无菌实验室技术:量与血清学移液器和Micropipettors的转移

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Summary

在实验室工作时,当务之急是减少污染源。无菌技术是指允许转让,同时避免与非无菌表面的接触文化和试剂的程序。血清移液器和micropipettors,用于测量精确量不妥协的解决方案,在实验中使用的无菌。

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Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), e2754, doi:10.3791/2754 (2012).

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Abstract

微生物无处不在 - 在空气,土壤,人体以及实验室长凳和电脑键盘一样的老成表面上。微生物无处不在实验室建立一个供应丰富的潜在污染物。为了确保实验的成功,设备和工作表面上的污染物数量必须减少。许多微生物学实验中常见的是涉及文化含有细菌细胞或病毒颗粒的测量和传输的技术。要做到没有非无菌表面接触或污染无菌媒体要求:(1)准备无菌工作区,(2)精确设置和准确读取液体无菌转让文书,(3)正确操作仪器,文化瓶,瓶管内无菌领域。学习这些程序的培训和实践要求。起初,行动应该是缓慢的,故意的,和无菌ţ目标控制echnique成为第二本性在替补席上时。在这里,我们目前测量血清移液器和micropipettors的本生灯创造一个无菌的领域内使用的卷的步骤。卷的范围从微升(μL),毫升(ml)根据使用的仪器。通常转移的液体,包括无菌肉汤或化学溶液以及细菌培养和噬菌体股票。通过这些程序后,学生应该能够:

  • 本生灯火焰所造成的不育领域内的工作。
  • 血清移液器使用而不影响仪器育。
  • 血清移液器吸液体,正是读通过调整液体由移液器毕业商标的形成半月板的校正量。
  • 保持培养瓶,烧瓶,试管和无菌液体转移期间各自的上限。
  • 塑料与玻璃血清PIP识别不同的应用ettes。
  • 国家micropipettors精度的限制。
  • 精确和准确的上micropipettors设置卷。
  • 知道如何正确使用移液器的第一个和第二站抽吸和传输正确的卷。

Protocol

1。准备无菌工作区

  1. 开始之前在您的工作区的任何消毒程序,彻底洗净双手,用消毒肥皂和温水。
    • 务必重新洗你的手任何时候你怀疑你有你的实验操作污染。
  2. 清除所有材料实验室的长椅上塞满您的工作区。删除预先蘸消毒液擦拭罐和擦拭了整个地区。允许消毒剂蒸发 - 不擦干!
    • 使用消毒剂如酒精(异丙醇或70%乙醇)或酚类化合物(邻苯基)。
    • 为了防止雾化 ,生产或罚款雾气含有的细菌细胞,微生物污染物的扩散,避免配药从洗瓶消毒。
    • 干燥的微生物是净化表面的最有效途径之一。
    • 即使有人最近实验台和台式用消毒剂消灭,总是抹替补开始你的实验时间。
  3. 消毒剂完全干燥后,使用一个点火器点燃本生灯。调整火焰,这样可以在火焰中看到一个蓝色的锥。现在,火焰产生的上升气流 ,或空气对流,暖空气上升,从火焰( 图1)。随着热气上升,微生物和尘埃粒子被迫向上,远离眼前的工作区。工作慢慢地,仔细,故意在本生灯创造了这个区域内的所有时间,称为无菌领域 。在整个过程中保持本生灯。
    • 蓝锥尖火焰是最热的部分。
    • 要小心,不要打扰快速运动的上升气流,极大地改变了AIŕ实验台周围的电流。创建本生灯的上升气流,最大限度地减少了板凳上或在工作区的开瓶,管或瓶到微生物和降尘的可能性。
  4. 排列无菌区附近的实验室长凳上的程序所需的所有用品。确保所有的材料有适当的标签。
    • 物资可能包括血清micropipettors和移液器,无菌培养管,无菌瓶,媒体瓶含有肉汤,无菌离心管,移液器技巧,管架,细菌细胞培养和噬菌体的股票。
    • 液体介质应在121°C灭菌液体设置为至少15分钟,在一个反应​​釜。媒体量较大(> 1L)需要更长的反应釜倍。实验室设备应消毒至少30分钟,重力(干)设置在121°C高压灭菌器。
    • 在一般情况下,无菌溶液可存储4°C的长达5个月。请注意,储存时间明显减少含有抗生素,如不稳定的组件的解决方案 - 经常检查制造商的建议。

2。使用血清滴管转移液体

  1. 血清移液器来在许多大小和选择:一次性塑料或玻璃,或可重复使用,插入或拔出。这些校准交付量从0.1毫升到25毫升不等。
    • 血清移液器常见的尺寸是5毫升,10毫升和25毫升,并应为0.1毫升或更多(面板图2)使用无菌液体转移。也有一些较大的血清移液器,可提供高达100毫升的量,然而,本协议的重点是比较常见的,更小尺寸的移液器。
    • 预消毒药棉插件移液器需要微生物学和组织培养实验。插头不应该被删除从p的移液器,它的目的是作为一个满溢移液器的障碍。
    • 血清移液器塑料与玻璃不同的应用要求。玻璃需要的有机溶剂。执行BSL-1的实验,实验台顶部时,都可以使用。 BSL-2不能使用本生灯的生物体在生物安全柜工作时,可以使用唯一的塑料。它还建议,塑料熔融琼脂涉及转让的应用。
    • 血清移液器有两种类型:训练班(“包含”)或TD(“传递”)。训练班移液器提供的所有卷,包括尖端,必须“吹出来”或冲洗,以获得指定的卷。运输署移液器校准不应交付尖端留在一点点的。一定要检查标签的身体附近的顶端,以确定它是哪种类型( 图3)吸管。最常用的是TD移液器,是三月,KED在顶部的双圈。
  2. 以无菌塑料血清移液管(也称为体积移液管),并小心地取出药棉塞纸套在结束了像香蕉的皮肤脱皮 - 不要删除整个套,保护提示移液器,将被转移的液体接触。用手触摸,只吸管的顶端(以上毕业引号)。
    • 从未进入无菌溶液,用吸管,即使已经采取谨慎措施,以保持它的无菌。
    • 玻璃血清移液器通常存储在金属罐(面板图2中的 B)。松开罐的顶部,然后小心地取下帽子,火焰盖和罐的开盖。将帽下,在其一侧,消毒替补。从罐中取出移液器水平,并轻轻晃动,使一个或两个吸管顶部TES伸出约一英寸,可以很容易掌握。在其一侧放下罐和删除一个吸管,但要谨慎,不要触及容器中的其他移液器。用你的双手,不要触摸吸管尖底,并避免与其他非无菌表面的尖端接触。
  3. 贴上了一个灯泡,泵,枪或血清吸管的顶端,如吸管援助。从塑料吸管纸套。在你的右手握住吸管援助。
    • 如果使用玻璃吸管,通过吸管底部的三分之一,在本生灯火焰1-3秒的蓝色锥。移液器180°旋转,因为它通过圣火传递。塑料移液管和管不能熄火。
    • 如果左手,握住吸管援助在你的左手,用右手进行后续操作的培养瓶和管。
    • 污染往往发生与塑料移液器撤出最后INC时吸管从袖子HES因为无菌尖来感动你的手袖部分接触。
  4. 取出的包含无菌媒体瓶帽。不要把实验室的长椅上的上限,但你的右手的无名指和手掌之间,同时用拇指操作移液器援助,食指和中指相同的手( 图4)。持在45°角瓶,通过本生灯火焰瓶的边缘,创造一个围绕开瓶的无菌区。
    • 虽然最好避免使用,如果你必须把盖了下来,把它放在面对消毒表面上。朝上一顶帽子,有更大的机会,从物体或手的动作的污染,导致微生物和尘埃颗粒下降到帽的内表面的气流。
    • 燃烧的目的是不消毒,但温暖开幕Øf的瓶子,创造空气对流离开幕(即上升气流)。温暖,空气上升,有助于防止尘埃颗粒和其他污染物进入酒瓶。
    • 保持无菌的容器,尽可能少的时间。重要的是要保持空气中的微生物进入到整个过程的最低点。
    • 避免咳嗽,打喷嚏,说话,和其他意外移动,而无菌容器是开放的。
    • 从未越过无菌领域(即开瓶或瓶,管及瓶盖内)的顶端的手和手指,一旦他们已通过本生灯火焰通过。
    • 开放无菌试管或瓶子时,始终使用明火。从未有多个管,瓶,或烧瓶开放时间在板凳上。火焰山后应立即进行开幕之前收管,瓶和瓶。
  5. 将尖端的serol进入包含无菌媒体瓶ogical移液器 ,或画瓶,无菌样品。使用移液器援助控制样品进入移液器流。正是读绘制成吸管对准对形成液柱校准移液器( 图5),毕业商标顶部的半月板的体积。
    • 不要口吸管!始终使用吸管援助(泵,电灯泡,或枪)。
    • 确定吸气量时,注意数字序列。可打印的数字,翻倒到顶部,反之亦然,或经常在两个方向倍。
    • 当阅读量,始终坚持移液器垂直,与地面垂直,并查看液体弯月死在眼睛水平。
    • 血清移液器只有最小的显着增加,这通常是0.1毫升5毫升和10毫升的移液管和0.2毫升25毫升移液器准确。我血清学移液器需要华氏精度,可组合使用,用微量移液器。
  6. 再次通过本生灯火焰瓶的边缘,然后将瓶盖回。设置媒体一瓶备用。
    • 不要本生灯燃烧自己在匆忙关闭一瓶。
  7. 在你的左手握住试管或烧瓶。删除和步骤#4以上所述的上限。通过燃烧管或本生灯瓶的轮辋创建一个无菌的领域。
  8. 免除管或瓶移液器媒体。样品流量控制,因此它不会飞溅管或瓶。
    • 可测得整个卷交付和移液器水渠完全,或做一个点,以点交货(一个卷到另一个标志)取得一个特定的卷册。
  9. 通过本生灯燃烧管或瓶的边缘呃火焰再次,然后更换帽。设置管或瓶备用。取出吸管援助,并丢弃到适当的废物的容器的吸管。
    • 塑料血清移液管是一次性的,而玻璃血清移液器可以再次消毒和使用。妥善处置需要塑料移液管被放置在一个指定的锐器容器(硬盒内衬塑料处置袋),而玻璃吸管最初应沉浸在一个容器中,10%的漂白粉溶液消毒的内外表面。玻璃吸管,应彻底清洗实验室的洗涤剂,用蒸馏水冲洗,高压灭菌器中消毒。
  10. 接种细菌培养或噬菌体股票时,媒体或执行连续稀释时,应遵循相同的步骤。

3。转移液体使用Micropipettors

  1. 精确测量和分配分卷可以是既成事实棚使用micropipettors(也简称为Pipetman;面板图6)。这些仪器在不同大小的每一个特定的音量范围:0.2-2微升P2,P10的1-10微升,为2-20μLP20,P200的20-200微升,P1000在200-1000微升。
    • 对待的护理micropipettors,因为它们是精密仪器。不要让他们躺在实验室的长椅上无人值守在那里他们可以打掉和损坏。不要让移液器接触到腐蚀性化学品。
    • 对于容量大于1000μL,用血清学的吸管。
    • 虽然工作在本生灯创建的不育领域,不的火焰micropipettors,管和塑料的提示。管和技巧应预先消毒。的micropipettors可预先蘸消毒剂擦拭,擦拭前使用。
  2. 可以设置一个数字容量计显示的配药量转动调节旋钮。 adjusT的体积,然后再进行步骤#3。
    • 请不要关闭高于预期的范围内调节旋钮!
    • 以获得最大的准确度,减少对移液器的音量设置时,慢慢地拨下来的拇指轮,确保不冲刻度。
    • 为了获得最高的准确度,增加移液器的音量设置时,请拨打拇指滚轮,经过一个回合的1/3所需的刻度。然后慢慢地拨下来的拇指轮,以达到预期的量,确保不冲刻度。

    容量计显示三个数字。根据对移液器,数字不同的解释。请注意,每个移液器是只为最小的刻度准确。

    P2的:对于微升量为0.2-2.0。上面的数字表示在微升的体积。第二数量indicat的ES十分之一微升(0.1μL),第三个数字代表百分之一微升(0.01μL)。每一个刻度等于两个千分之一(0.002μL)的微量递增。

    P10的:对于微升量为1.0-10.0。上面的数字是几十微升,这通常被设置为“0”,只应设置为“1”与其他两个号码设置为“0”时,配药10.0微升。中间的数字表示在微升的体积。第三个数字表示了微升的十分之一(0.1μL)。每个刻度等于两个一百分之一微升(0.02μL)的增量。

    :P20之间2.0-20.0微升体积。在黑色的上面的数字是几十微升;只应设置在“2”与其他两个号码设置为“0”时,配药20.0微升。在黑色的第二个数字表示量微升。在红色的第三个数字表示10微软UAA Bus的1微升(0.1μL)。每个刻度等于两个一百分之一微升(0.02μL)的增量。

    P200的:对于微升量为20.0-200。上面的数字是数百微升;只应设置为“2”与其他两个号码设置为“0”时,配药200μL。中间的数字表明配药量几十微升,第三个数字表示微升体积。每个刻度等于两个十分之一微升(0.2μL)的增量。

    P1000的:200-1000微升之间的体积。上面的数字是千微升,这通常被设置为“0”,只应设置为“1”设置为“0”,配药1000μL时,与其他两个数字。中间的数字是几百微升。底部的数字是几十微升。每个刻度等于两个(2μL)微升的增量。

    • 性能检查:这些仪器应每年校准,确保精度及精度保持留在±5%规格。使用分析的尺度来衡量用水,确保最大和最小的设置符合预期量。例如,使用P1000的转让200μL水,上规模的权衡菜。由于水的密度为1,那么1毫升的水,相当于1克(g)。因此,水200μL(0.2毫升)应等于0.2克。此外,确保针尖不泄漏,并能保持所需的音量,直到免除使用柱塞系统。
  3. micropipettors塑料一次性提示,在任何时候都必须使用。适合尖紧紧到每桶移液器的结束。按下轻微扭动,以确保气密性密封。
    • 提示通常被装进塑料盒,可高压灭菌消毒。打开提示框检索提示,然后关闭该提示框,以尽量减少与空气中的污染物接触。
    • 一些提示有类似血清移液器药棉塞过滤器。这些技巧往往比普通的技巧更昂贵,因此使用专门的应用程序。举例来说,测量时使用过滤嘴的挥发性化学物质,如氯仿或放射性液体,如32 P标记的DNA有助于防止污染得到移液器桶。
  4. 按住移液器垂直位置。
    • 直立保持移液器将防止从内部运行和污染的移液器每桶液体。
  5. 移液器有三个位置:(1)休息的位置,(2)第一站,和(3)第二站( 图6,B组)。该仪器具有两站柱塞系统。第一站有两个功能。首先是所需的液体量吸引到尖端WHE氮素释放柱塞从第一站,其余位置。第二个功能是按下柱塞从静止位置的第一站时,免除大部分液体从尖端。柱塞进一步压低到无需任何液体仍然在尖端的第二站。
    从静止位置的第一站柱塞压下按键。设置数量相等的空气将被取代。
  6. 浸入液体的小费,同时按住按钮的第一站。
    • 请勿触摸移液器瓶,试管和烧瓶的两侧;否则,这些船只的内表面,将成为污染。唯一的提示是无菌的。
  7. 慢慢释放按钮到尖吸液。停止按键一次是回到休息位置。稍等片刻,使液体可以绘制成尖。
    • 尖端的液体量将等于体积Øf的设置的移液器。
    • 粘性液体,如含甘油,需要更多的时间进入小费。
  8. 从液体中取出小费,目视检查提示确认,制定了液体已达到预期水平的尖端,有尖无气泡。
    • 如果有必要,排出的液体和手动拧紧到移液器的提示。吸取液体,并再次检查。
  9. 放置在对接收液管的墙角(10°〜45°)的一角。驱逐的液体,慢慢压低的第一站柱塞上的按钮。稍等片刻,然后按下按钮,驱逐任何残余的液体在尖端的第二站。
    • 按下柱塞过快可能会导致被驱逐的液体飞溅或会产生不良气泡在管。
  10. 在柱塞释放其余位置,重新从液体中移动的一角。
  11. 丢弃到指定的锐器废物容器上的移液器按弹出按钮的提示。

4。清理的工作空间

  1. 当需要使用无菌技术实验完成后,关闭本生灯,然后收起所有耗材和试剂。预先蘸消毒擦拭实验室器皿(瓶,micropipettors,枪头盒)的外表面擦拭,以确保污染物不会转移到存储位置。
  2. 到妥善处置插座污染玻璃器皿和危险废物的材料。实验室器皿实验室废弃物包括手套,移液器,技巧,和管道等。非传染性的危险废物产生与非病原微生物(BSL-1)进行实验时,使用时产生的病原微生物(BSL-2或以上)而感染的危险废物。感染性废弃物的江前必须灭菌或消毒Ë它被丢弃。按照实验室安全描述在BMBL( 5版),以及OSHA和体制环境,健康与安全部门提供的指引。
  3. 实验室的长凳上擦拭整个工作区,与前蘸消毒液擦拭罐,再次让蒸发的消毒剂。
  4. 离开实验室前彻底洗手用消毒肥皂和温水清洗。

5。代表结果

图7显示了一个示例应用程序使用血清转移液体的移液器。这些移液器经常使用的微生物实验室,准备接种细菌培养的媒体。例如,无菌瓶首先是指定量的培养液充满,卢里亚肉汤(LB)在这种情况下,再小的细胞(如大肠杆菌 )添加到媒体。使用血清P级ipette肉汤,首先必须无菌转移媒体瓶烧瓶。在这种情况下,25毫升的LB加入125毫升无菌瓶中,用25毫升血清吸管。下一步,必须接种大肠杆菌 ,肉汤大肠杆菌细胞。在这里,10μL的细胞被转移无菌从先前的成长培养瓶中使用25毫升的新鲜LB 1 P20的移液器。烧瓶是在一个特定的时间量的增长室培养,使细胞复制(在这个例子中, 大肠杆菌细胞在37°C孵育用颤抖的平台上过夜)。结果是浑浊的细菌,可用于后续实验中使用的细胞培养。

血清移液器也可用于传输原先在试管瓶提供的媒体,或试管之间,如细菌培养稀释时。如果不能维持整个媒体操纵这些类型的无菌技术 ,然后文化将成为污染,以及随后的实验中使用这些文化将被推迟,因为新鲜,无污染的文化将要作好准备。发生错误,因为整个过程中保持无菌领域。例如,你可能会忘记消毒的实验台或火焰瓶或管文化的边缘。您可能会接触到枪头,或设置在替补席上,而不是拿在手上的瓶子或试管帽。正当程序是保持媒体和文化的污染降低到最低的关键。 图8A提供一个纯洁与污染大肠杆菌文化的一个例子大肠杆菌中含有5毫升的LB管。左边的面板显示了文化,显示细腻均匀混浊,典型的纯大肠杆菌大肠杆菌文化。相比之下,右边的面板显示了被污染的文化中,偏离预计这种菌株的生长特性。

“>技术可能会出现错误操作中转移试管媒体之间的不正确的卷所导致的血清学移液器时,例如,你可以读上不正确的移液器体积(即半月板的顶端与底部),或您可能会驱​​逐媒体完全从一个TD吸管,其目的是在不须交付的尖端离开一点点。当执行一个点至点传送的媒体,你可能使用了错误的校准标志,并免除不正确的卷。 图8b显示试管例如与媒体的正确与不正确的卷。管左侧包含3.5毫升5毫升血清移液器测量的LB。学生进行中的LB制定了一个媒体的交付点,以点5.0毫升刻度线,并配发到了1.5毫升的标记。权管含有2.5毫升的LB衡量一个同样大小的吸管,因为我的学生,谁执行媒体交付点,以点ncorrectly免除它从5.0毫升标记的2.5毫升的标记。这个错误会导致在细菌培养,这将是在更高的浓度,比原计划,导致随后的稀释是不正确的。这种错误的传播可能会导致在一个失败的实验,将需要用正确的细胞浓度重复。

图9显示了一个示例应用程序使用micropipettors转移液体。这些移液器是在分子生物学和微生物学的各种实验,包括准备PCR和凝胶电泳的样品,或与小体积的细菌细胞或噬菌体颗粒(小于1.0毫升)接种无菌媒体或缓冲区。在提供的例子,学生转入1.8 ml离心管12.5μlTE缓冲液(在面板左侧管;染料已被添加到缓冲区,以方便可视化明确的离心管内的液体)。此过程需要的学生首先要选择正确的移液器,在这种情况下,P20的,和旁边设置容量计到正确的体积(B组)。小费包含在最后的药棉塞,以防止可能出现的污染针尖到达缓冲区样本可能被开除的移液器的每桶。如果护理时吸进液体的提示,按下柱塞慢慢使液体不溅入移液器每桶采取这种预防措施是没有必要的。技术上的错误,可能会出现在不正确的卷转移的结果。例如,你可能会选择错误的工作移液器或设置到一个不正确的卷正确的移液器的容量计。笔尖浸入缓冲之前,你可能会推柱塞过去的第一站,造成过剩的缓冲区,将针尖释放柱塞时绘制。另外,你可能不沉浸到缓冲区尖端远远不够,所以空气被吸入进入缓冲区,而不是尖。你可能会忘记配药的离心管比从针尖释放所需的体积少造成的缓冲区时,柱塞推到第二站。在面板的右侧管图9显示了离心管中含有不正确的缓冲区相对左侧管体积。配药12.5缓冲液,而不是学生免除125μL。在这种情况下,虽然数字是相同的容量计,错移液器被选中的工作(学生用1 P200的,而不是一个P20的B组),导致交付量大幅增加的缓冲区。如果此解决方案被用来编写的应用,如PCR试剂混合,然后将改变这个错误后来加入到同一管试剂的最终浓度。因此,它是不可能的,实验一定会成功的,因为分子生物学等程序作为PCR需要的所有组成部分,是在特定的浓度为正常的反应。

因为它并不总是可行的,以确保micropipettors(特别是内桶)是无菌的,股票的解决方案可以成为污染造成的努力失败,进行实验时,即使故障排除。如果使用micropipettors转移无菌解决方案,它强烈建议血清移液器使用无菌技术进行等份的股票解决方案(媒体,缓冲区,水)。这是常见保持在15毫升或50毫升无菌锥形管的股票解决方案。这些往往容易操纵,而经营移液器,可以更换,如果在量转移污染的新鲜原液等分。

图1
图1本生灯火焰的上升气流所造成的不育领域。在MINimize无菌解决方案和文化的污染,关键是无菌的领域内进行所有操作。玻璃文化管和瓶轮辋应通过蓝色锥的尖端,在火焰中最热的部分。塑料管和技巧不能被火烧 - 这些应替代方法之前使用预消毒。

图2
图2。血清移液器用于无菌液体转移。 (a)所示,从左至右是图纸25毫升,10毫升,5毫升移液器。 (二)血清移液器可能是塑料或玻璃。塑料移液器是一次性的(一次性使用),通常是单独包装无菌(左侧)中,所有的内表面的纸张和塑料套管。玻璃吸管可以多次使用提供了他们的清洗和消毒间使用,这些通常是在金属罐中(右侧)。

图3
图3血清移液器有两种类型:训练班(“包含”)或TD(“传递”)。显示的是解释性标签的TD 5毫升吸管。

图4
图4。无菌技术。当抽吸液体从一​​个瓶子,瓶,或管帽,永远放在板凳上的盖子。相反,保持在同一只手盖作为吸管援助,同时含有液体所示用另一只手操纵的船只。

图5
图5。半月板形成时,血清吸管的液体。音量对应的刻度吸管半月板的底部对齐。在这个例子中,半月板对齐的2.5毫升的毕业 TION大关。

图6
图6。单通道移液器。 (a)所示的桶尖持有的底部连接到一个塑料尖与样品移液器。表示是的容量计的位置,改变容量计设置的拇指轮,桶尖持有,尖端喷射按钮,柱塞按钮。 (B)两个停止对移液器柱塞系统。

图7
图7。使用血清移液器转移到无菌的125毫升瓶的媒体。左侧瓶中有媒体只(LB),25毫升,而右瓶大肠杆菌是一种文化大肠杆菌细胞,然后孵化一夜之间从接种37磅°C。请注意媒体如何在瓶上的权利是浑浊由于细胞的生长。

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图8。使用血清移液器转移到无菌试管中的媒体。 (一)左管包含5毫升纯大肠杆菌大肠杆菌的文化,而 ​​右管包含5毫升细菌污染的细胞培养。注意生长特性,在两种文化之间的差异。虽然两者都是浑浊的,文化上的权利已给予的文化,并从不同的颜色一致性预期的大肠杆菌与一种真菌或其他空气中的微生物污染大肠杆菌细胞。 (二)左边的文化管含有3.5毫升的LB,而右管中只有2.5毫升LB。本卷的差异导致犯了一个错误,同时进行媒体点至点传送管。

图9
图9。如胶似漆Ğmicropipettors转移到无菌离心管中的缓冲区。 (一)左边的离心管中包含只有12.5 TE缓冲液,而右管含有125μL。请注意,染料已被添加到缓冲区,以方便可视化明确的离心管内的液体。 (二)左边的容量计是从P20的移液器,而右边的容量计是从P200的移液器。常见的错误是选择了错误的移液器。虽然数字上设置相同的P20和P200的体积计,选择在错误的不正确的卷转移移液器结果。

图10
图10。层流罩,用于防止污染的解决方案和文化。显示工作与BSL-2生物体批准的生物安全柜。

Discussion

无菌技术指的是一套做是为了防止无菌解决方案和文化,成为在实验室中的有害微生物污染的例行程序。这种技术是必不可少的,需要生长的细胞的实验。虽然1工作设置完全无菌能不能得到实现,如实验室的表面进行消毒,创建1无菌领域使用本生灯,限制封顶文化和媒体曝光的空气消毒,如瓶,管及玻璃吸管材料的程序,避免接触表面非无菌的无菌文书,减少污染实验中的解决方案和文化的可能性。我们的目标是成为第二自然这些预防程序;培训和实践,同时在实验室工作。

用无菌解决方案和培养,使用,如血清移液器和麦克风文书传输量ropipettors是在实验室进行的常规技术的种类很多。仪器能够转移不同,但精准,体积不同实验应用程序调用。血清移液器用于微生物实验室准备需要媒体的筹备工作涉及毫升体积的细胞培养,而micropipettors是必不可少的分子生物学实验需要的解决方案,仅微升。当这些文书实行无菌技术,污染最小化无论在体积转让金额液体或类型的实验。

虽然没有在这个协议的讨论,通常用于防止污染等手段之一是工作在层流罩( 图10)。此设备是组织文化归类为BLS-2或更高的微生物实验的关键。层流罩,包含了HEPA(高效率微粒空气)过滤器,除去空气中的污染物,从引擎盖到流动的空气,同时防止未经过滤的空气渗透到工作区的房间。值得注意的是,不能用于本生灯内的层流罩,因为从火焰的热量会破坏空气流罩的功能至关重要。

检查您的无菌技术质量,进行实验时,它往往是有益的。以确认解决方案和文化传媒不要在实验操作污染,随时准备阴性对照 。例如,如果准备细菌培养生长的肉汤管,不要只留下无菌媒体接种一管。孵育然后检查未接种的迹象,如无意引入到管的有害细胞的生长浊度污染控制管一起接种管的介质。如果被污染的控制管,管的实验很可能被污染的同时,将不得不重复实验。这些预防措施应做到每一个实验。

Disclosures

我什么都没有透露。

Acknowledgments

特别感谢IROC设计CORI桑德斯准备插图和克里斯Reddi在加州大学洛杉矶分校,为建立数字样品文化。霍华德休斯医学研究所(HHMI的批准号:52006944),为这个项目提供了资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Difco Laboratories 244620 Recipe also available in reference 6
TE Buffer:
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
CiDecon Decon Laboratories 8504 Disinfectant
Ethanol Fisher Scientific A406 For use as disinfectant, prepare 70%(v/v) with distilled water

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References

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