عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

Neuroscience
 

Summary

نحن هنا تصف طريقة لbiopsying المخاطية الشمية من الفئران والجيوب الأنفية الإنسان. ويمكن استخدام هذه الخزعات إما لتحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ أو أمراض multipotent عزل الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها لزرع الخلايا في النماذج الحيوانية من الصدمة الدماغ / المرض.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Girard, S. D., Devéze, A., Nivet, E., Gepner, B., Roman, F. S., Féron, F. Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans. J. Vis. Exp. (54), e2762, doi:10.3791/2762 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الغشاء المخاطي الشمي ، وتقع في تجويف الأنف ، هو المسؤول عن كشف الروائح. بل هو أيضا النسيج العصبي الوحيد الذي يتعرض إلى البيئة الخارجية ، ويمكن الوصول إليها بسهولة في كل فرد المعيشة. نتيجة لذلك ، هذا النسيج هي فريدة من نوعها لأحد تهدف الى تحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ المرضية أو عزل الخلايا الجذعية البالغة لعلاج الخلايا.

غالبا ما تتم دراسة حالة شذوذ الجزيئية في أمراض الدماغ باستخدام عينات الأنسجة العصبية التي تم جمعها بعد الوفاة. ومع ذلك ، هذه المواد وقيود عديدة. في المقابل ، فإن الغشاء المخاطي الشمي يمكن الوصول إليها بسهولة ، ويمكن أن تحتاج فحص بأمان دون أي خسارة في حاسة الشم 1. تبعا لذلك ، والغشاء المخاطي الشمي يوفر "نافذة مفتوحة" في الإنسان البالغ من خلالها يمكن للمرء أن الدراسة التنموية (مثل التوحد وانفصام الشخصية) 2-4 أو الاعصاب (باركنسون مثل الزهايمر) 4،5 الأمراض. ويمكن استخدام الغشاء المخاطي الشمي للدراسات المقارنة إما الجزيئية أو 4،6 في التجارب المختبرية على تكوين الخلايا العصبية 3،7.

الظهارة الشمية أيضا الأنسجة العصبية التي تنتج خلايا عصبية جديدة كل يوم لتحل محل تلك التي تضررت من التلوث ، والبكتيرية من الالتهابات الفيروسية. ويستمر هذا تكوين الخلايا العصبية الدائمة الأسلاف ولكن أيضا الخلايا الجذعية المقيمين على حد سواء داخل المقصورات في الغشاء المخاطي ، وهما والظهارة العصبية الكامنة الصفيحة المخصوصة 80-10. نحن وضعت مؤخرا طريقة لتنقية الخلايا الجذعية الموجودة في الصفيحة المخصوصة ، وبعد أن أثبتت أن ترتبط ارتباطا وثيقا لأنها خلايا نخاع العظام الجذعية الوسيطة (BM - MSC) ، ونحن منهم اسمه الشمية الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي (OE - MSC) 11.

ومن المثير للاهتمام ، بالمقارنة مع BM - اللجان الدائمة ، اللجان الدائمة OE - عرض معدل انتشار عالية ، وهو clonogenicity مرتفعة وميله الى التمايز إلى خلايا عصبية. اتخذنا الاستفادة من هذه الخصائص لتنفيذ دراسات مخصصة لكشف النقاب عن الجينات المرشحة الجديدة في الفصام و 4 مرض باركنسون. وقد أظهرت نحن وغيرنا أيضا أن OE - اللجان الدائمة واعدة المرشحين للعلاج الخلايا ، وبعد صدمة الحبل الشوكي 12،13 ، 14 قوقعة ضرر أو في النماذج الحيوانية لمرض الشلل الرعاش 15 أو فقدان الذاكرة 16.

في هذه الدراسة ، فإننا نقدم طرق لخزعة الغشاء المخاطي الشمي في الفئران والبشر. بعد جمع ، يتم فصل إنزيمي في الصفيحة المخصوصة من ظهارة والخلايا الجذعية هي تنقية باستخدام الأنزيمية أو أسلوب غير الأنزيمية. يمكن تنقية الخلايا الجذعية تكون حاسة الشم ثم نمت إما بأعداد كبيرة ، واعتمدت في النيتروجين السائل أو حثهم على شكل دوائر أو متمايزة في الخلايا العصبية. ويمكن أيضا أن تكون هذه الخلايا الجذعية المستخدمة في omics المقارن (الجينوم ، transcriptomic ، epigenomic ، البروتين) دراسات.

Protocol

1. مجموعة من الفئران في الغشاء المخاطي الشمي

  1. البدء بإعداد ثلاثة أطباق بتري 35 مم مملوءة DMEM / HAM مستنبت F12 في غطاء ثقافة نظيفة.
  2. يجب الموافقة على أي وسيلة للقتل الرحيم مقدما عن طريق رعاية الحيوانات المؤسسة واستخدام لجنة ونفذت من قبل موظفين مؤهلين. بعد تخدير الفئران دخلت عميقة مع أشكال الصوديوم بنتوباربيتال حقن تخدير أو غيرها من مثل الكيتامين / زيلازين ، قطع رأس وإزالة الجلد. وينبغي تجنب التخدير الاستنشاق. وسيتم تقييم مدى كفاية تخدير بواسطة إصبع قرصة قبل قطع الرأس. إزالة الفك السفلي مع مقص ، وبمساعدة من قراضة ، والقضاء على عضلات الوجه على الجانبين.
  3. بدءا من الجزء الخلفي من القواطع ، مع إزالة مقراض العظم الذي يغطي تجويف الأنف ، جانب واحد في وقت واحد. والقرائن حيز البصر حاسة الشم والبرتقالي / البني الأجهزة الموجودة في الجزء الخلفي من الأنف.
  4. تجاهل بدقة على القرائن مع ملقط. باستخدام إبرة قياس 26 ، عزل الغشاء المخاطي الشمي ملقاة على الحاجز عن طريق قطع النسيج على ثلاثة خطوط : قوس عمودي لوحة ، لوحة المصفوية وسقف تجويف الأنف.
  5. جمع عينات للفحص في كلا الجانبين ونقلها في صحن DMEM / HAM بيتري F12 - شغلها. وينبغي أن هذا الإجراء لا تستغرق وقتا أطول من 10 دقيقة من بداية القتل الرحيم.
  6. الآن ، من أجل إزالة المخاط ، نقل الخزعات مرتين في أطباق بتري المتوسطة شغلها.

2. مجموعة من البشر في الغشاء المخاطي الشمي

  1. ينبغي أن يتم هذا الإجراء من قبل الأذن والأنف والحنجرة (ENT) جراح ، وفقا للجنة المحلية ذات الصلة الأخلاقية (ق) ، ويجب أن يوقع كل العيادات الخارجية نموذج الموافقة المستنيرة.
  2. باستخدام ° 0 أو 30 درجة المنظار جامدة (4 مم) ، وفحص كل من تجاويف الأنف وتقييم وجود المفترضة من الاورام الحميدة أو أي آفة التهابية. اختيار أفضل تجويف الأنف ، مع الأخذ بعين الاعتبار انحراف الحاجز.
  3. باستخدام قضيب من القطن ، وتطبيق مخدر موضعي ، مثل يدوكائين مع الادرينالين ، لمدة 10 دقيقة.
  4. بالملقط a throughcut الغربالي ، وجمع اثنين ملليمتر مربع خزعة إما في الجذر من الجانب الإنسي من المحارة المتوسطة أو على الحاجز في منطقة ظهراني إنسي.
  5. ثم يتم نقل خزعة الشمية ، وذلك باستخدام إبرة معقمة ، في أنبوب العقيمة 2 مل مملوءة 1 مل من DMEM / HAM F12. تقلب رأسا على عقب أنبوب للتأكد من أن يتم غمس خزعة في المتوسط ​​الثقافة.
  6. ادخال الانبوب في حاوية مبردة ونقلها إلى مختبر أبحاث. في هذه المرحلة ، يمكن أن تستخدم الخزعة في حد ذاتها للدراسات الجزيئية النسبية التي تركز على أمراض معينة أو معالجة الدماغ لتوليد الخلايا الجذعية.

3. عزل الخلايا الجذعية من الغشاء المخاطي الشمي الإنسان والفأر

  1. غسل الخزعات في DMEM / HAM F12. احتضان الخزعات في طبق بتري مليئة 1 مل من dispase حل ثانيا (2.4 وحدة دولية / مل) ، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. المقبل ، تحت مجهر تشريح بضوء diffracted مقلوب ، تتم إزالة الظهارة الشمية من الصفيحة المخصوصة الكامنة باستخدام ملعقة صغيرة.
  3. الظهارة الشمية هي أرق وتبدو شفافة على خلفية سوداء بالمقارنة مع الصفيحة المخصوصة التي هي مخططة البرتقالي / البني. على خلفية بيضاء ، وتبدو رمادية ظهارة وصفيحة المخصوصة ، والبني.
  4. المنقى مرة واحدة ، ونقل الصفيحة المخصوصة في طبق بتري مليئة DMEM / HAM F12.
  5. إذا كان النسيج هو من القوارض ، ثم قطع الصفيحة المخصوصة الى قطع صغيرة مع اثنين من الإبر قياس 25. ثم ، ونقل القطع لأنبوب 15 مل مملوءة 1 مل من IA كولاجيناز.
  6. في الأنبوب ، وذلك باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة ، فصل الأنسجة. ثم احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. لإنهاء الانفصال ، الصخرة بلطف أنبوب ويضاف 9 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم حرة وخالية من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق.
  8. Resuspend الكرية خلية في DMEM / HAM مستنبت F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية والثقافة لوحة على أطباق بلاستيكية.
  9. الآن ، إذا كانت الأنسجة البشرية ، وشريحة ثم إلى الصفيحة المخصوصة 3-4 قطعة بسماكة تتراوح بين 200-500 ميكرون.
  10. إدراج كل قطاع الخاص في صحن قطره 2 سم الثقافة وتغطية الأنسجة عقيمة مع قطرها 1.3 سم ينزلق الغطاء الزجاجي.
  11. ثم ، إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت (DMEM / HAM F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية) إلى كل صحن الثقافة.
  12. إما لنوع الأنسجة ، وتجديد الثقافة المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام.
  13. خمسة إلى سبعة أيام بعد ، وسوف تبدأ الخلايا الجذعية لغزو الثقافة وطبق بعد أسبوعين أنها ينبغي أن تكون متموجة. عندما يتم التوصل confluency ، والمرور ، ونقل الخلايا إلى قوارير الثقافة.

4. تشكيل المجال واح متعلق بالخلايا العصبيةntiation من الخلايا الجذعية الشم

  1. لتوليد مجالات الخلايا الجذعية ، واحتضان قوارير لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع بولي - L - يسين. (نص : 5 g/cm2).
  2. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 16000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قوارير المعالجة.
  3. كل يومين ، تغذية الخلايا مع 0.2ml لكل سنتيمتر مربع من المتوسط ​​تستكمل (DMEM / HAM F12 تستكمل مع الانسولين ، ترانسفيرين ، السيلينيوم (ITS - X ، 1 ٪) ، EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل)).
  4. يومين إلى خمسة أيام في وقت لاحق ، وجمع المجالات الخلية عائمة وإما إعادة لوحة أو فصل منها قبل التطعيم في نماذج حيوانية لعلاج الخلايا.
  5. للتمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الشمية في مثل الخلايا ، بزراعتها لمدة 21 يوما في المتوسط ​​تحتوي على Neurobasal B - 27 ، البنسلين ، الستربتوميسين ، الجلوتامين والغلوتامات.
  6. ثم جعل التغييرات المتوسط ​​كل 3 أيام. وينبغي أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا تظهر بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.

5. ممثل النتائج :

الأنف البشري يزدرع - تعدى الخلايا الجذعية (الشكل 2A) هي تقسيم بسرعة ويمكن أن يتم التوصل في غضون confluency 1-2 أسابيع. تم تقييم احد السمات الرئيسية لstemness ، nestin التعبير ، (2B الشكل). عندما نمت على بولي يسين - L مع مستنبت المصل خالية تستكمل مع EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل) ، والخلايا الجذعية تثير حاسة الشم لتشمل المجالات (الشكل 2C). عندما نمت في مستنبت المحتوية على مصل المجالات مطلية حديثا تثير GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) أرقام تويولين الإعراب ، خلايا (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) 9 ( 2D - F). ومع ذلك ، يمكن تعديل مصير الخلايا المشتقة المجال. على سبيل المثال ، عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإن معظم الخلايا الجذعية العصبية الشمية في الأنف مثل الخلايا معربا عن β - III تويولين الشكل (2G) وMAP2 الشكل (2H).

الشكل 1
الشكل 1. مخطط شامل للتجربة. يتم استئصال الغشاء المخاطي الشمي خزعات من الجرذان أو تجويف الأنف البشري. ويمكن استخدام Explants في حد ذاته للدراسات الجزيئية النسبية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية في أمراض الدماغ. لعزل الخلايا الجذعية الشمية ، تتعطل التفاعلات بين الصفيحة المخصوصة والاعصاب ظهارة ، مع انزيم dispase الثاني ، وبعد 45 دقيقة ، تتم إزالة الظهارة مع ملعقة صغيرة. ويتم اختيار المزيد من الخلايا الجذعية الشمية بواسطة القوارض عدم الربط بين الصفيحة المخصوصة مع IA كولاجيناز. للأنسجة البشرية ، ومثقف قطعة من الصفيحة المخصوصة الشمية ساترة تحت الزجاج حتى تعدى غزو الخلايا الجذعية كله جيدا. بعد الانتشار ، وذلك باستخدام وسيلة الثقافة المناسبة ، يمكن توليد الخلايا الجذعية الشمية أو تمييز في مجالات الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا. ويمكن استخدام الخلايا الجذعية لحاسة الشم ط) أمراض الدماغ أو إصلاح أو الصدمة الثانية) تحديد المؤشرات الجزيئية للأمراض الجهاز العصبي المركزي. تتم بمساعدة الرسوم التوضيحية للفنون Servier الطبية.

الشكل 2
الشكل 2. الثقافة وتمايز الخلايا الجذعية البشرية الأنف حاسة الشم. الخلايا الجذعية البشرية المتزايدة من الصفيحة المخصوصة ازدراع (A) هي تقسيم بسرعة ، وعندما يزرع في وسط المحتوية على مصل. الخلايا الجذعية تعبر عن stemness nestin علامة (B). عندما مطلي على بولي - L - يسين المغلفة البلاستيكية وزراعتها في وسط ثقافة خالية من مصل EGF وتستكمل مع FGF2 ، والخلايا الجذعية مجالات توليد حاسة الشم (C). المجال المستمدة من الخلايا ، وعندما مطلي في مستنبت المحتوية على مصل الدم ، تؤدي إلى GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) ، معربا عن الخلايا تويولين - (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) 9 (مدافع). عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإنها تفرق في الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا معربا عن β - III تويولين (G) وMAP2 (H).

Discussion

قدم هنا تقنيات تجعل القوارض والغشاء المخاطي الشمي الإنسان نموذجا مفيدا للبحوث السريرية في أسباب الأمراض العصبية النمائية والاعصاب وكذلك أداة لإصلاح المرضية في الدماغ أو صدمة. بروتوكول واضح ومباشر نسبيا ويمكن حملها بسهولة من قبل ذوي الخبرة بيولوجيا الخلايا. نسبة النجاح لتقنيات خزعة والثقافة العالية.

خطوات حاسمة

  • لجمع الغشاء المخاطي الشمي القوارض ، فمن المستحسن أن لا تتجاوز مهلة من 10 دقيقة بين القتل الرحيم والاستئصال النهائي للأنسجة حاسة الشم.
  • وعادة ما يتحقق من التفكك الصفيحة المخصوصة القوارض الشمية بعد 10 دقيقة. حضانة في كولاجيناز IA. إذا لم يكن كذلك ، فإننا نوصي لجمع بعد يوم من طاف في بت undissociated التي تطفو من الصفيحة المخصوصة ، فإنه الطرد المركزي في 200 غ ، وتنأى ميكانيكيا الصفيحة العائمة باستخدام ماصة باستور قبل replating الخلايا في البئر الجديد. يمتلئ البئر الأول الذي يحتوي على خلايا تعلق بالفعل مع مستنبت الطازجة.
  • الصفيحة المخصوصة للبشرية ، الذي هو أكثر إحكاما من الأنسجة القوارض ، ونحن لا يوصي تفارق الأنزيمية. هي شرائح الأنسجة ويتم إدراج كل يزدرع بين الجزء السفلي من صحن البلاستيك والزجاج ساترة. الثقافات الناجحة التي تشمل explants سمك نطاق 200-500 ميكرون.

التعديلات الممكنة

  • ويمكن للبروتوكول الحالي معدلة بشكل طفيف من أجل توليد خلايا عصبية شمية في المختبر. لهذا الغرض ، لا تتم إزالة العصبية وشرائح ظهارة الغشاء المخاطي الشمي كامل مع المروحية McIlwain (200 ميكرون سمك). غير مطلي كل يزدرع في طبق ، والمجففة جزئيا لمدة ساعة وبعد ذلك مع ممهى مستنبت المحتوية على السفح. خلال الأيام الأولى بعد الطلاء ، والخلايا الظهارية الوسيطة تنمو خارج ازدراع. ثم ، فإن أسلاف الخلايا العصبية الهجرة على رأس هذه الطبقة وتفرق في الخلية العصبية.
  • ويمكن تحقيق تنقية الخلايا الجذعية باستخدام حاسة الشم التدفق الخلوي. ويمكن استرجاع علامات سطح معينة من القائمة التي نشرت في ورقة خصائص 11.
  • للتجارب زرع ، فمن الممكن استخدام سلالة من الفئران التي الشمية الخلايا الجذعية هي GFP إيجابية. هذه السلالة الفئران (سبراغ داولي ، eGFP مدفوعا المروج PGK) متوفرا في ITERT (نانت الفرنسي). لإدخال هذا الجين في GFP الخلايا الجذعية البشرية حاسة الشم ، ونحن نستخدم أسلوب يستند على العدوى الفيروسة البطيئة.
  • وتركز هذه الورقة على حاسة الشم الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي. ومع ذلك ، يمكن تنقيته من نوع آخر خلية من الفائدة ، والخلايا الشمية مغمد ، من النسيج نفسه. صفنا طريقة لجمع وتنقية وكنا 1،17 الإنسان خلايا الأنف مغمد لمحاكمة I / الداخليين المرحلة السريرية في المرضى الذين مشلول 18.
  • بوصفه عضوا من الفصيلة الخلايا الجذعية الوسيطة ، OE - اللجان الدائمة قادرة ، في ظل ظروف مناسبة ثقافة ، للتمييز في osteocytes ، والخلايا الشحمية myocytes 11.

التطبيقات المستقبلية

  • لقد استخدمنا بالفعل الخزعات الشمية الإنسان لدراسة الحالات الشاذة الخلوية والجزيئية في المرضى الذين يعانون من التوحد ، واضطراب ثنائي القطب ، خلل الوظائف المستقلة العائلية ، ومرض باركنسون ومرض الزهايمر والفصام 2-7. نظريا ، يمكن أن تدرس جميع أمراض الدماغ باستخدام خزعات الأنف أو الخلايا الجذعية الطرفية الشمية.
  • القوارض والإنسان الخلايا الجذعية الشمية الأنفية وقد تم بالفعل المطعمة في النماذج الحيوانية من فقدان الذاكرة ومرض باركنسون ، والضرر القوقعة والحبل الشوكي الصدمة 12-16. ومن المتصور أن زرع هذه الخلايا في النماذج الحيوانية لمرض الزهايمر ، ونقص تروية الدماغ ، والتصلب المتعدد.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل ماليا ANR (وكالة الأنباء الوطنية دي لا بحوث) ، فؤاد (رابطة مناهضة الفرنسية ليه الاعتلالات العضلية) ، وفيدر في PACA IRME (معهد بحوث سور دي لا Moelle épinière آخرون L' دماغ). نشكر بامتنان ماري بيير بلانشار (جان روش معهد) ليساعدها على كفاءة أثناء تسجيل مرور الوقت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection of olfactory mucosa in rats
DMEM/HAM F12 Invitrogen 31331-028
Sodium Pentobarbital
Rongeur Fine Science Tools
26 gauge needle Terumo Medical Corp. NN-2613R
Forceps
Collection of olfactory mucosa in humans
Rigid endoscope Karl Storz or Richard Wolf Medical
Lidocaine
Epinephrine
Throughcut ethmoid forceps Karl Storz or Richard Wolf Medical
Isolation of olfactory stem cells
Dispase II Roche Group 10 295 825 001
Dissecting microscope
Micro spatula Fine Science Tools
Collagenase IA Sigma-Aldrich C9891
Ca-free/Mg-free PBS Invitrogen 14190-250
Fetal calf serum Invitrogen 10270098
Glass coverslip Knittel Glaser 001/35
Sphere formation and neuronal differentiation
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P-1274
Insulin transferrin selenium (ITS) Invitrogen 51500056
EGF R&D Systems 236-EG
FGF2 R&D Systems 233-FB
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
Glutamine Invitrogen 25030024
Glutamate Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).
  2. Ronnett, G. V. Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome. Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).
  3. Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia. Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).
  4. Matigian, N. Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders. Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).
  5. Arnold, S. E. Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease. Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).
  6. Boone, N. Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia. PLoS One. (2010).
  7. McCurdy, R. D. Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses. Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).
  8. Roisen, F. J. Adult human olfactory stem cells. Brain Res. 890, 11-22 (2001).
  9. Murrell, W. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).
  10. Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa. Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).
  11. Delorme, B. The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties. Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).
  12. Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery. Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).
  13. Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery. Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).
  14. Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss. Stem Cells. (2011).
  15. Murrell, W. Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease. Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).
  16. Nivet, E. Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice. The Journal of Clinical Investigation. Forthcoming (2011).
  17. Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
  18. Mackay-Sim, A. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial. Brain. 131, 2376-2386 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Hi, firstly I`d like to thank you so much to share this valuable method. I followed your procedure with 8 week old mice and found difficulty with isolation of lamina propria from the epithelium so I skipped that step and seeded whole cells. Is it possible to obtain the stem cell population from mixed cells?

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 15, 2013 - 3:05 AM
  2. It's possible to skip the separation step (removal of olfactory epithelium). At the start, you'll get an unpurified culture but olfactory neurons and progenitors will die within the next three or four days. Some basal and supporting cells will remain in your culture but, after passaging, they will disappear and you'll end up with a culture of proliferative stem cells.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 16, 2013 - 4:07 AM
  3. Thank you again!
    I have some more questions about the morphology of ŒSC and subculture step.
    1. In the mixed (un-seperated) culture, I found various cell types and most of them are on the process of death but few cells seem to proliferate in compact manner. They look like pebbles. Are they ŒSCs?
    ². What reagent do I have to use for subculture? (i.e trypsin or accutase....)
    I greatly appreciate for your kindness. Thank you.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 17, 2013 - 5:34 AM
  4. Answers:
    1. All mature neurons (the vast majority of cells within the epithelium) die shortly after plating. Three main cell types survive: ensheathing cells, stem cells (both cell types display an elongated morphology) and horizontal basal cells (they look like cobblestones). Horizontal basal cells will disappear after passaging and stem cells will overwhelm ensheathing cells.
    ². We passage the cells with the usual cocktail trypsin/EDTA (5 minutes at 37°C).

    Overall, human and rat olfactory stem cells are highly proliferative. Mouse olfactory stem cells are in small number and divide less rapidly.

    All the best.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 17, 2013 - 7:31 AM
  5. Thanks a lot. It Did Worked, I think. While I`ve been studying about Œ-MSCs, I`m wondering if these cells can produce OSNs themselves because in my knowledge, OSNs are derived from basal cells in Œ.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 28, 2013 - 8:52 PM
  6. It's good to hear that you succeeded in culturing Œ-MSCs. For sure, you can differentiate these stem cells into neurons but I don't know if these neurons can express olfactory receptors. It's worth a test. Good luck.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 30, 2013 - 9:00 AM
  7. I have one more question. I have a hard time to make healthy spheres...you`ve mentioned that ' To generate stem cell spheres, incubate the flasks for two hours at 37°C with poly-L-lysine' . Could you tell me why we should use the PLL coating dish? In neural stem cell culture, I routinely use non-coating dish to make spheres ( because they will attached to PL coating dish and start to proliferate in attached single cell state).

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    March 28, 2013 - 8:42 PM
  8. The sphere formation process differs from neural stem cells. A single neural stem cell gives rise to a sphere. Instead,ŒMSCs, when plated at the right density on poly-l-lysine, aggregate and, within ²-7 days, form an islet of cells that will ultimately detach from the dish and float in the culture medium. To get spheres, you need to avoid proliferation (serum is eliminated from the culture medium) and use an FGF/EGF-containing culture medium.

    Reply
    Posted by: francois f.
    March 29, 2013 - 5:13 AM
  9. hello, in the last months I have tried to obtain a culture of stem cells from mouse ... but due to my limited experience with this type of tissue, I do not separate the epithelium from the lamina propria, so I decided to do passages... my question is how many passages are enough to have a homogeneous culture and healthy stem cells from mouse???

    Morphological differences exist between mouse or human culture to make passajes?

    Thanks ....

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    June 4, 2013 - 2:40 PM
  10. Separating the lamina propria and the epithelium are not compulsory. At the start, you'll get a mixed population of cells but after one passage, epithelial cells will disappear rapidly.
    Overall, mouse cells do not proliferate as well as human cells. In order to keep your mouse stem cells growing, I recommend to keep a 50% level of confluency after passaging. If the cell density is too low, the proliferation rate will be minimal.
    Good luck with your experiments,
    Francois Feron

    Reply
    Posted by: francois f.
    June 5, 2013 - 4:28 AM
  11. Dear Dr. Ferón

    My name is Ireri Franco and I wrote to you before asking about the features of the isolation of Olfactory Stem Cells in mouse...these cells are nestin, sox2 and beta III tubulin inmunopositive, but I have some troubles with the differentiation because I can´t get MAP2 or NeuN inmunopositive cells (antibodies works well).

    Actually I ´m working with cells on passage 1 or 2 but I don´t make the sphere formation before the differentiation, it mean when the culture is confluent, I start with the differentiation protocol ( neurobasal, B271%, glutamine 2mM, glutamate 0.025mM and antibiotic- antimycotic) I change the medium every 3 days until tha 21 day.

    I really hope that you can help me because I don´t know if I´m doing something wrong.

    Thank you.

    PD. I hope that you can understand my poor english

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    January 13, 2014 - 2:28 PM
  12. Dear François Féron,

    I have read your insightful protocol, and would like to replicate your procedure, possibly for younger rats. Is it possible to perform this isolation procedure on P0-P2 neonatal rats?

    Also, have you directed the differentiation of the olfactory stem cells into neurons that are bipolar and express markers characteristic of mature olfactory sensory neurons? Specifically, do some of the differentiated neurons express OMP? Have you been able to direct neuron differentiation towards the formation of olfactory sensory neurons?

    Thanks for sharing your expertise.

    ~Kind regards

    Reply
    Posted by: Angela D.
    September 27, 2018 - 9:26 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics