Aseptiska Laboratory Tekniker: Volym Överför med serologiska pipetter och Micropipettors

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

När du arbetar i ett laboratorium är det absolut nödvändigt att minimera föroreningskällor. Aseptisk teknik hänvisar till förfaranden som medger överföring av kulturer och reagenser samtidigt som man undviker kontakt med icke-sterila ytor. Serologiska pipetter och micropipettors används för att mäta exakta volymer utan att kompromissa sterilitet lösningar som används i experiment.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroorganismer finns överallt - i luften, jorden och människokroppen samt på livlösa ytor som laboratorie bänkar och tangentbord dator. Den gränslösa mikrober skapar en riklig tillgång av potentiella föroreningar i ett laboratorium. För att säkerställa experimentell framgång måste antalet föroreningar på utrustning och arbete ytor minimeras. Vanligare bland många experiment i mikrobiologi är tekniker som omfattar mätning och överföring av kulturer som innehåller bakteriella celler eller viruspartiklar. För att göra detta utan att kontakta icke-sterila ytor eller förorena sterila media kräver (1) förbereder en steril arbetsyta, (2) exakt inställning och korrekt läsa instrument för aseptisk överföring av vätskor, och (3) rätt att manipulera instrument, kulturer flaskor, flaskor och rör inuti ett sterilt fält. Att lära dessa förfaranden kräver utbildning och övning. Till en början bör åtgärder vara långsam, avsiktligt, och kontrolleras med målet att för aseptiska technique att bli en andra natur när man arbetar vid bänken. Här presenterar vi de steg för att mäta volymer med serologiska pipetter och micropipettors inom ett sterilt fält som skapas av en Bunsenbrännare. Volymer sträcker sig från mikroliter (| il) till milliliter (ml) beroende på den använda instrumentet. Vätskor vanligt överförs inkluderar sterila buljong eller kemiska lösningar samt bakteriekulturer och lager fag. Genom att följa dessa förfaranden ska den studerande kunna:

  • Arbeta inom det sterila fältet som skapas av den bunsenbrännare flamman.
  • Använd serologiska pipetter utan att kompromissa med instrumentet sterilitet.
  • Aspirera vätskor med serologiska pipetter, just läst kalibrerade volymerna genom att rikta in menisken bildas av vätskan till skalstreck på pipetten.
  • Håll kultur flaskor, tuber och deras respektive mössor sterila under flytande överföringar.
  • Identifiera olika tillämpningar för plast kontra glas serologiska pipettes.
  • Statliga noggrannhet begränsningar för micropipettors.
  • Exakt och korrekt inställd volym på micropipettors.
  • Vet hur man korrekt att använda den första och andra stopp på en mikropipett för att aspirera och överföra korrekta volymer.

Protocol

1. Förbered en steril arbetsyta

  1. Innan du börjar några steriliseringsprocedurer i ditt arbetsområde, tvätta händerna noga med antiseptisk tvål och varmt vatten.
    • Var noga med att åter tvätta händerna när du misstänker att du har föroreningar från dina experimentella manipulationer.
  2. Rensa bort alla material belamra ditt arbetsområde på laboratoriet bänken. Ta bort en i förväg fuktad desinfektionsmedel torka ur behållaren och torka av hela området. Låt desinfektionsmedel avdunsta - inte torka torrt!
    • Använda desinfektionsmedel såsom alkohol (isopropanol eller 70% etanol) eller fenolföreningar o-fenylfenol).
    • För att förhindra aerosolbildning, eller produktion av en fin dimma som innehåller bakterieceller och en spridning av mikrobiella föroreningar, undvika dispensering desinfektionsmedel från en sprutflaska.
    • Uttorkning av mikroorganismer är ett av de mest effektiva sätten för att avgifta ytor.
    • Även om någon nyligen har använt laboratoriet bänken och bänk var torkas av med desinfektionsmedel alltid börja ditt laboratorium tid genom att torka ner bänken.
  3. Efter att desinfektionsmedlet har torkat helt, använda en tändare för att tända bunsenbrännare. Justera flamman så att en blå kon kan ses i mitten av flamman. Lågan producerar nu en updraft eller luftströmmar konvektion där varm luft stiger uppåt och bort från lågan (figur 1). Som värmen stiger, är mikroorganismer och dammpartiklar tvingas uppåt och bort från den omedelbara närhet. Arbeta långsamt, noggrant och avsiktligt vid alla tidpunkter inom det område som skapas av Bunsenbrännare, refererad till som ett sterilt område. Håll Bunsenbrännare på under hela förfarandet.
    • Spetsen på den blå kon är den hetaste delen av lågan.
    • Var noga med att inte störa updraft av snabba rörelser som dramatiskt förändrar air strömmar runt laboratoriet bänken. Skapa ett updraft med Bunsenbrännare minimerar risken för mikroorganismer och damm faller på bänken eller i öppna flaskor, rör eller flaskor i arbetsområdet.
  4. Ordna alla förnödenheter som behövs för förfarandet på laboratoriet bänk nära det sterila området. Se till att alla material är korrekt märkta.
    • Leveranser kan innehålla serologiska pipetter och micropipettors, sterila rör kultur, sterila flaskor, media flaskor som innehåller buljong, sterila rör mikrocentrifug, tips mikropipett, ställningar för rör, bakteriella cellodlingar och lager fag.
    • Flytande medium bör steriliseras i en autoklav vid 121 ° C under minst 15 minuter på den flytande miljö. Större volymer av media (> 1 liter) kräver längre autoklav gånger. Labware bör steriliseras i en autoklav vid 121 ° C under minst 30 minuter på vikt (torr) inställning.
    • I allmänhet kan sterila lösningar lagras vid 4° C i upp till 5 månader. Observera att lagringstiden minskar avsevärt för lösningar som innehåller instabila komponenter såsom antibiotika - alltid kontrollera tillverkarens rekommendationer.

2. Överföra Vätskor med hjälp av serologiska pipetter

  1. Serologiska pipetter finns i många storlekar och alternativ: plast eller glas, engångs eller återanvändbara, inkopplad eller urkopplad. Dessa är kalibrerade för att leverera volymer från en 0,1 ml till 25 ml.
    • Vanliga storlekar för serologiska pipetter är 5 ml, 10 ml och 25 ml och bör användas för aseptiska flytande överföring av 0,1 ml eller mer (panel A i Figur 2). Det finns också större serologiska pipetter som kan leverera volymer upp till 100 ml, men det är fokus för detta protokoll på de vanligaste, mindre storlek pipetter.
    • Pre-steriliserade pipetter med en bomullstuss plugg behövs för mikrobiologi och vävnads experiment kultur. Stickproppen bör inte tas bort från tillp av pipetten, det är utformat för att fungera som en barriär mot överfyllning pipetten.
    • Olika applikationer kräver plast jämfört med glas serologiska pipetter. Glas behövs för organiska lösningsmedel. Antingen kan användas vid utförande av BSL-1 experiment på laboratoriet bänk. Endast plast kan användas när man arbetar i en biosäkerhet skåp med BSL-2 organismer där en Bunsenbrännare inte kan användas. Det är också rekommenderat att plast kan användas för tillämpningar som innebär överlåtelse av smält agar.
    • Serologiska pipetter är av två typer: TC ("innehåller") eller TD ("att leverera"). TC pipetter levererar alla volym, inklusive spetsen, och måste "blåsas ut" eller sköljas för att få den angivna volymen. TD pipetter kalibreras för att lämna en liten bit i spetsen som inte ska levereras. Var noga med att kontrollera märkningen på kroppen av pipetten nära toppen att fastställa vilken typ det är (Figur 3). Den mest allmänt använda är TD pipetter, som är marked med dubbla ringar vid toppen.
  2. Ta en steril plast-serologisk pipett (även kallad en volymetrisk överföringspipett) och försiktigt ta bort papperet ärm i slutet med bomullsplugg genom att dra bort det som huden på en banan - inte ta bort hela hylsan, skydda spets pipetten som kommer i kontakt med den vätska som skall överföras. Tryck bara toppen av pipetten (ovanför dosmarkeringar) med händerna.
    • Gå aldrig in i en steril lösning med en begagnad pipett, även om stor omsorg har tagits för att hålla den steril.
    • Glas serologiska pipetter lagras typiskt i metall kapslar (panel B i figur 2). Lossa den övre delen av behållaren sedan försiktigt bort locket, och flamman de öppna ändarna av locket och behållaren. Placera locket nedåt, på dess sida, på den desinficerade bänken. Ta ut en pipett ur behållaren genom att hålla den horisontellt och försiktigt skaka det så toppar en eller två pipetttes sticka ut ungefär en tum och kan lätt gripas. Lägg ner kapseln på sidan och ta bort en pipett, men var försiktig att inte röra de andra pipetterna i behållaren. Rör inte botten pipettspetsen med händerna och undvika kontakt spetsen med andra icke-sterila ytor.
  3. Anbringa en pipett stöd såsom en glödlampa, pump eller pistol till den övre änden av serologisk pipett. Ta bort papperet hylsan från plastpipett. Håll pipetten stödet i höger hand.
    • Om du använder en glaspipett, passera den nedre tredjedelen av pipetten genom den blå kon i Bunsenbrännare lågan under 1-3 sekunder. Rotera pipetten 180 ° när den passerar genom lågan. Plastpipetter och rör kan inte flammig.
    • Om vänsterhänt, håll pipetten stödet i vänster hand och genomföra efterföljande manipulationer av kultur flaskor och tuber med din högra hand.
    • Föroreningar tenderar att inträffa med plastpipetter när man tar ut den sista IncHES av pipetten från hylsan, eftersom den sterila spetsen kommer i kontakt med den del av hylsan rörd av dina händer.
  4. Ta bort locket på flaskan som innehåller sterila media. Placera inte locket på laboratoriet bänken, men håll den mellan ringfingret och Palm av den högra hand medan manipulera pipetten stöd med tummen, pek-och långfinger på samma hand (Figur 4). Att hålla flaskan på ett 45 ° vinkel, passerar kanten av flaskan genom lågan av Bunsenbrännare, skapa ett sterilt område runt den öppna flaskan.
    • Även om bäst att undvika, om du måste sätta på locket nedåt, placera den nedåt på en desinficerad yta. Med ett lock som är vänd uppåt, det finns en större risk för kontaminering från förflyttning av föremål eller händer, vilket skapar luftströmmar som orsakar mikroorganismer och dammpartiklar att sjunka till den inre ytan av locket.
    • Syftet med brinnande är inte att sterilisera, men för att värma upp öppningen of flaskan och skapa strömmar luft konvektion uppåt och bort från öppningen (dvs. stigströmmen). Den varma, stigande luft hjälper till att förhindra damm och andra föroreningar från att komma in i flaskan.
    • Hålla den steril behållare öppen under så kort tid som möjligt. Det är viktigt att hålla de införselplatser av luftburna mikroorganismer till ett minimum under hela förfarandet.
    • Undvik hosta, nysningar, prata, och andra oavsiktliga rörelse under sterila behållare är öppna.
    • Aldrig passerar händer och fingrar över toppen av ett sterilt fält (dvs öppna flaskor eller flaskor, insidan av rör och kapsyler) när de har passerat genom bunsenbrännare lågan.
    • Arbeta alltid med öppen eld när du öppnar sterila rör eller flaskor. Aldrig har mer än en tub, flaska eller kolv öppet på bänken samtidigt. Flaming ska göras omedelbart efter öppning och strax innan stängning rör, flaskor och kolvar.
  5. Placera toppen av serological pipett i flaskan som innehåller sterila media aspirera då, eller dra urvalet aseptiskt från flaskan. Använda pipetten stöd för att styra flödet av provet in i pipetten. Exakt läsa volymen som dras in i pipetten genom att rikta in menisken bildas på toppen av vätskepelaren till skalstreck på kalibrerad pipett (figur 5).
    • INTE MUNNEN Pipettera! Använd alltid en pipett stöd (pump, lampa eller pistol).
    • Var uppmärksam på sekvensen av siffror vid fastställandet av volymen aspireras. Numren kan tryckas spets till topp, eller vice versa, eller ofta gånger i båda riktningarna.
    • När man läser volymen, håll alltid pipetten vertikalt, lodrätt mot marken, och visa vätskemenisken dött på i ögonhöjd.
    • Serologiska pipetter är bara så noggrann som den minsta markerade ökningen, vilket är typiskt 0,1 ml för 5 ml och 10 pipetter ml och 0,2 ml för 25 ml pipetter. Jagf större precision erfordras, kan en serologisk pipett kan användas i kombination med en mikropipett.
  6. Pass kanten av flaskan genom Bunsenbrännare lågan igen, placera sedan tillbaka locket på flaskan. Ställ media flaskan åt sidan.
    • Bränn dig inte med Bunsenbrännare bråttom att stänga flaskan.
  7. Håll ett provrör eller flaska i vänster hand. Ta bort och håller locket som beskrivs i steg # 4 ovan. Skapa ett sterilt område av brinnande kanten av röret eller kolven i bunsenbrännare.
  8. Fördela media i pipetten i röret eller flaskan. Styra flödet av provet så att den inte stänker ut ur röret eller flaskan.
    • Volymer kan mätas så att hela volymen levereras och pipetten avlopp helt eller en specifik volym uppnås genom att göra en punkt-till-punkt leverans (en volym markering till en annan).
  9. Passera kanten av röret eller kolven genom Bunsen bränningenER lågan en gång, sedan tillbaka locket. Ställa in rör eller flaska åt sidan. Ta pipetten stöd och kasta pipetten till rätt avfallsbehållare.
    • Plast serologiska pipetter är engångsartiklar, men glas serologiska pipetter kan steriliseras och användas igen. Korrekt avfallshantering kräver plastpipetter placeras i en behållare för vassa föremål (styv box fodrad med plast säck), medan glaspipetter början skulle vara nedsänkt i en behållare med 10% blekmedel lösning desinficera inom och utanför ytor. Därefter glaspipetter bör tvättas noggrant med laboratorium tvättmedel, sköljdes med destillerat vatten och steriliserades i en autoklav.
  10. Samma åtgärder bör följas vid ympning media med en bakteriekultur eller fag lager eller när de utför seriespädningar.

3. Överföring av vätskor Använda Micropipettors

  1. Exakt mät-och doseringsanordning minut volymer kan vara fullbordatskjul användning micropipettors (även hänvisad till som Pipetman; panel A i Figur 6). Dessa instrument kommer i olika storlekar med vardera ett specifikt volymintervall: P2 för 0,2-2 ul, P10 för 1-10 ul, P20 för 2-20 ul och P200 för 20-200 il, och P1000 för 200-1000 il.
    • Behandla micropipettors med omsorg, eftersom de är precisionsinstrument. Lämna dem inte ligger på laboratoriet bänken utan tillsyn där de kan slås av och skadas. Tillåter inte pipetter att komma i kontakt med korrosiva kemikalier.
    • För större volymer än 1000 il, använd en serologisk pipett.
    • Även arbetar inom det sterila området skapas av Bunsenbrännare, inte låga micropipettors, rör och plast tips. Rören och tips bör i förväg steriliseras. De micropipettors kan torkas av med en i förväg fuktade desinfektionsmedel torka före användning.
  2. En numerisk Volumeter visar den dispenserade volymen kan ställas in genom att vrida reglaget. Justerbarat volymen innan du fortsätter till steg # 3.
    • Vrid aldrig vredet OVAN det avsedda området!
    • För att få maximal noggrannhet då minskar volymen inställningen på mikropipett långsamt slå ner tumhjulet, se till att inte skjuta över märket.
    • För att få maximal noggrannhet vid ökning av volymen inställningen på mikropipett, slå tumhjulet upp passerar den önskade graderingen med 1/3 av ett varv. Sedan sakta slå ner tumhjulet att nå de avsedda volymen, och se till att inte skjuta över märket.

    Den Volumeter visar tre nummer. Beroende på mikropipett är siffrorna tolkas olika. Observera att varje mikropipett är bara så noggrann som den minsta märket.

    P2: För volymer mellan 0,2-2,0 pl. Den övre Antalet anger volym i mikroliter. Det andra antalet indikees tiondelar av en mikroliter (0,1 pl), och den tredje siffran representerar hundradels mikroliter (0,01 pl). Varje märket motsvarar en ökning av två en-tusendels (0,002 fil) av en mikroliter.

    P10: För volymer mellan 1,0-10,0 il. Den övre numret är för tiotals mikroliter, vilket oftast är satt till "0" och bör endast ställas in på "1" med de andra två nummer som vid "0" när dosering 10,0 pl. Siffran i mitten anger volym i mikroliter. Den tredje siffran anger tiondelar av en mikroliter (0,1 pl). Varje märket motsvarar en ökning av två en-hundradelar (0,02 pl) av en mikroliter.

    P20: För volymer mellan 2,0-20,0 il. Den övre siffran i svart är för tiotals mikroliter, detta bör endast ställas in på "2" med de andra två nummer som vid "0" när dosering 20,0 pl. Det andra talet i svart betecknar volymen i mikroliter. Den tredje siffran i rött indikerar tioths av en mikroliter (0,1 pl). Varje märket motsvarar en ökning av två en-hundradelar (0,02 pl) av en mikroliter.

    P200: För volymer mellan 20,0-200 il. Den övre numret är för hundratals mikroliter, detta bör endast ställas in på "2" med de andra två nummer som vid "0" när dosering 200 pl. Siffran i mitten indikerar ut volymen i tiotals mikroliter, och den tredje numret anger volym i mikroliter. Varje märket motsvarar en ökning av två en-tiondels (0,2 pl) av en mikroliter.

    P1000: För volymer mellan 200-1000 il. Den övre numret är för tusentals mikroliter, vilket oftast är satt till "0" och bör endast ställas in på "1" med de andra två nummer som vid "0" när dispensering 1000 pl. Siffran i mitten är för hundratals mikroliter. Botten numret är tiotals mikroliter. Varje märket motsvarar en ökning av två (2 pl) mikroliter.

    • Prestanda kontrollera: Dessa instrument skall kalibreras årligen säkerställa noggrannhet och precision underhållas för att hålla sig inom ± 5% av specifikationer. Använd en analytisk skala för att mäta vatten, och se till att lägsta och högsta inställningarna överensstämmer med den avsedda volymen. Använd till exempel en P1000 överföring 200 pl av vatten till en väg skål på skalan. Eftersom vatten har en densitet av 1, varefter 1 ml av vatten är lika med 1 gram (g). Sålunda bör 200 pl (0,2 ml) av vatten är lika med 0,2 gram. Se också till att spetsen inte läcker och kan bibehålla den önskade volymen tills doseras med kolven system.
  3. Micropipettors måste användas med plast för engångsbruk tips på hela tiden. Passa en spets tätt mot änden av cylindern för mikropipett. Tryck ned och vridas något för att säkerställa en lufttät tätning.
    • Spetsar är vanligen förpackade i plastlådor som kan steriliseras genom autoklavering. Öppna spetsen rutan för att hämta ett tips, Stäng sedan spetsen rutan för att minimera kontakt med föroreningar i luften.
    • Några tips har filter som liknar de pluggar bomull ull på serologiska pipetter. Dessa tips är ofta dyrare än vanliga tips och därmed används för specialiserade applikationer. Till exempel, vid mätning flyktiga kemikalier, såsom kloroform eller radioaktiva vätskor såsom 32 P-märkt DNA, som använder filterspetsar hjälper till att förhindra att cylindern hos mikropipett från att bli kontaminerad.
  4. Håll mikropipett i vertikalt läge.
    • Hålla mikropipett upprätt kommer att förhindra vätskor från att rinna in och kontaminerande cylindern på mikropipett.
  5. Den mikropipett har tre lägen: (1) viloposition, (2) första stoppet, och (3) andra stopp (figur 6, panel B). Instrumentet har två-stop kolven system. Det första stoppet har två funktioner. Det första är att dra in önskad volym av vätska i spetsen when kolven släpps från det första stoppet till viloläget. Den andra funktionen är att dispensera de flesta av vätska från spetsen när nedtryckning av kolven från vilopositionen till det första stoppet. Ytterligare nedtryckning av kolven till det andra stoppet dispenserar oavsett vätska förblir i spetsen.
    Tryck på knappen på kolven från viloläget till första stoppet. Luft som är lika med volymen av inställningen kommer att förskjutas.
  6. Sänk spetsen i vätskan medan du håller ned knappen till första stoppet.
    • Rör inte mikropipett sig till de sidorna av flaskor, rör och kolvar, annars ytorna på insidan av dessa fartyg kommer att bli förorenat. Endast tips är sterila.
  7. Frigöra tryckknappen långsamt att suga ut det flytande in i spetsen. Stoppa när tryckknappen är tillbaka till viloläget. Vänta en stund så att vätska kan sugas in i spetsen.
    • Volymen av vätska i spetsen att vara lika med volymen of inställningen av mikropipett.
    • Viskösa vätskor såsom de som innehåller glycerol kräver mer tid för att komma in i spetsen.
  8. Avlägsna spetsen från vätskan, och visuellt inspektera spetsen för att bekräfta att den vätska som dras upp har nått det förväntade värdet hos spetsen och det finns några luftbubblor i spetsen.
    • Om det behövs, driva vätskan och manuellt dra tipsen på de mikropipett. Dra upp vätskan och kontrollera igen.
  9. Placera spetsen i en vinkel (10 ° till 45 °) mot väggen hos röret mottagande vätskan. Att driva vätskan långsamt trycka ner knappen på kolven till första stoppet. Vänta en stund och sedan trycka på knappen till det andra stoppet för att driva ut eventuell kvarvarande vätska i spetsen.
    • Intryckning av kolven för snabbt kan vätskan drivs ut att stänka eller kommer att producera oönskade bubblor i röret.
  10. Innan du släpper in kolven till viloläget, återflytta spetsen från vätskan.
  11. Kasta tips till utsetts vassa föremål avfallsbehållare genom att trycka på utstötning knappen på mikropipett.

4. Rensa upp Work Space

  1. När du är klar med ett experiment som kräver användning av aseptisk teknik, stänga av Bunsenbrännare, sedan lägga undan alla leveranser och reagens. Torka ner utsidan av laboratorieutrustning (flaskor, micropipettors och pipettspetsen lådor) med en pre-fuktad desinfektionsmedel torka för att se till föroreningar inte överförs till lagringsplatsen.
  2. Placera förorenade glas och farligt avfall i korrekt avfallshantering behållaren. Laboratorieavfall ingår laboratorieutrustning såsom handskar, pipetter, tips och rör. Icke-infektiös farligt avfall genereras när du utför experiment med icke-patogena organismer (BSL-1), medan smittsamt farligt avfall genereras vid användning av patogena organismer (BSL-2 eller högre). Smittförande avfall måste autoklaveras eller desinficeras before det kasseras. Följ riktlinjerna för laboratorier säkerhetskrav som anges i BMBL (5: e upplagan.) Samt de som tillhandahålls av OSHA och institutionella miljö, hälsa och avdelningar säkerhet.
  3. Torka av hela arbetsområdet på laboratoriet bänken med en pre-fuktad desinfektionsmedel torka ur kapseln, en gång så desinfektionsmedel avdunsta.
  4. Tvätta händerna noggrant med antiseptisk tvål och varmt vatten innan du lämnar laboratoriet.

5. Representativa resultat

Ett prov ansökan med hjälp av serologiska pipetter för att överföra vätskor, visas i figur 7. Dessa pipetter används ofta inom den mikrobiologiska laboratoriet för att framställa mediet för inokulering med bakteriekulturer. Exempelvis kan den första sterila flaskor fylls med en specificerad volym av odlingsbuljongen, i detta fall Luria Broth (LB) och ett litet antal celler (såsom E. coli) sätts till mediet. Med hjälp av en serologisk pipette första buljongen skall överföras aseptiskt från mediet flaskan till kolven. I detta fall var 25 ml LB tillsattes till en 125 ml steril kolv med användning av en 25 ml serologisk pipett. Vidare måste buljong inokulerades med E. coli-celler. Här var 10 | il av celler överfördes aseptiskt med användning av en mikropipett P20 från en tidigare växande kultur kolven till 25 ml färskt LB. Kolven inkuberas på en tillväxtkammare under en viss tid, vilket tillåter cellerna att replikera (i detta exempel var de E. coli-celler inkuberades över natten vid 37 ° C på en skakande plattform). Resultatet är en grumlig bakteriell cellkultur som kan användas för efterföljande experiment.

Serologiska pipetter kan också användas för att överföra media ursprungligen levereras i en flaska med provrör, eller mellan provrör, såsom sker när man gör utspädningar av en bakteriekultur. Om aseptisk teknik inte upprätthålls under hela dessa typer av media manipulationer , Då kulturer kommer att bli förorenad, och därpå följande experiment med dessa kulturer kommer att försenas på grund av färska, utan förorening kulturer måste vara beredda. Fel uppstår eftersom en sterilt område inte upprätthålls under hela förfarandet. Till exempel kan man glömmer att desinficera laboratoriebänk eller flamma kanten av en odlingsflaska eller ett rör. Du kan röra toppen av pipetten eller ställa in locket på en flaska eller provrör på bänken istället för att hålla den i handen. Korrekt förfarande är avgörande för att hålla kontaminering av media och kulturer till ett minimum. Figur 8A visar ett exempel på en ren kontra förorenad kultur av E. coli i ett rör innehållande 5 ml av LB. Den vänstra panelen visar en kultur som visar enhetligt fina grumlighet typisk för en ren E. coli-kultur. I motsats härtill visar den högra panelen en kontaminerad kultur i vilken tillväxtegenskaper avvika från dem som förväntas för denna bakteriestam.

"> Tekniska fel kan uppstå när manipulerar serologiska pipetter resulterar i överföring av felaktiga volymer av media mellan provrör. Till exempel kan du läsa volymen på pipetten fel (dvs. toppen kontra botten av menisken) eller så kan du utesluta media helt från en TD pipett, som är avsedda att ge en liten bit i spetsen inte skall levereras. När du utför en punkt-till-punkt leverans av media, kan du använda fel kalibrering märken och dosera den felaktiga volymen. Figur 8B visar ett exempel på provrör med korrekta kontra felaktiga volymer av media. Röret till vänster innehåller 3,5 ml LB mätt med en 5 ml serologisk pipett. Studenten genomfört en punkt-till-punkt-leverans av media som LB utarbetades till 5,0 ml graderingen och matas till 1,5 ml-märket. Röret till höger innehåller 2,5 ml LB mätas med en pipett av samma storlek, eftersom studenten som utförde punkt-till-punkt leverans av media incorrectly dispenseras den från 5,0 ml-märket med 2,5 ml. Detta misstag kommer att resultera i en bakteriekultur som kommer att ligga på en högre koncentration än planerat, vilket kan orsaka efterföljande spädningar vara felaktiga. Denna spridning av fel kan resultera i ett misslyckat experiment som skulle behöva upprepas med rätt cellkoncentrationer.

Ett prov ansökan med användning micropipettors att överföra vätskor, visas i figur 9. Dessa pipetter används för en mängd olika experiment i molekylärbiologi och mikrobiologi inklusive beredskap prover för PCR och gelelektrofores eller ympa sterila media eller buffert med små volymer (mindre än 1,0 ml) av bakteriella celler eller partiklar fag. I det givna exemplet, överfördes studenten 12,5 pl TE-buffert i en 1,8 ml mikrocentrifugrör (vänstra röret i panel A; notera att färgämnet har lagts till bufferten för att underlätta visualisering av vätskan inuti den klara mikrocentrifugrör).Detta förfarande krävs att studenten först välja rätt mikropipett, i detta fall en P20, och nästa för att ställa in Volumeter till rätt volym (panel B). Ett tips användes som innehåller en plugg bomull i slutet för att förhindra eventuell förorening som kan ut från cylinder mikropipett från att nå bufferten provet i spetsen. Denna försiktighetsåtgärd är inte nödvändigt om försiktighet tas när aspirera vätskor i tips, trycka in kolven långsamt så att vätskan inte plaska i pipetten fat. Tekniska fel kan uppstå som leder till överföring av felaktiga volymer. Till exempel kan du välja fel mikropipett för jobbet eller ställa in Volumeter på rätt mikropipett på en felaktig volym. Innan nedsänkning spetsen i bufferten, kan du trycka kolven förbi det första stoppet, vilket ett överskott av buffert för att dras in i spetsen när kolven släpps. Alternativt kan du inte ner spetsen tillräckligt långt in i bufferten, så luft sugsin spetsen i stället för buffert. Man kan glömma att pressa kolven till det andra stoppet vid dispensering buffert in i mikrocentrifugrör orsakar mindre än den önskade volymen som skall frigöras från spetsen. Höger röret i panel A i Figur 9 visar ett mikrocentrifugrör innehållande den felaktiga volym buffert i förhållande till röret till vänster. I stället för dispensering 12,5 | il buffert, dispenseras studenten 125 | il. I det här fallet, även om siffrorna är inställda identiskt på Volumeter var fel mikropipett valts för jobbet (studenten använde en P200 i stället för en P20, panel B) vilket resulterar i leverans av en betydligt större volym buffert. Om denna lösning användes för att framställa en blandning av reagens för en applikation såsom PCR, då detta fel kommer att ändra den slutliga koncentrationen av samtliga reagens tillsättes därefter till samma rör. Därför är det osannolikt att experimentet kommer att lyckas, eftersom molekylärbiologiska förfaranden såsomsom PCR kräver att alla komponenter för att vara på specifika koncentrationer för reaktionen att fungera korrekt.

Eftersom det inte alltid är möjligt att se micropipettors (särskilt insidan av fat) är sterila, kan stamlösningar bli kontaminerade vilket även felsökning ansträngningar att misslyckas när de utför experiment. Om du använder micropipettors för att överföra sterila lösningar, rekommenderas det starkt att stamlösningsalikvoterna (media, buffert, vatten) göras med hjälp av aseptisk teknik med serologiska pipetter. Det är vanligt att bibehålla arbetar förrådslösningar i 15 ml eller 50 ml sterila koniska rör. Det är ofta lättare att manipulera samtidigt som du kör mikropipett och kan ersättas med en ny portion av stamlösningen om kontaminerad under volym överföringar.

Figur 1
Figur 1. Sterilt fält som skapas av updraft av bunsenbrännare låga. Till minimize förorening av sterila lösningar och kulturer, är det viktigt att alla manipulationer föras inom det sterila området. Fälgar av rör glas kultur och kolvar bör ledas genom spetsen av den blå kon, den varmaste delen av lågan. Plaströr och tips kan inte flammade - dessa bör i förväg steriliseras med alternativa metoder innan de används.

Figur 2
Figur 2. Serologiska pipetter används för aseptisk överföring av vätskor. (A) Från vänster till höger är ritningar av 25 ml, 10 ml, och 5 ml pipetter. (B) Serologiska pipetter kan vara av plast eller glas. Plastpipetter är disponibel (engångsbruk) och typiskt individuellt inslagna i papper och plast hylsor där alla invändiga ytor är steril (vänster sida). Glaspipetter kan användas flera gånger, förutsatt att de rengörs och steriliseras mellan användningarna, dessa vanligtvis lagras i metall behållare (högersida).

Figur 3
. Figur 3 Serologiska pipetter är av två typer: TC ("innehåller") eller TD ("att leverera"). Visas är förklarande märkningen av ett TD 5 ml pipett.

Figur 4
Figur 4. Aseptisk teknik. Vid aspirerande vätskor från en flaska, kolv, eller rör med lock, ställ aldrig locket på bänken. Istället håller mössan i samma hand som pipetten stödet, medan manipulera kärl som innehåller vätskan med den andra handen som visas.

Figur 5
Figur 5. Menisken bildas vid utarbetandet vätska i serologisk pipett. Volymen motsvarar graderingen på pipetten där botten av menisken justeras. I detta exempel justeras menisken med 2,5 ml gradua ning märke.

Figur 6
Figur 6. Enkanalig mikropipett. (A) visad är en mikropipett prov med en plastspets fäst till botten av cylindern spetshållaren. Som anges är de platser i Volumeter, tummen hjulet för att ändra Volumeter inställningen pipan spetshållaren, spetsen ejektorn knappen och knappen för kolven. (B) Två-stoppa kolven systemet på en mikropipett.

Figur 7
Figur 7. Hjälp av serologiska pipetter för att överföra media till sterila 125 ml kolvar. Den vänstra kolven har 25 ml media endast (LB), medan den högra kolven är en kultur av E. coli som följer inokulera LB med celler sedan inkubera över natten vid 37 ° C. Lägg märke till hur media i kolven till höger är grumligt på grund av celltillväxt.

e 8 "src =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
Figur 8. Hjälp av serologiska pipetter för att överföra media till sterila provrör. (A) Den vänstra röret innehåller 5 ml av en ren E coli-kultur, medan den högra rör innehåller 5 ml av en kontaminerad bakteriell cellkultur. Notera skillnaderna i tillväxt egenskaper mellan de två kulturerna. Även om båda är grumlig, har kulturen till höger har förorenats med en svamp eller andra luftburna mikroorganismer som ger den kultur en annan färg och konsistens från den som förväntas för E. coli-celler. (B) Den vänstra odlingsrör innehåller 3,5 ml LB medan den högra rör innehåller endast 2,5 ml LB. Denna volym skillnad berodde på ett misstag under den tid som en punkt-till-punkt leverans av media till rören.

Figur 9
Figur 9. Using micropipettors att överföra buffert i sterila mikrocentrifugrör. (A) Den vänstra mikrocentrifugrör innehåller endast 12,5 | il TE-buffert, medan den högra rör innehåller 125 | il. Notera att ett färgämne som satts till bufferten för att underlätta visualisering av vätskan inuti den klara mikrocentrifugrör. (B) Den vänstra Volumeter är från en mikropipett P20, medan den högra Volumeter är från en P200 mikropipett. Ett vanligt misstag är att välja fel mikropipett. Även om siffrorna är inställda identiskt på P20 och P200 Volumeter, val av fel mikropipett resulterar i överföring av felaktiga volymer.

Figur 10
Figur 10. Dragskåp med laminärt flöde för att förhindra kontaminering av lösningar och kulturer. Som visas är en biosäkerhet skåp godkänd för arbete med BSL-2 organismer.

Discussion

Aseptisk teknik hänför sig till en uppsättning av rutinprocedurer görs för att förhindra sterila lösningar och kulturer blir kontaminerad av oönskade mikroorganismer i laboratoriet. Sådana tekniker är viktigt för experiment som kräver växande celler. Även om ett verk inställning som är helt steril inte kan uppnås, förfaranden såsom desinficering laboratorium ytor, vilket skapar ett sterilt fält med en Bunsenbrännare, vilket begränsar exponeringen av icke-begränsade kulturer och medier i luften, sterilisering material såsom flaskor, rör och pipetter glas, och undvika kontakt av sterila instrument med icke-sterila ytor minskar möjligheten för kontaminering av lösningar och kulturer i ett experiment. Målet är att dessa försiktighetsåtgärder förfaranden för att bli en andra natur, detta kommer med utbildning och praktik när du arbetar i ett laboratorium.

Volym överföringar med sterila lösningar och kulturer med hjälp av instrument som serologiska pipetter och micropipettors är en av många typer av rutinmässiga tekniker utförda i ett laboratorium. Olika experimentella tillämpningar kräver instrument som kan överföra olika, men ändå precisa och korrekta, volymer. Serologiska pipetter används i mikrobiologiska laboratorier att förbereda cellkulturer kräver medier förberedelsearbetet där milliliter volymer medan micropipettors är viktigt att molekylärbiologiska experiment som endast behöver mikroliter mängder av lösningar. Då aseptisk teknik utföras med dessa instrument är kontamination minimeras under volym överföring oavsett mängd vätska eller typ av experiment.

Även om det inte diskuteras i detta protokoll är en annan metod som vanligtvis används för att förhindra kontaminering att arbeta inom ett laminärt flöde (figur 10). Denna utrustning är avgörande för vävnadsodling och experiment utförda med mikroorganismer som klassificerats som BLS-2 eller högre. En huv med laminärt flöde innehåller ett HEPA (högeffektivpartiklar luft) filter som tar bort luftburna föroreningar från luften strömmar in i huvan och samtidigt förhindra ofiltrerad luft från rummet från att tränga arbetsytan. Att notera, kan en Bunsenbrännare inte användas inuti en huv med laminärt flöde eftersom värmen från lågan stör luftflödet avgörande för funktionaliteten i huven.

Det är ofta bra att kontrollera kvaliteten på ditt aseptisk teknik när de utför experiment. För att bekräfta lösningar och kultur media inte får förorenas under experimentella manipulationer, alltid att utarbeta en negativ kontroll. Till exempel, om framställning rör med buljong för tillväxt av bakteriella kulturer, inte inokulera inte en röret lämnar endast sterila medier. Inkubera mediet vid sidan av de inokulerade rören då inspektera icke ympad kontroll rör för tecken på kontaminering som grumlighet från tillväxt av oönskade celler oavsiktligt införts i röret. Om kontrollen röret är förorenad, den experimentella rörettroligt är smittade också, och försöket kommer att upprepas. Dessa försiktighetsåtgärder bör göras med varje experiment.

Disclosures

Jag har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Speciellt tack till Cori Sanders vid Iroc Motiv för att förbereda illustrationer och Kris Reddi vid UCLA för att inrätta prov kulturer för siffror. Finansieringen för detta projekt har tillhandahållits av HHMI (HHMI Grant nr 52.006.944).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. (1998).
  2. Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). 5th Ed, US Department of Health and Human Services (DHHS), Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH), U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. Appendix 4, Appendix 4D (2008).
  4. Coté, R. J. Aseptic Technique for Cell Culture. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
  5. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. RAP Publication. AC802/E, 12-13 (2002).
  6. Guzman, K. Pipetting: A Practical Guide. The American Biology Teacher. 63, (2), 128-131 (2001).
  7. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 978-087969576 (2001).
  9. Seidman, L. A., Moore, C. J. Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference. Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River, New Jersey. (2000).
  10. Pipettes, Calibration & Repair Service - Pipette.com [Internet]. Available from: http://pipette.com/public/staticpages/guidetopipetting.aspx (2012).
  11. On-Line Resources for Biology: Table of Contents [Internet]. Available from: http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/index.html (2012).
  12. PIPETMAN P User's Guide. Gilson Inc. Available from: http://www.gilson.com/Resources/LT801120_a_eng_030209%20BD.pdf (2012).
  13. Sterile Technique - Laboratory Wiki [Internet]. Available from: http://lab.wikia.com/wiki/Sterile_Technique (2012).
  14. Air displacement pipette - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette (2012).
  15. Disinfectant - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Disinfectant (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics