0,1 мл на 5 мл и 10 мл пипетки и 0,2 мл на 25 мл пипетки. Яе большей точности нужно, серологические пипетки может быть использован в сочетании с micropipettor.
  6. Передайте краю бутылку через пламя горелки Бунзена раз, затем поместите крышку на бутылке. Установить бутылке средства массовой информации в сторону.
    • Не сжигать себя с горелки Бунзена в спешке, чтобы закрыть бутылку.
  7. Держите пробирку или колбу в левую руку. Удалите и удерживать крышку, как описано в шаге № 4 выше. Создать стерильные поля пылающий край трубки или колбы в горелку.
  8. Внесите средства массовой информации в пипетки в пробирку или колбу. Управление потоком образца, чтобы он не выплеснуть трубки или колбы.
    • Объемы могут быть измерены, что весь объем поставляется и пипетки стоков полностью, или удельный объем достигается за счет делать точка-точка доставки (один объем маркировки к другой).
  9. Передайте край трубки или колбы Бунзена через ожогэ пламя еще раз, а затем заменить крышку. Установите трубку или колбу в сторону. Удалите пипетки помощи, а также отказаться от пипетки в соответствующий сосуд отходов.
    • Пластиковые серологических пипеток одноразовые, а стекло серологических пипеток можно стерилизовать и использовать снова. Правильная утилизация требует пластиковой пипетки быть размещены в специально отведенном для острых контейнер (жесткое поле выстроились с полиэтиленовым пакетом распоряжение), а стеклянные пипетки сначала должны быть погружены в контейнер с 10% раствор хлорки для дезинфекции внутренних и наружных поверхностей. Затем стекло пипетки должны быть тщательно вымыты с лабораторным моющим средством, промывают дистиллированной водой и стерилизовать в автоклаве.
  10. Эти же меры следует соблюдать при посеве средах с бактериальной культурой или фаг акций или при выполнении серийных разведений.

3. Перенос жидкости Использование Micropipettors

  1. Именно измерения и дозирования минутного объемов может быть фактомпролить использованием micropipettors (также известный как Pipetman, группа из рис. 6). Эти приборы бывают разных размеров каждого определенного диапазона объема: P2 для 0.2-2 мкл, P10 в течение 1-10 мкл, P20 на 2-20 мкл, P200 на 20-200 мкл и P1000 на 200-1000 мкл.
    • Лечить micropipettors с осторожностью, так как они являются точными приборами. Не оставляйте их лежать на лабораторном столе автоматической где они могут быть сбиты и повреждены. Не позволяйте пипетки вступить в контакт с агрессивными химическими веществами.
    • Для объемов более 1000 мкл, использовать серологические пипетки.
    • Хотя работы в стерильных поля, создаваемого горелку, не пламя micropipettors, трубы и пластиковыми наконечниками. Трубы и советы должны быть предварительно стерилизованные. Micropipettors можно протереть предварительно смоченной дезинфицирующей салфеткой перед использованием.
  2. Объемный цифровой показ обойтись объем может быть установлен, повернув ручку регулировки. Adjusт объеме, прежде чем переходить к шагу № 3.
    • Никогда не включайте ручку регулировки выше предназначенного диапазона!
    • Для получения максимальной точности при уменьшении громкости на micropipettor, медленно набирать вниз колесико, убедившись, что не превышения выпуска марки.
    • Для получения максимальной точности при увеличении громкости на micropipettor, наберите колесико вверх, проходя желаемого выпуска марки на 1/3 оборота. Затем медленно набирать вниз колесико для достижения поставленных объемов, убедившись, что не превышения выпуска марки.

    Объемный показаны три номера. В зависимости от micropipettor, цифры интерпретируются по-разному. Заметим, что каждый micropipettor только так точны, как наименьшее выпуска марки.

    P2: Для объемов между 0,2-2,0 мкл. Верхнее число обозначает объем в мкл. Второй индикации числаэс десятых мкл (0,1 мкл), а третье число представляет сотые доли мкл (0,01 мкл). Каждый выпуск знак равно приращению двух тысячных (0,002 мкл) мкл.

    P10: Для объемов между 1,0-10,0 мкл. Верхнее число десятков мкл; это обычно устанавливается на "0" и должна быть установлена ​​только на "1" с двумя другими номерами установлен на «0», когда отпуск 10,0 мкл. Среднее число означает объем в мкл. Третья цифра указывает десятые доли мкл (0,1 мкл). Каждый выпуск знак равно приращению двух сотых (0,02 мкл) мкл.

    P20: Для объемов между 2.0-20.0 мкл. Верхний ряд в черный десятки мкл, что должно быть установлено только на "2" с двумя другими номерами установлен на «0», когда отпуск 20,0 мкл. Второй номер в черный обозначает объем в мкл. Третий номер в красный цвет указывает на десятьтыс. в мкл (0,1 мкл). Каждый выпуск знак равно приращению двух сотых (0,02 мкл) мкл.

    P200: Для объемов между 20.0-200 мкл. Верхнее число сотни мкл, что должно быть установлено только на "2" с двумя другими номерами установлен на «0», когда дозирования 200 мкл. Среднее число указывает на объем обойтись в десятки мкл, а третье число означает объем в мкл. Каждый выпуск знак равно приращению два с половиной десятых (0,2 мкл) мкл.

    P1000: Для объемов между 200-1000 мкл. Верхнее число тысячи мкл; это обычно устанавливается на "0" и должна быть установлена ​​только на "1" с двумя другими номерами установлен на «0», когда отпуск 1000 мкл. Среднее число сотни мкл. Нижнее число десятков мкл. Каждый выпуск знак равно приращению два (2 мкл) мкл.

    • Производительность проверить: Эти инструменты должны быть откалиброваны в год, обеспечение точности и поддерживается оставаться в пределах ± 5% от спецификации. Использование аналитических масштаб для измерения воды, убедившись, что минимальные и максимальные параметры соответствуют предполагаемому объему. Например, можно использовать P1000 переводов 200 мкл воды весит блюдо на шкале. Поскольку вода имеет плотность 1, то 1 мл воды, что эквивалентно 1 г (г). Таким образом, 200 мкл (0,2 мл) воды должна быть равна 0,2 г. Кроме того, убедитесь, что наконечник не течь и может поддерживать желаемый объем до обойтись использованием плунжера системы.
  3. Micropipettors должны использоваться с пластиковыми одноразовыми наконечниками на все времена. Установите наконечник плотно на конце ствола micropipettor. Надавите и поверните немного обеспечить герметичность.
    • Советы, как правило, упакованные в пластиковые коробки, которые можно стерилизовать в автоклаве. Откройте окно кончик, чтобы получить подсказку, А затем закройте окно кончик, чтобы минимизировать контакт с загрязнителей в воздухе.
    • Некоторые советы имеют фильтры похожи на вату пробки на серологических пипеток. Эти советы часто являются более дорогостоящими, чем обычные советы и, таким образом, использоваться для специализированных применений. Например, при измерении летучих химических веществ, таких как хлороформ или радиоактивных жидкостей, таких как 32 P-меченых ДНК, используя фильтр советами помогает предотвратить баррель micropipettor от того, чтобы загрязненные.
  4. Держите micropipettor в вертикальном положении.
    • Ведение micropipettor вертикально помешает жидкостей работает внутри и загрязняющих ствол micropipettor.
  5. Micropipettor имеет три положения: (1) Отдых позиции, (2) Первая остановка, и (3) Вторая остановка (рис. 6, группа В). Прибор имеет две остановки поршень системы. Первая остановка имеет две функции. Во-первых, привлечь необходимый объем жидкости в наконечнике Wheп. выпуска поршень с первой остановкой в ​​исходное положение. Вторая функция обойтись большинство жидкости из наконечника при нажатии на поршень в исходное положение до первой остановки. Далее нажатием на поршень, второй остановки обходится все жидкости остается в конце.
    Нажмите кнопку на поршень от остальной позиции до первой остановки. Воздух равна объему настройки будут перемещены.
  6. Погрузите наконечник в жидкость, удерживая нажатой кнопки на первой остановке.
    • Не прикасайтесь к micropipettor себя по бокам бутылки, трубки и колбы, в противном случае внутренние поверхности этих судов будет загрязняться. Только советы бесплодны.
  7. Отпустите кнопку медленно для аспирации жидкости в наконечнике. Стоп раз кнопка возвращается в исходное положение. Постойте так жидкость можно сделать в конце.
    • Объем жидкости в наконечнике будет равна объему ое настройки micropipettor.
    • Вязких жидкостей, таких как те, которые содержат глицерин, потребуется больше времени, чтобы войти в наконечник.
  8. Удалите наконечник из жидкости, и осмотрите наконечник, чтобы убедиться, что жидкость составлен достиг ожидаемого уровня в игле и нет пузырьков воздуха в наконечник.
    • В случае необходимости, исключить жидкие и вручную затяните советы на micropipettor. Составьте жидкости и проверьте еще раз.
  9. Поместите наконечник под углом (10 ° до 45 °) по отношению к стенке трубки получения жидкости. Чтобы исключить жидкости, медленно нажать кнопку на поршень до первой остановки. Постойте затем нажмите кнопку до второй остановки исключить любой остаточной жидкости в наконечнике.
    • Нажатие на поршень слишком быстро может привести к жидкости выслан в брызги или же привести к нежелательным пузырьки в трубке.
  10. Прежде чем отпустить поршень в исходное положение, вновьпереместите наконечник из жидкости.
  11. Отменить советов в назначенный контейнер для отходов острых, нажав на кнопку выброса на micropipettor.

4. Очистка Work Space

  1. После завершения эксперимента, требующих использования асептики, выключить горелку, а затем убрать всех расходных материалов и реагентов. Протрите наружные поверхности лабораторного оборудования (бутылки, micropipettors, пипетки ящики) с предварительно смоченной дезинфицирующей салфеткой, чтобы обеспечить загрязняющие вещества не передаются на места хранения.
  2. Место загрязненной посуды и опасных отходов в надлежащий сосуд распоряжении. Лаборатория отходов включает в себя лабораторное оборудование как перчатки, пипетки, наконечники и труб. Неинфекционные опасные отходы образуются при проведении экспериментов с непатогенных организмов (BSL-1) при инфекционных опасные отходы образуются при использовании патогенных микроорганизмов (BSL-2 или выше). Инфекционные отходы должны быть автоклаве или дезинфекция ДОе она отбрасывается. Следуйте лаборатории по технике безопасности описаны в BMBL (5-е изд.), А также те, которые предусмотрены OSHA и институциональных гигиены окружающей среды и безопасности ведомств.
  3. Протрите всю область работы на лабораторном столе с предварительно смоченной дезинфицирующей салфеткой из канистры, еще раз позволяет дезинфицирующим испариться.
  4. Тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой, прежде чем покинуть лабораторию.

5. Представитель Результаты

Пример приложения для использования серологических пипеток для передачи жидкости показано на рисунке 7. Эти пипетки часто используются в микробиологической лаборатории для подготовки информации для прививки с бактериальными культурами. Например, стерильные колбы Первые заполнены указанные объем культуральной жидкости, в данном случае Лурия бульон (LB), то небольшое число клеток (например, кишечная палочка), добавляют в средства массовой информации. С помощью серологических рipette, первый бульон должны быть стерильно передаются из бутылки средств массовой информации в колбу. В этом случае 25 мл LB был добавлен в 125 мл стерильной колбе на 25 мл серологические пипетки. Затем бульон должны быть привиты с E. кишечной клетки. Здесь 10 мкл клеток были переданы асептически использованием P20 micropipettor из ранее растущей культуры колбу на 25 мл свежей LB. Колбу инкубировали в ростовой камере на определенное количество времени, что позволяет клеткам воспроизвести (в данном примере, клетки кишечной палочки инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C на дрожащей платформы). В результате мутная бактериальной культуры клеток, которые можно использовать для последующих экспериментов.

Серологические пипетки также может быть использована для передачи медиа изначально поставляется в бутылке пробирки, или между пробирками, как это делается при создании разведения бактериальной культуры. Если асептики не поддерживается на протяжении всех этих типов манипуляции СМИ , То станет культур загрязненными, и последующие эксперименты с использованием этих культур будет отложено, потому что свежий, незагрязненных культур должны быть подготовлены. Ошибки возникают из-за стерильной зоне не поддерживается на протяжении всей процедуры. Например, вы можете забыть вылечить лабораторном столе или пламени край бутылки культуры или трубки. Вы можете коснуться кончиком пипетки или установить крышку бутылки или пробирки на скамейке, а не держа его в руке. Правильная процедура имеет решающее значение для поддержания загрязнения среды и культуры к минимуму. Рисунок 8А является примером чистой по сравнению с загрязненными культуры E. палочки в пробирку, содержащую 5 мл LB. Левая панель показывает культуру отображения единый штраф мутность типичный чисто E. палочки культуры. В противоположность этому, на правой панели показывает, загрязненных культуры, в которой рост характеристики отличаются от тех, кто ожидал этого бактериального штамма.

"> Технические ошибки могут возникать при обработке серологических пипеток в результате неправильного перевода объемов средств массовой информации между пробирками. Например, вы можете прочитать на объем пипетки неправильно (то есть, по сравнению с верхней нижней части мениска) или вы можете исключить средства массовой информации полностью из TD пипетки, который был разработан, чтобы оставить чуть-чуть на кончике не будет доставлено. При выполнении точка-точка доставки средств массовой информации, вы можете использовать неправильные знаки калибровки и отказаться от неправильного объема. Рисунок показывает 8B Например пробирок с правильными против неправильных объемов информации. трубки слева содержит 3,5 мл LB измеряется с помощью 5 мл серологические пипетки. студент провел точка-точка доставки средств массовой информации, в которой Б. был составлен до окончания марки 5,0 мл и разливают по 1,5 мл знак. труба справа содержит 2,5 мл LB измеряется с помощью пипетки такого же размера, потому что студент, который выполнил точка-точка доставки средств массовой информации яncorrectly отказаться от отметки 5,0 мл до 2,5 мл знак. Эта ошибка может привести к бактериальной культурой, которая будет в большей концентрации, чем планировалось, в результате чего последующие разведения неверным. Это распространение ошибки могут привести к неудачному завершению эксперимента, которые должны повторяться с правильной концентрации клеток.

Пример приложения для использования micropipettors передать жидкости показан на рисунке 9. Эти пипетки используются для различных экспериментов в области молекулярной биологии и микробиологии в том числе подготовка образцов для ПЦР и гель-электрофореза или прививки стерильные средства массовой информации или буфер при небольших объемах (менее 1,0 мл) бактериальных клеток или фагов частиц. В пример, приведенный, студент передано 12,5 мкл буфера ТЕ в 1,8 мл микроцентрифужных труба (левая труба в панель, обратите внимание, что краситель был добавлен в буфер для облегчения визуализации жидкости внутри трубы микроцентрифужных ясно).Эта процедура требует студент первым выбрать правильный micropipettor, в данном случае P20, а в следующем, чтобы установить волюметр правильный объем (группа В). Наконечник был использован, который содержит плагин ваты на конце, чтобы предотвратить возможное заражение, которые могут быть исключены из ствола micropipettor от достижения буфера образца в конце. Эта мера предосторожности не требуется, если внимание уделяется при аспирации жидкостей в советы, нажатием на поршень медленно, чтобы жидкость не плескаться в пипетки баррель. Технические ошибки могут возникнуть, в результате неправильного перевода томов. Например, вы можете выбрать неправильный micropipettor на работу или установить волюметр на правильном micropipettor к неправильному объеме. Перед погружением наконечник в буфер, вы можете нажать на поршень прошлом первая остановка, в результате чего избыток буфера, который можно сделать на кончике при освобождении поршень. Кроме того, вы можете не погружать наконечник достаточно далеко в буфер, так что воздух втягиваетсяв совет вместо буфера. Вы можете забыть нажать на поршень до второй остановки, когда отпуск буфера в микроцентрифужных трубки вызывает меньше требуемого объема, чтобы освободиться от наконечника. Право трубки в панели показано на рисунке 9 показано микроцентрифужных трубки, содержащей неправильные объем буфера по отношению к трубе слева. Вместо выдачи 12,5 мкл буфера, студент обойтись 125 мкл. В этом случае, хотя число устанавливается одинаково на Объемный, неправильном micropipettor был выбран для этой работы (студент использовал P200 вместо P20, группа В) в результате поставки существенно больший объем буфера. Если это решение в настоящее время используется для подготовки смеси реагентов для приложений, таких как ПЦР, то эта ошибка будет меняться конечной концентрации всех реагентов в дальнейшем добавила к той же трубе. Следовательно, маловероятно, что эксперимент будет успешным, так как молекулярная биология таких процедуркак ПЦР требует, чтобы все компоненты, чтобы быть в определенных концентрациях реакция работать должным образом.

Потому что это не всегда возможно обеспечить micropipettors (особенно внутри ствола) являются стерильными, растворы могут стать причиной загрязнения даже устранения неисправностей усилия на провал при проведении экспериментов. При использовании micropipettors передачи стерильных растворов, настоятельно рекомендуется, чтобы порции растворов акций (средства массовой информации, буфер, вода) можно с использованием асептических условиях с серологических пипеток. Она является общей для поддержания рабочего растворы в 15 мл или 50 мл стерильной конических труб. Они часто легче манипулировать во время работы micropipettor и может быть заменен на новый аликвоту маточного раствора при попадании в объеме переводов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Стерильные поля, создаваемого восходящий поток пламени горелки Бунзена. Чтобы минimize загрязнения стерильных растворов и культуры, очень важно, чтобы все манипуляции проводятся в стерильной зоне. Диски из стекла культуры труб и фляги должны быть переданы через кончик голубой конус, самой горячей части пламени. Пластиковые трубы и советы не могут быть пылали - они должны быть предварительно стерилизованных альтернативными методами, перед использованием.

Рисунок 2
Рисунок 2. Серологические пипетки для асептической передачи жидкостей. (А) показан слева направо рисунки по 25 мл, 10 мл и 5 мл пипетки. (B) Серологические пипетки может быть пластик или стекло. Пластиковые пипетки одноразовые (одноразового использования) и, как правило индивидуально завернутых в бумагу и пластиковые рукава, в которой все внутренние поверхности стерильны (левая сторона). Стеклянные пипетки можно использовать несколько раз, если они чистые и стерилизованные между использует, они обычно хранятся в металлических канистрах (справастороны).

Рисунок 3
Рисунок 3. Серологические пипетки бывают двух типов: TC («содержать») или TD ("доставить"). Показана пояснительной метку TD 5 мл пипетки.

Рисунок 4
Рисунок 4. Асептики. При аспирации жидкости из бутылки, фляги, или трубка с крышками, никогда не ставьте крышку на скамейке запасных. Вместо этого, удерживая крышку в той же рукой, помощи пипетки манипулируя сосуд с жидкостью с противоположной стороны, как показано на рисунке.

Рисунок 5
Рисунок 5. Мениска образуется при составлении жидкости в серологические пипетки. Объем соответствует окончания отпечаток на пипетку, где в нижней части мениска выравнивается. В этом примере мениска совпадет с 2,5 мл окончания университета Тион марки.

Рисунок 6
Рисунок 6. Одноместный micropipettor канала. (А) показан пример micropipettor с пластиковым наконечником прикреплены к нижней части ствола держатель наконечника. Указанные являются места волюметр, колесика для изменения волюметр настройки, ствол держателя наконечник, кнопка кончика эжектор, и кнопки на поршне. (Б) две остановки поршень системы micropipettor.

Рисунок 7
Рисунок 7. Использование серологических пипеток перевести средства массовой информации в стерильные колбы 125 мл. Левая колбы имеет 25 мл средства массовой информации только (LB), а правая колбу культуры E. палочки в результате прививки LB с клетками, то инкубации в течение ночи при температуре 37 ° C. Обратите внимание, как средства массовой информации в колбе на право мутной из-за роста клеток.

E 8 "SRC =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
Рисунок 8. Использование серологических пипеток перевести средства массовой информации в стерильные пробирки. (А) левая трубка содержит 5 мл чистого Е. палочка культуры, а правая трубка содержит 5 мл загрязненных бактериальной клеточной культуры. Обратите внимание на различия в темпах роста характеристики между двумя культурами. Хотя оба мутной, культура справа была заражена грибком или других микроорганизмов, давая воздуху культуры разного цвета и консистенции от ожидаемой для E. кишечной клетки. (B) левой трубки культура содержит 3,5 мл LB а правая трубка содержит только 2,5 мл LB. Этот объем разница в результате ошибки, допущенной при проведении точка-точка доставки средств массовой информации для труб.

Рисунок 9
Рисунок 9. Усинг micropipettors передачи буфера в стерильные пробирки микроцентрифужных. (А) левая труба микроцентрифужных содержит всего 12,5 мкл ТЕ буфера, а правая трубка содержит 125 мкл. Обратите внимание, что краситель был добавлен в буфер для облегчения визуализации жидкости внутри трубы микроцентрифужных ясно. (B) левой волюметр от micropipettor P20, а в правой волюметр от P200 micropipettor. Распространенной ошибкой является выбор неправильный micropipettor. Хотя цифры устанавливаются одинаково на P20 и P200 волюметр, выбор неверный результат micropipettor в передаче неправильного томов.

Рисунок 10
Рисунок 10. Ламинарного потока капота используется для предотвращения загрязнения решений и культуры. Показана кабинет биобезопасности одобрен для работы с BSL-2 организмов.

Discussion

Асептики относится к набору рутинных процедур сделать, чтобы предотвратить стерильных растворов и культур становится загрязненной нежелательных микроорганизмов в лабораторных условиях. Такие методы необходимы для проведения экспериментов, требующих растущие клетки. Несмотря на то, рабочей обстановке, полностью стерильных не может быть достигнуто, процедуры, такие как дезинфекция лаборатория поверхности, создавая стерильную поле с помощью горелки Бунзена, ограничение воздействия раскрытый культуры и средств массовой информации в воздух, стерилизация материалов, таких как бутылки, трубы, стекло пипетки, и избегая контакта стерильных инструментов с нестерильных поверхностей снижает возможность загрязнения решений и культуры в эксперименте. Цель этих процедур предосторожности, чтобы стать второй натурой, это приходит с практикой подготовки и во время работы в лаборатории.

Объем переводов в стерильных растворов и культуры с помощью инструментов, таких как серологических пипеток и микрофонropipettors являются одним из многих видов рутинных методов сделано в лаборатории. Различные экспериментальные приложения требуют инструменты могут передавать различные, но точный и аккуратный, объемы. Серологические пипетки используются в микробиологической лаборатории для подготовки клеточных культур, требующих подготовки с участием средств массовой информации мл объема, в то время micropipettors имеют важное значение для молекулярной биологии эксперименты, которые нужны только микролитр количества решений. При асептических практикуется с этими документами, загрязнения сведены к минимуму во время объем переводов, независимо от количества жидкости или типа эксперимента.

Хотя это и не обсуждается в данном протоколе, одна средства обычно используются для предотвращения загрязнения работать в капот ламинарного течения (рис. 10). Данное оборудование имеет решающее значение для культуры тканей и для экспериментов с микроорганизмами классифицируется как BLS-2 или выше. Капот ламинарный поток содержит HEPA (высокоэффективныйчастиц воздуха) фильтр, который удаляет загрязнения воздуха от воздуха, поступающего в капоте, предотвращая нефильтрованного воздуха из помещения с пронизывающей рабочей области. Следует отметить, что горелку не могут быть использованы в ламинарном боксе, так как тепло от пламени нарушает воздушный поток необходимо функциональность капотом.

Часто бывает полезно проверить качество вашей асептики при проведении экспериментов. Для подтверждения решения и культуру средств массовой информации не получают загрязненную во время экспериментальных манипуляций, всегда готовить отрицательный контроль. Например, если подготовка труб бульон для роста бактериальных культур, не прививают одной трубы, оставляя только стерильными средствами массовой информации. Инкубируйте среде наряду с трубами привиты затем проверить uninoculated контроль труб на наличие признаков загрязнения, такие как помутнение от роста нежелательных клеток непреднамеренно ввел в трубку. Если контрольная труба загрязнена, экспериментальные трубыскорее всего загрязнены, а также и опыт придется повторить. Эти меры предосторожности должно быть сделано с каждым экспериментом.

Disclosures

Мне нечего раскрывать.

Acknowledgments

Особая благодарность Кори Сандерса в Iroc образцы для подготовки иллюстраций и Крис Редди в Лос-Анджелесе для создания образцов культуры для фигуры. Финансирование этого проекта была предоставлена ​​HHMI (HHMI грант № 52006944).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).
  2. Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). 5th Ed, US Department of Health and Human Services (DHHS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH), U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. Appendix 4, Appendix 4D (2008).
  4. Coté, R. J. Aseptic Technique for Cell Culture. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
  5. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. RAP Publication. AC802/E, 12-13 (2002).
  6. Guzman, K. Pipetting: A Practical Guide. The American Biology Teacher. 63, (2), 128-131 (2001).
  7. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 978-087969576 (2001).
  9. Seidman, L. A., Moore, C. J. Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference. Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River, New Jersey. (2000).
  10. Pipettes, Calibration & Repair Service - Pipette.com [Internet]. Available from: http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx (2012).
  11. On-Line Resources for Biology: Table of Contents [Internet]. Available from: http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html (2012).
  12. PIPETMAN P User's Guide. Gilson Inc. Available from: http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf (2012).
  13. Sterile Technique - Laboratory Wiki [Internet]. Available from: http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique (2012).
  14. Air displacement pipette - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette (2012).
  15. Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics