Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

Neuroscience
 

Summary

Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral / enfermedad

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Girard, S. D., Devéze, A., Nivet, E., Gepner, B., Roman, F. S., Féron, F. Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans. J. Vis. Exp. (54), e2762, doi:10.3791/2762 (2011).

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Abstract

La mucosa olfatoria, que se encuentra en la cavidad nasal, se encarga de detectar olores. También es el único tejido nervioso que se encuentra expuesta al ambiente externo y de fácil acceso en todos los individuos que viven. Como resultado, este tejido es único para cualquier persona con el objetivo de identificar las anomalías moleculares en el cerebro patológico o aislar las células madre adultas para la terapia celular.

Alteraciones moleculares en las enfermedades cerebrales son estudiados a menudo usando muestras de tejido nervioso recogido post-mortem. Sin embargo, este material tiene numerosas limitaciones. Por el contrario, la mucosa olfativa es de fácil acceso y puede hacer una biopsia de forma segura sin ningún tipo de pérdida del sentido del olfato 1. En consecuencia, la mucosa olfativa ofrece una "ventana abierta" en el adulto humano a través del cual se puede estudiar el desarrollo (autismo, la esquizofrenia, por ejemplo,) 2-4 o neurodegenerativas (como Parkinson, Alzheimer) enfermedades 4,5. Mucosa olfatoria se puede utilizar ya sea para estudios comparativos molecular 4,6 o en experimentos in vitro sobre la neurogénesis 3,7.

El epitelio olfativo es también un tejido nervioso que produce nuevas neuronas cada día para reemplazar a aquellos que están dañados por la contaminación, bacterias de infecciones virales. Esta neurogénesis permanente se sustenta por los progenitores, sino también las células madre que residen dentro de los dos compartimientos de la mucosa, es decir, la neuroepithelium y el 10.8 lámina propia subyacente. Recientemente hemos desarrollado un método para purificar las células madre adultas ubicados en la lámina propia y, después de haber demostrado que están estrechamente relacionadas con las células mesenquimales de la médula ósea (BM-MSC), que nombró olfativa ecto-mesenquimal de células madre (OE- MSC) 11.

Curiosamente, en comparación con el BM-MSC, OE-MSC mostrar una tasa de proliferación de alto, un clonogenicidad elevado y una inclinación de diferenciarse en células neuronales. Nos aprovechamos de estas características para llevar a cabo estudios específicos para dar a conocer nuevos genes candidatos en la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson 4. Nosotros y otros han demostrado también que la OE-MSC son candidatos prometedores para la terapia celular, después de un traumatismo de la médula espinal 12,13, un daño coclear en un 14 o modelos animales de enfermedad de Parkinson 15 o amnesia 16.

En este estudio, se presentan los métodos de biopsia de mucosa olfatoria en ratas y humanos. Después de la recolección, la lámina propia es enzimáticamente separada del epitelio y las células madre se purifican mediante un enzimáticos o un método no enzimático. Purificada de células olfativas madre pueden ser cultivadas en grandes cantidades y en bancos en nitrógeno líquido o inducidas a formar esferas o diferenciarse en células neuronales. Estas células madre también se pueden utilizar para ómicas comparativa (genómica, transcriptómica, epigenómico, proteómica) los estudios.

Protocol

1. Colección de mucosa olfatoria en ratas

  1. Empezar por la elaboración de tres placas de Petri de 35 mm llena de DMEM / HAM F12 medio de cultivo en una campana de cultivo limpio.
  2. Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado previamente por el cuidado de animales de la institución y el uso comisión y llevado a cabo por personal cualificado. Después de la rata ha entrado en una anestesia profunda con el sodio pentobarbital formas inyectables o de otro tipo de anestesia, como la ketamina / xilazina, decapitar y quitar la piel. Anestésicos inhalados deben ser evitados. Adecuación de la anestesia será evaluada por una pizca dedo antes de la decapitación. Retire la mandíbula inferior con unas tijeras y con la ayuda de una gubia, eliminar los músculos faciales en ambos lados.
  3. A partir de la parte posterior de los incisivos, retire con una gubia del hueso que cubre la cavidad nasal, de un lado a la vez. Los cornetes olfativa entrar en la vista como el naranja / marrón órganos situados en la parte posterior de la nariz.
  4. Delicadamente descartar los cornetes con una pinza. Usando una aguja de calibre 26, aislar la mucosa olfatoria tendido en el tabique al cortar el tejido a lo largo de tres líneas: el arco de la placa perpendicular, la lámina cribiforme y el techo de la cavidad nasal.
  5. Recoger las biopsias de ambos lados y la transferencia en un DMEM / HAM F12 lleno de placa de Petri. Este procedimiento no debería tardar más de 10 minutos de la eutanasia inicio.
  6. Ahora, con el fin de eliminar la mucosidad, la transferencia de las biopsias de dos veces en medio lleno de placas de Petri.

2. Colección de mucosa olfatoria en los seres humanos

  1. Este procedimiento debe ser realizado por un Oído, nariz y garganta (ENT), cirujano, de acuerdo con las disposiciones pertinentes de ética local del comité (s), y todos los pacientes ambulatorios deben firmar un formulario de consentimiento informado.
  2. El uso de un 0 ° o 30 ° endoscopio rígido (4 mm de diámetro), inspeccione ambas cavidades nasales y evaluar la presencia putativa de pólipos o de cualquier lesión inflamatoria. Elige la mejor cavidad nasal, teniendo en cuenta la desviación del tabique.
  3. Utilizando un aplicador de algodón, aplicar un anestésico local, como la lidocaína con epinefrina, durante 10 minutos.
  4. Con unas pinzas etmoidal throughcut, se recoge una biopsia de dos milímetros cuadrados, ya sea en la raíz de la cara medial del cornete medio o en el tabique en la zona dorsomedial.
  5. El olfato biopsia se transfiere, utilizando una aguja estéril, en un tubo estéril de 2 ml llena de 1 ml de DMEM / HAM F12. Punta del tubo hacia abajo para asegurarse de que la biopsia se encuentra inmerso en el medio de cultivo.
  6. Inserte el tubo en un contenedor refrigerado y transporte al laboratorio de investigación. En esta etapa, la biopsia se puede utilizar por sí mismo para estudios comparados molecular centrado en enfermedades específicas del cerebro o procesados ​​para la generación de células madre.

3. Aislamiento de células madre olfativa de humano y de rata Mucosa

  1. Lave las biopsias en DMEM / HAM F12. Incubar las biopsias en una placa de Petri llena con 1 ml de solución dispasa II (2,4 UI / ml), durante 1 hora a 37 ° C.
  2. A continuación, en un microscopio de luz invertida con una difracción, el epitelio olfativo se retira de la lámina propia subyacente con una espátula de micro.
  3. El epitelio olfativo es más delgada y se ve transparente sobre un fondo negro en comparación con la lámina propia, que es a rayas de color naranja / marrón. Sobre un fondo blanco, el epitelio se ve gris y la lámina propia, marrón.
  4. Una vez purificada, la transferencia de la lámina propia en una placa de Petri llena de DMEM / HAM F12.
  5. Si el tejido es de un roedor, a continuación, cortar la lámina propia en pequeños trozos con dos agujas de calibre 25. Entonces, la transferencia de las piezas a un tubo de 15 ml llena de 1 ml de colagenasa IA.
  6. En el tubo, usando una pipeta de plástico estéril, disociar el tejido. A continuación, se incuba el tubo durante 10 minutos a 37 ° C.
  7. Para terminar la disociación, agite con cuidado el tubo y agregar 9 ml de Ca-Mg libre y PBS libre y centrifugar a 200 g durante 5 minutos.
  8. Resuspender el botón celular en DMEM / HAM F12 medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10%, los antibióticos y la placa en placas de cultivo de plástico.
  9. Ahora bien, si el tejido es humano, entonces parte de la lámina propia en 3 a 4 piezas con un grosor de entre 200 a 500 micras.
  10. Insertar cada tira en su propio plato de 2 cm de diámetro y la cultura cubrir el tejido con hojas estériles 1,3 cm de diámetro cubierta de vidrio.
  11. A continuación, añadir 500 l de medio de cultivo (DMEM / HAM F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos) para cada placa de cultivo.
  12. Para cualquier tipo de tejido, renovar el medio de cultivo cada 2 ó 3 días.
  13. De cinco a siete días después, las células madre comienzan a invadir la placa de cultivo y después de dos semanas deben ser confluentes. Cuando se llega a la confluencia, la aprobación y la transferencia de las células a frascos de cultivo.

4. Ámbito de formación y difere neuronalntiation olfativo de las células madre

  1. Para generar ámbitos de células madre, se incuban los frascos durante dos horas a 37 ° C, con poli-L-lisina. (TEXTO: 5 g/cm2).
  2. Placa de las células a una densidad de 16.000 células por centímetro cuadrado en los frascos tratados.
  3. Cada dos días, se alimentan de las células con 0,2 ml por centímetro cuadrado de medio suplementado (DMEM / HAM F12 suplementado con insulina, transferrina, el selenio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) y FGF2 (50 ng / ml)).
  4. De dos a cinco días más tarde, recoger esferas flotantes de células y, o bien la placa de re-o se disocian antes de injerto en modelos animales de la terapia celular.
  5. Para diferenciar las células madre en neuronas olfativas-como las células, las cultivan durante 21 días en un medio que contiene Neurobasal B-27, la penicilina, la estreptomicina, glutamina y glutamato.
  6. De hacer cambios en el medio cada 3 días. Neuronas como células deben aparecer después de dos a tres semanas.

5. Los resultados representativos:

Nasal humano explante, superando las células madre (Figura 2) se dividen rápidamente y se puede llegar a la confluencia en una o dos semanas. Una característica clave de la troncalidad, nestin expresión, fue evaluado (Figura 2B). Cuando se cultiva en poly-L-lisina con un medio de cultivo libre de suero suplementado con EGF (50 ng / ml) y FGF2 (50 ng / ml), las células olfativas madre dan lugar a las esferas (figura 2C). Cuando se cultiva en medio de cultivo que contiene suero recién esferas plateado dar lugar a células que expresan GFAP (~ 50%), las células que expresan la tubulina (~ 10-15%) y O4, que expresan las células (~ 5.2%) 9 (Figuras 2D-F). Sin embargo, el destino de las células derivadas de esfera puede ser modificada. Por ejemplo, cuando se cultivan en un medio de cultivo Neurobasal complementado con B27 y el glutamato, la mayoría de las células madre en neuronas olfativas nasal-como las células que expresan β-tubulina III (Figura 2 G) y MAP2 (Figura 2H).

Figura 1
Figura 1. Esquema general del experimento. Biopsias de la mucosa olfativa son extirpados de ratas o de la cavidad nasal humana. Los explantes se puede utilizar por sí mismo para estudios comparativos con el objetivo molecular para identificar los biomarcadores en enfermedades del cerebro. Para aislar las células olfativas del tallo, las interacciones entre la lámina propia y el epitelio neuro-se interrumpió con la enzima dispasa II y, después de 45 minutos, el epitelio se retira con una espátula de micro. Las células madre son roedores olfativo más seleccionados por la disociación de la lámina propia con colagenasa IA. Para los tejidos humanos, pedazos de lámina propia olfatoria son cultivadas en cubreobjetos de vidrio hasta superando las células madre invaden todo bien. Después de la proliferación, utilizando un medio de cultivo adecuado, las células olfativas madre pueden generar esferas o diferenciarse en neuronas como las células. Células olfativas madre se pueden utilizar para: i) las enfermedades de la reparación cerebral o un traumatismo, o ii) la identificación de marcadores moleculares de enfermedades del sistema nervioso. Las ilustraciones están hechas con la ayuda de Servier arte médico.

Figura 2
Figura 2. Cultura y la diferenciación de células madre humanas nasales olfativas. Las células madre humanas que surgen de la lámina propia explante (A) se dividen rápidamente, cuando se cultivan en un medio que contiene suero. Las células madre expresan la troncalidad marcador nestina (B). Cuando se siembran en poli-L-lisina de plástico y se cultivan en un medio de cultivo libre de suero complementado con EGF y FGF2, las células olfativas madre generar ámbitos (C). Esfera células derivadas, cuando se siembran en el medio de cultivo que contiene suero, dan lugar a células que expresan GFAP (~ 50%), las células que expresan la tubulina (~ 10-15%) y O4, que expresan las células (~ 2.5%) 9 (DF). Cuando se cultiva en un medio de cultivo Neurobasal complementado con B27 y el glutamato, que se diferencian en neuronas como células que expresan β-tubulina III (G) y MAP2 (H).

Discussion

Las técnicas presentadas aquí hacen los roedores y la mucosa olfativa humana un modelo útil para la investigación clínica sobre las causas de las enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativos, así como una herramienta para reparar el cerebro patológico o traumatizados. El protocolo es relativamente sencillo y puede ser fácilmente llevados a cabo por un biólogo celular de la experiencia. La tasa de éxito de las técnicas de biopsia y cultivo es alto.

Los pasos críticos

  • Para la recogida de la mucosa olfatoria de roedores, se recomienda no exceder un límite de tiempo de 10 minutos entre la eutanasia y la escisión definitiva del tejido olfativo.
  • La disociación de la propia lámina de roedores olfativa se logra generalmente después de 10 min. incubación en la colagenasa IA. Si no es así, se recomienda recoger al día siguiente del sobrenadante en el que los bits no disociado de acciones en circulación de la lámina propia, se centrifuga a 200 g y mecánicamente disociar la lámina flotante con una pipeta Pasteur antes de replating las células de un nuevo pozo. El primer pozo que contiene las células ya instalada está llena de medio de cultivo fresco.
  • De la lámina propia humana, que es más compacto que el tejido de los roedores, no recomendamos una disociación enzimática. El tejido se corta y cada explante se inserta entre la parte inferior del plato de plástico y un cubreobjetos. Culturas exitosas incluyen explantes cuyo espesor rango 200 a 500 micras.

Posibles modificaciones

  • El protocolo actual puede ser ligeramente modificada con el fin de generar neuronas olfativas in vitro. A tal efecto, la neuro-epitelio no se quita y la mucosa olfatoria todo se corta con un helicóptero McIlwain (200 micras de espesor). Cada explante se platea en un plato, parcialmente seco durante una hora y luego rehidratados con medio de cultivo que contienen FCS. Durante el forro días después de la primera, las células epiteliales y mesenquimales surgen de los explantes. Entonces, los progenitores neuronales migrarán en la parte superior de esta capa de células y se diferencian en neuronas.
  • Purificación de las células madre olfativa se puede lograr mediante citometría de flujo. Marcadores específicos de superficie puede ser recuperada de la lista publicada en el documento de caracterización 11.
  • Para los experimentos de trasplante, es posible utilizar una cepa de ratones cuyas células olfativas madre son las buenas prácticas agrarias-positivas. Esta cepa de rata (Sprague Dawley, eGFP impulsada por el promotor PGK) está disponible en ITERT (Nantes, Francia). Para insertar el gen de la GFP en las células madre olfativa, se utiliza un método basado en la infección por lentivirus.
  • Este documento se centra en las células madre olfativa ecto-mesenquimal. Sin embargo, otro tipo de célula de interés, las células olfativas ensheathing, puede purificar a partir del mismo tejido. Se describe un método para su obtención y purificación de 1,17 y se utilizaron las células nasales ensheathing de una fase I / IIa de ensayos clínicos en pacientes parapléjicos 18.
  • Como miembro de la superfamilia de las células madre mesenquimales, OE-MSC son capaces, bajo condiciones de cultivo adecuadas, que se diferencian en adipocitos, osteocitos y los miocitos 11.

Las futuras aplicaciones

  • Ya hemos utilizado biopsias humanas olfativas para estudiar las anomalías celulares y moleculares en pacientes con autismo, trastorno bipolar, disautonomía familiar, enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia 2.7. En teoría, todas las enfermedades del cerebro pueden ser estudiados usando biopsias nasales o células madre periféricas olfativo.
  • Roedores y las células madre olfativo nasal ya han sido injertados en modelos animales de la amnesia, la enfermedad de Parkinson, daño coclear y traumatismo de la médula espinal 12-16. Cabe la posibilidad de trasplantar estas células en modelos animales de enfermedad de Alzheimer, isquemia cerebral, la esclerosis múltiple.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Asociación Francesa contra las Miopatías), FEDER en PACA y Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). Nosotros agradecemos a Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) por su ayuda eficiente durante la grabación de lapso de tiempo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection of olfactory mucosa in rats
DMEM/HAM F12 Invitrogen 31331-028
Sodium Pentobarbital
Rongeur Fine Science Tools
26 gauge needle Terumo Medical Corp. NN-2613R
Forceps
Collection of olfactory mucosa in humans
Rigid endoscope Karl Storz or Richard Wolf Medical
Lidocaine
Epinephrine
Throughcut ethmoid forceps Karl Storz or Richard Wolf Medical
Isolation of olfactory stem cells
Dispase II Roche Group 10 295 825 001
Dissecting microscope
Micro spatula Fine Science Tools
Collagenase IA Sigma-Aldrich C9891
Ca-free/Mg-free PBS Invitrogen 14190-250
Fetal calf serum Invitrogen 10270098
Glass coverslip Knittel Glaser 001/35
Sphere formation and neuronal differentiation
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P-1274
Insulin transferrin selenium (ITS) Invitrogen 51500056
EGF R&D Systems 236-EG
FGF2 R&D Systems 233-FB
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
Glutamine Invitrogen 25030024
Glutamate Sigma-Aldrich

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi, firstly I`d like to thank you so much to share this valuable method. I followed your procedure with 8 week old mice and found difficulty with isolation of lamina propria from the epithelium so I skipped that step and seeded whole cells. Is it possible to obtain the stem cell population from mixed cells?

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 15, 2013 - 3:05 AM
  2. It's possible to skip the separation step (removal of olfactory epithelium). At the start, you'll get an unpurified culture but olfactory neurons and progenitors will die within the next three or four days. Some basal and supporting cells will remain in your culture but, after passaging, they will disappear and you'll end up with a culture of proliferative stem cells.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 16, 2013 - 4:07 AM
  3. Thank you again!
    I have some more questions about the morphology of ŒSC and subculture step.
    1. In the mixed (un-seperated) culture, I found various cell types and most of them are on the process of death but few cells seem to proliferate in compact manner. They look like pebbles. Are they ŒSCs?
    ². What reagent do I have to use for subculture? (i.e trypsin or accutase....)
    I greatly appreciate for your kindness. Thank you.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 17, 2013 - 5:34 AM
  4. Answers:
    1. All mature neurons (the vast majority of cells within the epithelium) die shortly after plating. Three main cell types survive: ensheathing cells, stem cells (both cell types display an elongated morphology) and horizontal basal cells (they look like cobblestones). Horizontal basal cells will disappear after passaging and stem cells will overwhelm ensheathing cells.
    ². We passage the cells with the usual cocktail trypsin/EDTA (5 minutes at 37°C).

    Overall, human and rat olfactory stem cells are highly proliferative. Mouse olfactory stem cells are in small number and divide less rapidly.

    All the best.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 17, 2013 - 7:31 AM
  5. Thanks a lot. It Did Worked, I think. While I`ve been studying about Œ-MSCs, I`m wondering if these cells can produce OSNs themselves because in my knowledge, OSNs are derived from basal cells in Œ.

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    January 28, 2013 - 8:52 PM
  6. It's good to hear that you succeeded in culturing Œ-MSCs. For sure, you can differentiate these stem cells into neurons but I don't know if these neurons can express olfactory receptors. It's worth a test. Good luck.

    Reply
    Posted by: francois f.
    January 30, 2013 - 9:00 AM
  7. I have one more question. I have a hard time to make healthy spheres...you`ve mentioned that ' To generate stem cell spheres, incubate the flasks for two hours at 37°C with poly-L-lysine' . Could you tell me why we should use the PLL coating dish? In neural stem cell culture, I routinely use non-coating dish to make spheres ( because they will attached to PL coating dish and start to proliferate in attached single cell state).

    Reply
    Posted by: Yoojin S.
    March 28, 2013 - 8:42 PM
  8. The sphere formation process differs from neural stem cells. A single neural stem cell gives rise to a sphere. Instead,ŒMSCs, when plated at the right density on poly-l-lysine, aggregate and, within ²-7 days, form an islet of cells that will ultimately detach from the dish and float in the culture medium. To get spheres, you need to avoid proliferation (serum is eliminated from the culture medium) and use an FGF/EGF-containing culture medium.

    Reply
    Posted by: francois f.
    March 29, 2013 - 5:13 AM
  9. hello, in the last months I have tried to obtain a culture of stem cells from mouse ... but due to my limited experience with this type of tissue, I do not separate the epithelium from the lamina propria, so I decided to do passages... my question is how many passages are enough to have a homogeneous culture and healthy stem cells from mouse???

    Morphological differences exist between mouse or human culture to make passajes?

    Thanks ....

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    June 4, 2013 - 2:40 PM
  10. Separating the lamina propria and the epithelium are not compulsory. At the start, you'll get a mixed population of cells but after one passage, epithelial cells will disappear rapidly.
    Overall, mouse cells do not proliferate as well as human cells. In order to keep your mouse stem cells growing, I recommend to keep a 50% level of confluency after passaging. If the cell density is too low, the proliferation rate will be minimal.
    Good luck with your experiments,
    Francois Feron

    Reply
    Posted by: francois f.
    June 5, 2013 - 4:28 AM
  11. Dear Dr. Ferón

    My name is Ireri Franco and I wrote to you before asking about the features of the isolation of Olfactory Stem Cells in mouse...these cells are nestin, sox2 and beta III tubulin inmunopositive, but I have some troubles with the differentiation because I can´t get MAP2 or NeuN inmunopositive cells (antibodies works well).

    Actually I ´m working with cells on passage 1 or 2 but I don´t make the sphere formation before the differentiation, it mean when the culture is confluent, I start with the differentiation protocol ( neurobasal, B271%, glutamine 2mM, glutamate 0.025mM and antibiotic- antimycotic) I change the medium every 3 days until tha 21 day.

    I really hope that you can help me because I don´t know if I´m doing something wrong.

    Thank you.

    PD. I hope that you can understand my poor english

    Reply
    Posted by: IRERI F.
    January 13, 2014 - 2:28 PM
  12. Dear François Féron,

    I have read your insightful protocol, and would like to replicate your procedure, possibly for younger rats. Is it possible to perform this isolation procedure on P0-P2 neonatal rats?

    Also, have you directed the differentiation of the olfactory stem cells into neurons that are bipolar and express markers characteristic of mature olfactory sensory neurons? Specifically, do some of the differentiated neurons express OMP? Have you been able to direct neuron differentiation towards the formation of olfactory sensory neurons?

    Thanks for sharing your expertise.

    ~Kind regards

    Reply
    Posted by: Angela D.
    September 27, 2018 - 9:26 AM

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