Изоляция Носовые Обонятельные стволовых клеток от грызунов и человека

Neuroscience
 

Summary

Мы опишем здесь метод biopsying обонятельной выстилки из крысы и человека полости носа. Эти биопсии могут быть использованы как для идентификации молекулярных аномалий заболеваний мозга или изоляции мультипотентных взрослых стволовых клеток, которые могут быть использованы для трансплантации клеток на животных моделях травмы мозга / болезнь.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Girard, S. D., Devéze, A., Nivet, E., Gepner, B., Roman, F. S., Féron, F. Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans. J. Vis. Exp. (54), e2762, doi:10.3791/2762 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Сборник обонятельной выстилки у крыс

  1. Начните с подготовки трех 35 мм чашки Петри, заполненные DMEM / HAM F12 культуральной среде в чистом капот культуры.
  2. Любой способ эвтаназии должен быть заранее утверждены животных учреждение по уходу и использованию комитет и осуществляется квалифицированным персоналом. После крыса вошла глубокого наркоза натрия фенобарбитала или других инъекционных форм анестезии, такие как кетамин / ксилазина, обезглавить и снимите кожу. Ингалянтами анестетиков следует избегать. Адекватность анестезии будет оцениваться носок щепотку до обезглавливания. Снимите нижнюю челюсть с ножницами и с помощью костные кусачки, устраняют мимические мышцы с обеих сторон.
  3. Начиная с задней резцы, удалить с костные кусачки кости покрытие носовой полости, одна сторона за один раз. Обонятельных раковин появиться как оранжевый / коричневый органов, расположенных в задней части носа.
  4. Деликатно отказаться от раковин с щипцами. Использование 26 иглы, изолировать обонятельной выстилки лежал на перегородки резки ткани по трем направлениям: дуги перпендикулярно пластине, пластинка решетчатой ​​и потолок полости носа.
  5. Сбор биопсии с обеих сторон и передача их в DMEM / HAM F12 заполненные чашке Петри. Эта процедура не должна занять больше времени, чем на 10 минут от начала эвтаназии.
  6. Теперь, для того, чтобы удалить слизь, передача биопсии два раза в среднесрочной заполнены чашках Петри.

2. Сборник обонятельной выстилки у людей

  1. Эта процедура должна осуществляться нос уха и горла (ЛОР) Хирург, в соответствии с соответствующим местным этическим комитетом (ы), и каждый амбулаторно должны подписать форму информированного согласия.
  2. Использование 0 ° или 30 ° жесткий эндоскоп (4 мм), проверьте оба носовые полости и оценить предполагаемые наличие полипов или любого воспалительного поражения. Выберите лучший полости носа, с учетом отклонения перегородки.
  3. Использование хлопка аппликатор, нанесите местной анестезии, такие как лидокаин с адреналином, в течение 10 минут.
  4. С throughcut решетчатой ​​щипцами, собираем два квадратных миллиметра биопсия либо в корне медиальной средней раковины или на перегородку в дорзомедиальном области.
  5. Обонятельные биопсия затем передаются, используя стерильную иглу, в стерильный 2 мл трубки, заполненной 1 мл DMEM / HAM F12. Совет трубки вверх дном, чтобы убедиться, что биопсия погружается в культуральной среде.
  6. Вставьте трубку в рефрижераторный контейнер и транспортируют его к научно-исследовательской лаборатории. На данном этапе, биопсия может быть использован как таковой для сравнительных молекулярных исследований сосредоточено на конкретных заболеваниях головного мозга или обработанные для получения стволовых клеток.

3. Выделение стволовых клеток обонятельного от человека и крысы слизистой оболочки

  1. Вымойте биопсии в DMEM / HAM F12. Инкубируйте биопсии в чашке Петри заливается 1 мл dispase II решение (2,4 МЕ / мл), в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
  2. Далее, при вскрытии микроскоп с перевернутой дифрагированного света, обонятельным эпителием удаляется из основных собственная пластинка использованием микро-шпателем.
  3. Обонятельный эпителий тоньше и выглядит полупрозрачным на черном фоне по сравнению с собственной пластинки которого разделяются оранжевый / коричневый. За белым фоном, эпителий выглядит серым и собственной пластинки, коричневый.
  4. Как только очищенную, передача собственной пластинки в чашке Петри заполнены DMEM / HAM F12.
  5. Если ткань от грызунов, а затем вырезать собственную пластинку на мелкие кусочки с двумя иглами 25 калибра. Затем перенесите штук 15 мл трубки, заполненной 1 мл коллагеназы IA.
  6. В трубке, с помощью стерильной пипетки пластиковые, диссоциируют ткани. Затем, инкубировать трубку в течение 10 минут при температуре 37 ° C.
  7. Для прекращения диссоциации, мягко рок трубки и добавить 9 мл Ca-Mg свободными и без PBS и центрифуга со скоростью 200 г в течение 5 минут.
  8. Ресуспендируют осадок клеток в DMEM / HAM F12 питательной среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и пластину на пластиковой посуды культуры.
  9. Теперь, если ткани человека, то ломтик собственную пластинку в 3 до 4 штук с мощностью от 200 до 500 мкм.
  10. Вставьте каждой полосы в свои 2 см блюдо культуры диаметра и покрывают стерильной ткани с 1,3 см в диаметре скользит стеклянной крышкой.
  11. Затем добавьте 500 мкл культуральной среды (DMEM / HAM F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков) для каждой культуры блюдо.
  12. Для любого типа ткани, обновить культуральной среды каждые 2 до 3 дней.
  13. Через пять-семь дней после того, стволовые клетки начинают вторгаться культуры блюдо и через две недели они должны быть вырожденным. Когда слияния будет достигнут, прохождения и передачи клеткам культуры колб.

4. Формирование сферы и нейронов Differentiation обонятельного стволовых клеток

  1. Для создания сфер стволовых клеток, инкубировать колбы в течение двух часов при температуре 37 ° C с поли-L-лизин. (ТЕКСТ: 5 г/см2).
  2. Пластина клеток при плотности 16000 клеток на квадратный сантиметр в обработанной колб.
  3. Каждые два дня, кормить клеток с 0,2 мл на квадратный сантиметр дополнена средой (DMEM / HAM F12 дополнить инсулин, трансферрин, селен (ITS-X, 1%), ЭФР (50 нг / мл) и FGF2 (50 нг / мл)).
  4. От двух до пяти дней, собрать плавающие сферы клеток и либо повторно пластины или отделить их перед прививкой на животных моделях клеточной терапии.
  5. Чтобы дифференцировать обонятельных стволовых клеток в нейрон-подобные клетки, культивировать их в течение 21 дней в Neurobasal среде, содержащей B-27, пенициллин, стрептомицин, глутамина и глутамата.
  6. Затем сделайте среда меняется каждые 3 дня. Нейрон-подобные клетки должны появиться через две-три недели.

5. Представитель Результаты:

Носовые человека эксплантов-перерастает стволовые клетки (рис. 2А) делятся быстро и слияния может быть достигнута в течение одной-двух недель. Одной из ключевых особенностей stemness, нестин выражения, была оценена (рис. 2В). При росте на поли-L-лизин с бессывороточной культуральной среде дополнен ЭФР (50 нг / мл) и FGF2 (50 нг / мл), обонятельные стволовые клетки приводят к сфере (рис. 2С). При выращивании в сыворотке крови, содержащей культуральной среде вновь покрытием сферы порождают GFAP-клеток, экспрессирующих (~ 50%), тубулина-клеток, экспрессирующих (~ 10-15%) и O4-клеток, экспрессирующих (~ 2-5%) 9 (рис. 2D-F). Тем не менее, судьба сфере клеток, полученных могут быть изменены. Например, при выращивании в Neurobasal культуральной среде дополнен B27 и глутамата, большую часть носовых обонятельных стволовых клеток в нейроподобных клеток, экспрессирующих β-III тубулина (рис. 2G) и MAP2 (рисунок 2H).

Рисунок 1
Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Обонятельные биопсии слизистой оболочки вырезали из крысы или человека носовой полости. Эксплантов можно использовать как таковой для сравнительных молекулярных исследований в целях выявления биомаркеров в заболеваний головного мозга. Для выделения обонятельных стволовых клеток, взаимодействие между собственная пластинка и нервно-эпителия нарушается с dispase II фермент, и после 45 минут, эпителий удаляется с микро-шпателем. Грызунов стволовые клетки обонятельной далее выбран диссоциирующего собственную пластинку с коллагеназы IA. Для человеческой ткани, кусочков обонятельной собственная пластинка культивируют под стекло покровное, пока перерастает стволовые клетки проникают в целом хорошо. После распространения, с использованием подходящей культуральной среде, обонятельные стволовые клетки могут генерировать сфер или дифференцируются в нейрон-подобных клеток. Обонятельные стволовые клетки могут быть использованы для я) ремонт заболеваний мозга или травм или II) идентифицировать молекулярные маркеры заболеваний центральной нервной системы. Иллюстрации сделаны с помощью искусства Servier Medical.

Рисунок 2
Рисунок 2. Культуры и дифференциации носового обоняния человека стволовые клетки. Человека стволовые клетки, растущие из собственной пластинки эксплантов () делятся быстро, при культивировании в сыворотке содержащей среде. Стволовые клетки экспрессируют маркер stemness нестин (B). При посеве на поли-L-лизин покрытием пластика и культивируется в бессывороточной культуральной среде дополнен ЭФР и FGF2, обонятельных стволовых клеток генерировать сфер (С). Сфера клеток, полученных, при посеве в сыворотке содержащих культуральной среде, приводит к GFAP-клеток, экспрессирующих (~ 50%), тубулина-клеток, экспрессирующих (~ 10-15%) и O4-клеток, экспрессирующих (~ 2-5%) 9 (DF). При выращивании в Neurobasal культуральной среде дополнен B27 и глутамата, они дифференцируются в нейроподобных клеток, экспрессирующих β-III тубулина (G) и MAP2 (H).

Discussion

Методы, представленные здесь делают грызунов и человека обонятельной выстилки полезную модель для клинических исследований причин развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний, а также инструмент для ремонта патологических или травмирован мозг. Протокол относительно проста и может быть легко осуществляется опытный биолог клетки. Успеха для биопсии и культуры методов является высокой.

Критические шаги

  • Для сбора грызунов обонятельной выстилки, рекомендуется не превышать лимит времени в 10 минут между эвтаназией и окончательное удаление обонятельной ткани.
  • Диссоциации грызунов обонятельных собственная пластинка обычно достигается через 10 мин. инкубации в коллагеназы IA. Если нет, то мы рекомендуем собирать на следующий день после супернатант, в котором недиссоциированных бит пластинки плавают собственная, центрифуги его на 200 г и механически отделить плавающей пластинки С помощью пипетки Пастера до replating клеток в новой скважины. Первая скважина содержащих уже подключен клетками заполняется свежей питательной среды.
  • Для человека собственная пластинка, которая является более компактным, чем грызунов ткань, мы не рекомендуем ферментативной диссоциации. Ткань нарезанный и каждый эксплантов вставляется между нижней части пластиковой тарелки и стекло покровное. Успешное культур включают эксплантов, толщина которых варьируется от 200 до 500 мкм.

Возможные изменения

  • Текущий протокол может быть слегка изменен для того, чтобы генерировать обонятельных нейронов в пробирке. Для этой цели, нейро-эпителия не удаляется и вся обонятельной выстилки разрезается с вертолета McIlwain (200 мкм, толщина). Каждый эксплантов покрыт в блюдо, частично сушат в течение одного часа и затем регидратации с FCS-содержащих культуральной среде. В течение первых дней после покрытия, эпителиальных и мезенхимальных клетках растут из эксплантов. Затем, нейрон прародителей будут мигрировать на вершине этой слой клеток и дифференцируются в нейроны.
  • Очистка обонятельных стволовые клетки могут быть достигнуты с помощью проточной цитометрии. Специальные маркеры поверхности может быть получен из списка, опубликованного в характеристике бумаги 11.
  • Для трансплантации экспериментов, можно использовать штамм крыс, обонятельных стволовых клеток GFP-положительных. Это крыса деформации (Sprague Dawley, EGFP управляется промоутер ПГК) можно ознакомиться на ITERT (Нант, Франция). Для вставки GFP ген обоняния человека стволовые клетки, мы используем метод, основанный на лентивирус инфекции.
  • Эта статья сосредоточена на обонятельные экто-мезенхимальных стволовых клеток. Однако, другой тип клеток интересов, обонятельные вкладывающийся клеток, могут быть очищены от той же ткани. Мы описали метод их сбора и очистки 1,17 и мы использовали человеческие клетки носовых вкладывающийся для фазы I / II клинических испытаний в страдающий параличом нижних конечностей пациентов 18.
  • Как член мезенхимальных стволовых клеток суперсемейства, OE-МСК способны при соответствующих условиях культуры, к дифференцировке в адипоциты, остеоциты и миоцитов 11.

Будущие приложения

  • Мы уже использовали обоняния человека биопсию для исследования клеточных и молекулярных аномалий у пациентов, страдающих аутизмом, биполярное расстройство, семейные Dysautonomia, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и шизофрения 2-7. Теоретически, все заболевания головного мозга могут быть изучены с помощью носового биопсии или периферических стволовых клеток обонятельного.
  • Грызунов и человека носовых обонятельных стволовых клеток уже были привиты на животных моделях амнезия, болезнь Паркинсона, повреждения и кохлеарные травмы спинного мозга 12-16. Вполне возможно, чтобы пересадить этих клеток в животных моделях болезни Альцгеймера, ишемия мозга, рассеянный склероз.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Работа выполнена при финансовой поддержке ANR (Агентство Национальной де-ла-Recherche), АСМ (Association Française контр ле миопатия), Федер в PACA и IRME (Институт по исследованиям ла Moelle épinière и др. l'Encéphale). Мы с благодарностью поблагодарить Мари Пьер Бланшар (Jean Рош Институт) за эффективную помощь во время записи недействительной.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection of olfactory mucosa in rats
DMEM/HAM F12 Invitrogen 31331-028
Sodium Pentobarbital
Rongeur Fine Science Tools
26 gauge needle Terumo Medical Corp. NN-2613R
Forceps
Collection of olfactory mucosa in humans
Rigid endoscope Karl Storz or Richard Wolf Medical
Lidocaine
Epinephrine
Throughcut ethmoid forceps Karl Storz or Richard Wolf Medical
Isolation of olfactory stem cells
Dispase II Roche Group 10 295 825 001
Dissecting microscope
Micro spatula Fine Science Tools
Collagenase IA Sigma-Aldrich C9891
Ca-free/Mg-free PBS Invitrogen 14190-250
Fetal calf serum Invitrogen 10270098
Glass coverslip Knittel Glaser 001/35
Sphere formation and neuronal differentiation
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P-1274
Insulin transferrin selenium (ITS) Invitrogen 51500056
EGF R&D Systems 236-EG
FGF2 R&D Systems 233-FB
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
Glutamine Invitrogen 25030024
Glutamate Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).
  2. Ronnett, G. V. Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome. Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).
  3. Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia. Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).
  4. Matigian, N. Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders. Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).
  5. Arnold, S. E. Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease. Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).
  6. Boone, N. Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia. PLoS One. (2010).
  7. McCurdy, R. D. Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses. Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).
  8. Roisen, F. J. Adult human olfactory stem cells. Brain Res. 890, 11-22 (2001).
  9. Murrell, W. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).
  10. Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa. Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).
  11. Delorme, B. The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties. Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).
  12. Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery. Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).
  13. Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery. Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).
  14. Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss. Stem Cells. (2011).
  15. Murrell, W. Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease. Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).
  16. Nivet, E. Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice. The Journal of Clinical Investigation. Forthcoming (2011).
  17. Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
  18. Mackay-Sim, A. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial. Brain. 131, 2376-2386 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Hi, firstly I`d like to thank you so much to share this valuable method. I followed your procedure with 8 week old mice and found difficulty with isolation of lamina propria from the epithelium so I skipped that step and seeded whole cells. Is it possible to obtain the stem cell population from mixed cells?

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 15, 2013 - 3:05 AM
  2. It's possible to skip the separation step (removal of olfactory epithelium). At the start, you'll get an unpurified culture but olfactory neurons and progenitors will die within the next three or four days. Some basal and supporting cells will remain in your culture but, after passaging, they will disappear and you'll end up with a culture of proliferative stem cells.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 16, 2013 - 4:07 AM
  3. Thank you again!
    I have some more questions about the morphology of ŒSC and subculture step.
    1. In the mixed (un-seperated) culture, I found various cell types and most of them are on the process of death but few cells seem to proliferate in compact manner. They look like pebbles. Are they ŒSCs?
    ². What reagent do I have to use for subculture? (i.e trypsin or accutase....)
    I greatly appreciate for your kindness. Thank you.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 17, 2013 - 5:34 AM
  4. Answers:
    1. All mature neurons (the vast majority of cells within the epithelium) die shortly after plating. Three main cell types survive: ensheathing cells, stem cells (both cell types display an elongated morphology) and horizontal basal cells (they look like cobblestones). Horizontal basal cells will disappear after passaging and stem cells will overwhelm ensheathing cells.
    ². We passage the cells with the usual cocktail trypsin/EDTA (5 minutes at 37°C).

    Overall, human and rat olfactory stem cells are highly proliferative. Mouse olfactory stem cells are in small number and divide less rapidly.

    All the best.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 17, 2013 - 7:31 AM
  5. Thanks a lot. It Did Worked, I think. While I`ve been studying about Œ-MSCs, I`m wondering if these cells can produce OSNs themselves because in my knowledge, OSNs are derived from basal cells in Œ.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 28, 2013 - 8:52 PM
  6. It's good to hear that you succeeded in culturing Œ-MSCs. For sure, you can differentiate these stem cells into neurons but I don't know if these neurons can express olfactory receptors. It's worth a test. Good luck.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 30, 2013 - 9:00 AM
  7. I have one more question. I have a hard time to make healthy spheres...you`ve mentioned that ' To generate stem cell spheres, incubate the flasks for two hours at 37°C with poly-L-lysine' . Could you tell me why we should use the PLL coating dish? In neural stem cell culture, I routinely use non-coating dish to make spheres ( because they will attached to PL coating dish and start to proliferate in attached single cell state).

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    March 28, 2013 - 8:42 PM
  8. The sphere formation process differs from neural stem cells. A single neural stem cell gives rise to a sphere. Instead,ŒMSCs, when plated at the right density on poly-l-lysine, aggregate and, within ²-7 days, form an islet of cells that will ultimately detach from the dish and float in the culture medium. To get spheres, you need to avoid proliferation (serum is eliminated from the culture medium) and use an FGF/EGF-containing culture medium.

    Reply
    Posted by: francois f.
    March 29, 2013 - 5:13 AM
  9. hello, in the last months I have tried to obtain a culture of stem cells from mouse ... but due to my limited experience with this type of tissue, I do not separate the epithelium from the lamina propria, so I decided to do passages... my question is how many passages are enough to have a homogeneous culture and healthy stem cells from mouse???

    Morphological differences exist between mouse or human culture to make passajes?

    Thanks ....

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    June 4, 2013 - 2:40 PM
  10. Separating the lamina propria and the epithelium are not compulsory. At the start, you'll get a mixed population of cells but after one passage, epithelial cells will disappear rapidly.
    Overall, mouse cells do not proliferate as well as human cells. In order to keep your mouse stem cells growing, I recommend to keep a 50% level of confluency after passaging. If the cell density is too low, the proliferation rate will be minimal.
    Good luck with your experiments,
    Francois Feron

    Reply
    Posted by: francois f.
    June 5, 2013 - 4:28 AM
  11. Dear Dr. Ferón

    My name is Ireri Franco and I wrote to you before asking about the features of the isolation of Olfactory Stem Cells in mouse...these cells are nestin, sox2 and beta III tubulin inmunopositive, but I have some troubles with the differentiation because I can´t get MAP2 or NeuN inmunopositive cells (antibodies works well).

    Actually I ´m working with cells on passage 1 or 2 but I don´t make the sphere formation before the differentiation, it mean when the culture is confluent, I start with the differentiation protocol ( neurobasal, B271%, glutamine 2mM, glutamate 0.025mM and antibiotic- antimycotic) I change the medium every 3 days until tha 21 day.

    I really hope that you can help me because I don´t know if I´m doing something wrong.

    Thank you.

    PD. I hope that you can understand my poor english

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    January 13, 2014 - 2:28 PM
  12. Dear François Féron,

    I have read your insightful protocol, and would like to replicate your procedure, possibly for younger rats. Is it possible to perform this isolation procedure on P0-P2 neonatal rats?

    Also, have you directed the differentiation of the olfactory stem cells into neurons that are bipolar and express markers characteristic of mature olfactory sensory neurons? Specifically, do some of the differentiated neurons express OMP? Have you been able to direct neuron differentiation towards the formation of olfactory sensory neurons?

    Thanks for sharing your expertise.

    ~Kind regards

    Reply
    Posted by: Angela D.
    September 27, 2018 - 9:26 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics