植入前胚胎,牛,羊,山羊的冷冻保存

Biology
 

Summary

植入前胚胎可冷冻保存,放置到一个高渗cryoprotective溶液后,引起细胞脱水。平衡后,冰晶体的形成是诱导胚胎周围的解决方案。进一步脱水发生胚胎慢慢冷却到零度以下的温度中,前陷入液氮存储。

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Youngs, C. R. Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats. J. Vis. Exp. (54), e2764, doi:10.3791/2764 (2011).

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Abstract

短期或长期贮存,牛,绵羊和山羊的胚胎植入前胚胎可冷冻保存。植入前胚胎细胞主要由水组成,并避免在冷冻保存过程中细胞内冰晶的形成极为重要,以维持胚胎的可行性。胚胎放入一个高渗溶液(1.4 - 1.5米)一个cryoprotective剂,如乙二醇(EG)或甘油(甘油)创建一个渗透梯度,促进细胞脱水(注册会计师)。后胚胎在注册会计师行业的解决方案达到渗透平衡,它们分别加载在高渗注册会计师解决冻结到0.25毫升的塑料吸管。一个控制率冷冻胚胎放入温度-6 ° C。冰晶体的形成是诱发注册会计师围绕胚胎的解决方案,并结晶,导致胚胎以外的注册会计师的浓度增加,导致进一步的细胞脱水。胚胎在0.5 ° C /分钟的速度冷却,使进一步脱水,前暴跌到液氮(-196℃)温度为-34 ° C。必须冻存胚胎解冻前转移到一个收件人(代孕)的女性。秸秆含有胚胎从液氮杜瓦在3至5秒的高温空气室举行,并放置到37℃水浴25至30秒。胚胎冷冻保存在甘油放在取消注册会计师,然后才转移到收件人(代理)女性为10分钟到1米的蔗糖解决方案。 EG中冻存的胚胎,但是,可能会直接传送到收件人的子宫。

Protocol

1。胚胎冷冻保存1评价的适用性

  1. 从收获的个别捐助者的女性生殖道的标本应放入等渗胚胎举行前10分钟使用立体显微镜评价中等。确定每个捐助女性彼此分开,使鉴定的胚胎移植后代的亲子关系,以防止胚胎。
  2. 使用低倍率(≤10倍),从个人的捐助女性标本应隔离到未受精的卵子组成的独立团体,退化的胚胎,或转让的优质胚胎。只有质量等级1或2个胚胎,通过扩大囊胚阶段发展的紧凑型桑椹适合冷冻保存,并应丢弃所有其他(除非同步收件人女性提供质量等级3胚胎和转移后的怀孕率约25 -30%被认为是可以接受的)。
  3. 在放大倍数≥50倍,以确保胚胎透明带是否完好,没有任何材料(例如,细胞,粘液)坚持透明带检查质量等级1和2通过扩大囊胚期胚胎的紧凑型桑葚胚。从其他的胚胎和任何一个透明带破裂或丢失,或用透明带壁材料的胚胎应该分开,要么被丢弃或单独处理。

2。洗涤胚胎减少疾病传播2的可能性

  1. 移动到第一口井胚胎清洗介质中的最小体积等渗胚胎控股中等透明带完整的胚胎(如磷酸盐缓冲生理盐水增强用抗生素和牛血清白蛋白,新生小牛血清,或聚乙烯醇)。远离每个捐赠者的女性独立的胚胎,不要试图超过10胚胎洗一次。移动到每个连续洗胚胎实现连续稀释≥1:100,并一定要使用无菌胚胎处理技巧,改变彼此之间连续洗的最小量的中型。
  2. 将通过4个洗涤如2.1中所述的胚胎。
  3. 如果病毒性疾病的传播值得关注的是,洗胚胎在0.25%胰蛋白酶溶液两次,总合不超过90秒曝光时间,胰蛋白酶。
  4. 后两个胰蛋白酶洗,洗胚胎胚胎清洗介质,如2.1中所述的5倍。
  5. 最后的胚胎洗,到等渗胚胎进行胚胎后举行的媒介。

3。之前脱水胚胎超低温冷冻保存3

  1. 应转入胚胎成一个cryoprotective剂,如乙二醇或甘油(注册会计师)(1.4-1.5摩尔浓度)高渗溶液的等渗胚胎控股介质的最小量。
  2. 允许胚胎在冷冻液(高渗会计师事务所的解决方案)坐,直到他们达到渗透平衡。由于乙二醇比甘油,平衡时间通常为乙二醇(5分钟)的胚胎小于甘油(10分钟)更迅速地渗透胚胎干细胞。实现这种平衡时间的部分原因可能是期间和胚胎后,加载到秸秆(下一步)。

4。加载到0.25毫升的塑料吸管为超低温冷冻保存的胚胎

  1. 0.25毫升的塑料吸管(11.5厘米长)胚胎加载装置的棉塞端连接,并吸进一个正确标记的秸秆约1.3厘米高渗会计师事务所的解决方案。存在各种标签程序,包括使用印刷标签附在一根稻草密封塞,或用吸管适配器连接的另一个秸秆。
  2. 从注册会计师行业的解决方案中删除的稻草,并吸出约0.15厘米的空气,创造一个微小的气泡内的救命稻草。
  3. 吸进的秸秆在高渗会计师溶液约0.8厘米的单胚胎。
  4. 从注册会计师行业的解决方案中删除的稻草和吸的空气约0.15厘米内的秸秆创建第二个微小的气泡(气泡为胚胎内的秸秆进行​​物理隔离)。
  5. 吸约9.1厘米,注册会计师的解决方案,以完全填充稻草,一定足量的会计师事务所的解决方案,提请滋润的聚氯乙烯(PVC)粉末内的秸秆棉塞端存在。注册会计师的解决方案导致的PVC粉凝胶和密封,秸秆结束。
  6. 另一端的吸管,PVC粉,塑料吸管密封塞,或热封口机密封。

5。放入胚胎可控速率胚胎冷冻机

  1. 无论是甲醇浴缸或气相液氮冷冻机可以编程植入前胚胎冷冻保存。
  2. 加载包含安莉芳的吸管 OS成冷冻机,其温度已经冷却环境温度-6 ° C。负载秸秆棉塞端(除非塑料吸管密封塞或稻草适配器正在使用中,在这种情况下,棉塞端放置)。
  3. 允许胚胎在此温度下至少2分钟,然后再继续坐在。

6。播种

  1. 一旦胚胎冷却至-6℃,用一双钳子在液氮(或棉签棒浸入液态氮中)冷诱导内的秸秆通过触摸钳(或棉注册会计师的解决方案中的冰晶体的形成尖棍),以高于或低于胚胎的解决方案列。
  2. 在接触到液态氮的地区注册会计师的解决方案中的水将结晶,冰晶会扩散到周围胚胎注册会计师行业的解决方案中的列。
  3. 在播种前进一步冷却10分钟的温度保持胚胎。

7。继续脱水胚胎

  1. 酷胚胎率在0.5 ° C /分钟下降到温度为-34 ° C。这种冷却速度是很重要的,以确保胚胎的继续脱水。
  2. 保持胚胎在-34 ° 10分钟前陷入胚胎液氮(-196℃)。
  3. 广场冻存胚胎适当标记的高脚杯,连接到一个适当的标记甘蔗(充满液氮),并将其放置到短期或长期贮存的液氮杜瓦罐甘蔗。

8。解冻冻存胚胎

  1. 拉入罐,液氮杜瓦颈部确保罐仍低于霜线在杜瓦。
  2. 找到甘蔗含有胚胎解冻,并迅速和小心地取出高脚杯稻草,一定不暖在杯状的其他秸秆。
  3. 秸秆在空气中保持3-5秒(以减少裂纹的透明 4发生率),然后浸入到37℃水浴一个额外的25-30秒。
  4. 从水浴中取出的稻草,擦拭秸秆(小心不要涂抹秸秆胚胎鉴定),使用秸秆切割装置剪断稻草非棉塞端(如果密封采用热或PVC粉),或小心地取下塑料密封塞,并且:
    1. 加载到一个胚胎移植设备和传输的秸秆尽快同步胚胎收件人(但只有在胚胎冷冻保存使用乙二醇作为注册会计师),或
    2. 开放的秸秆结束缓缴菜含有蔗糖的1.0摩尔浓度(非渗透的复合),并用一把剪刀切断的秸秆棉塞端。秸秆的内容应该自由流动的蔗糖溶液,但推动的空气通过吸管的小柱可能是必要的,如果存在任何残留的培养基内的秸秆。允许胚胎在蔗糖溶液中保持10分钟,然后转移到等渗胚胎的胚胎,保持10分钟的中等。评估胚胎解冻后,装入一个新的稻草,并转移到合适的收件人女性。

9。代表性的成果:

多种因素可能影响妊娠和活产率从解冻植入前胚胎转移到同步收件人女性5。在欠发达比紧凑型桑椹或更先进的比扩大囊胚发育阶段的胚胎往往不生存在紧凑的桑葚胚冷冻保存过程,以及胚胎早期囊胚,囊胚,并扩大胚胎发育的囊胚阶段。胚胎质量的1级和2产量有较大幅度的解冻后的怀孕率比质量3级胚胎(通常是不能冷冻保存,由于低解冻后的怀孕率)。在胚胎冷冻胚胎解冻程序的胚胎处理不当,可能表现出减少的怀孕率。转移到收件人女性动情周期的不同步捐助女的胚胎通常会产生降低受孕率。 在体外生产,或以某种方式操纵(例如,活检或一分为二)的胚胎通常产量降低受孕率。在最佳条件下,冷冻山羊体内源性胚胎解冻,通常是60-70%,在 6,7, 8,9,10,11在65-75%和60-70%的转让后获得的怀孕率12,13,14,15。同样的,转让后获得的怀孕率,解冻在体外胚胎生产,通常是40-50%,在牛6,16,羊17 25-35%,山羊18的30-40%。

表1“/>

表1预期的冻融胚胎转移,从国内反刍家畜品种同步收件人女性的怀孕率。

Discussion

因为胚胎主要由水组成的,至关重要的是,植入前胚胎充分脱水,慢慢冷却按照协议本文所述,以避免细胞内冰晶的形成。一旦冷却过程已经开始,重要的是保持单向的温度变化,并避免温度波动。冰晶体的形成,在适宜的温度为注册会计师的具体解决方案(“播种”)的启动是至关重要的。

这种缓慢的冷却/快速解冻植入前胚胎冷冻保存的方法进行修改,包括一个步骤方法(其中的介质装入稻草的最后一列是蔗糖,而不是会计师事务所解决方案)第19条和直接传输方法(乙二醇冷冻胚胎解冻,并直接传送到收件人的女性的子宫,而无需首先去除乙二醇的胚胎)20。为了减少乙二醇量沉积的直接转移(DT)收件人女性子宫,最好是6厘米,然后再继续如前所述介质填充的0.25毫升的稻草。应该指出的是一个自愿性标准范围内的商业,植入前胚胎冷冻保存为DT,应冻结黄色秸秆和储存在液态氮杜瓦黄色高脚杯中的胚胎移植产业存在。商业界也有具体的标签要求,对所有应遵循的冻存胚胎。

这种方法的一个替代 21玻璃化冷冻,冷冻保存的地方,更高度集中(6-8 M)会计师事务所的解决方案是超快速冷却,使注册会计师的解决方案,变更,恕不另行冰从液态到一个“玻璃”的状态非平衡的方法晶体的形成。玻璃化冷冻保存的胚胎发育比先进的紧凑桑椹由于其对温度的敏感性增加很可能更适合。

这种技术的应用程序保存独特的种质资源22,以及国际商业胚胎移植产业超过55%,约50万牛胚胎植入前胚胎转移在2008 日历年的23冻存。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

从美国农业部的多国研究项目的部分资金的W - 2171“生殖细胞和胚胎发育和家畜改良的操作”是表示感谢。瑞安卡拉汉,谁准备的这篇文章中的视频部分的技术插图,艺术人才也表示感谢。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioLife freeze medium Agtech, Inc. C18, C18A 1.5 M ethylene glycol
Emcare ethylene glycol freeze solution ICPBio Reproduction IC8, IC10 1.5 M ethylene glycol
ViGro ethylene glycol freeze plus Bioniche Animal Health EVM835 1.5 M ethylene glycol
Emcare 10% glycerol freeze solution ICPBio Reproduction IC12 1.34 M glycerol
Emcare 1 M sucrose thaw ICPBio Reproduction IC16 1.0 M sucrose
ViGro one-step thaw Bioniche Animal Health EVM247, EVM847 1.0 M sucrose
ViGrothaw 1-2-3 plus Bioniche Animal Health EVM248, EVM848 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose
Emcare CSU thawing kit ICPBio Reproduction IC20 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose
BioLife holding and transfer medium Agtech, Inc. C15, C15A modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin)
Emcare holding solution ICPBio Reproduction IC2, IC4, IC6 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions)
ViGro holding plus Bioniche Animal Health EVM024, EVM824
SYNGROHolding medium Bioniche Animal Health ESM024, ESM224, ESM828 contains hyaluronan; no products of animal origin
BioLife modified D- PBS Agtech, Inc. C06 modified Dulbecco's phosphate buffered saline
BioLifeBSA Fraction V Agtech, Inc. B09 lyophilized bovine serum albumin, fraction V
BioLifeantibiotic-antimycotic Agtech, Inc. B01 amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate
BioLifetrypsin kit Agtech, Inc. C22A 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS
Biol-Cool controlled rate freezer FTS Systems BC-IV -40 Methanol bath freezer
Freeze Control controlled rate freezer Cryologic CL2200 Liquid nitrogen freezer

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References

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Comments

2 Comments

  1. Congratulations for this video.I hope you can upload a vitrification one.I am very interested in videos related with embryo morphology and quality evaluation, superovulation and embryo transfer.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 26, 2011 - 12:46 PM
  2. Really very helpuful material, it will be nice to get other videos about other techniques like embryo splitting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2012 - 10:55 AM

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