高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议

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Immunology and Infection

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Summary

我们目前我们优化的高通量nucleofection协议,要么质粒DNA或不会造成细胞的成熟的siRNA转染初级人类单核细胞衍生的树突状细胞的有效方法。我们进一步提供证据证明为成功的siRNA沉默靶基因的mRNA和蛋白水平的RIG - I。

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Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation. J. Vis. Exp. (53), e2766, doi:10.3791/2766 (2011).

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Abstract

树突状细胞可以被认为是其中发挥关键作用,在其发起和响应感染 1的免疫系统的哨兵。天真区议会致病抗原的检测是通过模式识别受体(PRRS)是能够识别特定病原体相关分子模式(PAMPS)的保守结构。区议会PAMPS检测触发细胞内的信号级联,导致他们的活化和转化为成熟DC。这个过程通常是通过对1型干扰素的生产特点以及与其他炎性细胞因子,如MHCII和CD86和迁移的淋巴结,与T细胞相互作用启动适应性免疫反应的成熟DC的细胞表面标志上调, 3。因此,区议会的联系先天免疫和适应性免疫系统。

解剖的基本直流响应,以各种病原体的分子网络的能力是至关重要的,以更好地了解了这些信号通路的调控和诱导基因。它也应当有助于促进DC为基础的疫苗针对传染病和肿瘤的发展。然而,此行的研究已经严重阻碍,难以转染的主要区议会 4 。

病毒转导的方法,如慢病毒系统,通常使用的,但携带很多限制,如复杂性和有害生物风险( 相关费用)5,6,7,8。此外,该病毒基因产物的交付增加转区议会 9,10,11,12的免疫原性。电穿孔技术已用于13,14,15结果好坏参半,但我们是第一个报告使用一种高通量的转染协议和确凿证明其效用。

在这份报告中,我们总结了一个优化的商业协议,高通量转染人类的主要区议会,与有限的细胞毒性和一个 DC成熟16的情况下。转染效率(GFP质粒)和细胞活力分别超过50%和70%。流式细胞仪分析建立的成熟标志物CD86和MHCII转染细胞中表达增加的情况下,而定量RT - PCR结果显示没有IFNβ上调。使用此电协议,我们提供证据议会成功转染siRNA和有效的敲有针对性的基因RIG - I,16,17一个关键的病毒识别受体的mRNA和蛋白水平,。

Protocol

1。计划Amaxa 96穿梭Nucleofector

  1. 打开一个新的参数文件。
  2. 选择您将使用标准的转拖动光标在96孔板图,井的数量。使用至少3口井,池,每个实验样品。
  3. 输入程序代码:在第一部分选择“FF”,并在第2部分选择'168'从下拉式菜单
  4. 从解决方案中,选择“单核细胞,人类”
  5. 在控制选项,选择“标准”。
  6. 点击应用。
  7. 包括无染控制,从图中选择进一步根据需要,然后选择“没有计划控制”控制选项,并单击Apply井。
  8. 选择任何的板图上剩余的未使用的水井和点击取消定义。

2。准备转区议会

  1. 一切工作都要在细胞培养罩在可能的情况下无菌条件下进行。准备加入96 nucleofection解决方案以及补充96人单核细胞以及在450到2025年的比例Nucleofector解决方案。混合,让温暖室温。您需要的解决方案nucleofection20μL,每口井。作出超过10%,让移液错误。
  2. 将nucleocuvette模块,你需要在正确的方向,即nucleocuvette板插入1和第2行第一个。
  3. 确定为您的实验400克离心10min后,在50万个以及细胞和颗粒细胞计算所需的DC。小心去除上清。
  4. 重悬浮在nucleofection溶液中轻轻吹打向上和向下几次的细胞。
  5. 分成特定的治疗如GLO和RIG - I标记eppendorfs的悬浮细胞的正确的卷。
  6. 添加吹打每50万细胞和混合0.25μg的siRNA。使用非针对你不转染对照样品的siRNA。
  7. 移取20μL到nucleocuvette模块上述混合物中,根据实验布局,确保液体被传递到井底。
  8. 盖上盖子nucleocuvette板和挖掘了几次,在坚硬的表面,以帮助确保去除气泡板。

3。转染区议会

  1. Nucleofector 96穿梭托盘插入板,点击上传,然后开始。
  2. 按照圈上方显示转染过程中的进展情况;一个绿色背景上的黑十字标志,以及在成功转染,而红色背景上的一个黑条意味着它是不成功的。
  3. 在转染过程完成后,删除板和直流生长介质中添加每口井使用多道移液器80μl。
  4. 盘10分钟在37 ° C和5%的CO 2。
  5. 从nucleocuvettes转移到矩阵管的预热直流生长培养基中含有100μL100μL量,保持正确的方向。
  6. 取下并丢弃那些管的地方转没有发生。
  7. 在37 ° C和5%的CO 2为24小时或其他所需的时间间隔。

4。感染新城疫病毒细胞

  1. 每个实验样品取出矩阵管从孵化器到细胞培养罩和池管到eppendorfs
  2. 颗粒细胞轻轻在桌面离心纺丝5分钟,去除上清液。
  3. 重悬在无血清的增长介质中含有新城疫病毒的细胞在MOI为1,并在37 ° C和5% CO 2为45分钟eppendorfs松散覆盖在无菌的方式。
  4. 添加直流生长培养基900μl,和重新孵育8-10小时

5。收获细胞

  1. 纺eppendorfs在桌面离心机,去除上清液,沉淀细胞。
  2. 收获细胞RNA或蛋白质的提取,根据您的协议。

6。代表性的成果:

使用我们的优化协议,我们转染 DC瑞吉,针对24小时的siRNA,然后感染新城疫病毒(RIG - I检测到一个副粘病毒)的细胞刺激干扰素反应途径。 QRT - PCR分析表明敲的基因在转录水平的75%。我们还观察到一个类似IFNβ表达减少,在干扰素信号级联,这是一个RIG - I的下游效应。此外,我们观察到,在非疫区,控制转染的细胞表达IFNβ,没有检测 MXA,IFNβ下游反应基因,是最小的(图1A)。

一个区议会第二次转瑞吉靶向的siRNA进行足够的细胞包括免疫印迹分析。凡RT - PCR结果相似,我们看到以前(敲除RIG - IIFNβ表达分别下降62%和66%)(图1B),免疫印迹检测RIG - I显示,该基因的表达已完全阻断(图1C)。

图1A
图1。 (一)MoDCs或者siRNA的转染靶向的RIG - I或GLO的siRNA和非特异性的RIG - I,IFNβ和QRT - PCR确定MXA的表达效果。转染协议,用于单核细胞特定的缓冲和nucleoporation方案FF168(龙沙Walkersville公司)以下潜伏期为24小时,转染的细胞被感染了新城疫病毒(+)或左未受感染者( - )。进一步潜伏期为10小时后,收获细胞和RNA提取的转录水平代表两个重复实验的结果。从鲍尔斯 16。(二)从一个不同的棕黄色大衣图1A MoDCs再次转任的RIG - I靶向siRNA或使用相同的转染上述协议的非特异性GLO的siRNA 。一个额外的控制,使用未转染MoDCs纳入实验。所有细胞与鸡新城疫病毒感染,并为进一步的RNA和蛋白质的提取收获前10 h孵育后培养24 h。 RIG - I,IFNβMXA QRT - PCR确定的转录水平代表两个重复实验的结果。鲍尔斯 16(C)从上面的图1B中描述的细胞裂解液,免疫印迹分析。泳道1和2,未转染细胞裂解液;泳道3和4,来自GLO siRNA转染细胞裂解液;泳道5和6,RIG -我靶向的siRNA转染细胞裂解液。样品探测RIG - I,也GAPDH的装载控制和重复运行。摘自鲍尔斯 16。

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Discussion

幼稚的初级树突状细胞的高效转染重要的是,在这关键的细胞介导的​​先天适应性免疫过渡的细胞炎症通路的高通量分析和逆向工程。然而,大多数研究人员发现,这些细胞是难以转染效率和转染过程诱导细胞成熟时,使用标准的转染技术。我们研究了克服这些限制是否可以由高吞吐量协议优化使用,同时,独立96以及商业核转染系统(龙沙)。

利用荧光激活细胞分选(FACS),我们测得的绿色荧光蛋白表达质粒转染效率和标志物CD86和MHCII免疫细胞成熟的读数。一系列实验评估缓冲器和电的方案,最终确定的条件显示> 50%的转染和成熟的标志物增加的情况下。

为了进一步探讨的nucleofection过程中可能激活区议会,我们分析,在mRNA水平的IFNβ的表达水平和其下游反应基因 MXA。MXA表达极其敏感IFNβ生产的,可用于生物活性检测到非常低的水平在cytokine18。通过定量RT - PCR分析,我们看到没有检测 IFNβ表达,但确实看到一些MXA从而表明上述基准IFNβ诱导上调。然而,这在非疫区,控制转染细胞的MXA最小上调相比是微不足道的,从病毒介导的刺激IFNβ信号级联反应(图1A),并确认不激活转染区议会,我们可以成功地使用我们的nucleoporation协议任何重大的水平。

Western blot分析证实了我们的优化协议的效用。针对RIG - I造成完全丧失了检测的RIG - I蛋白(图1C)。siRNA的转染区议会我们应该注意到,其他基因的成功扰动,用量的siRNA转染时间长短可能要优化。

据我们所知,这项工作使首次设计的高通量功能丧失,在人类的主要区议会的研究,从而解决了一个困难的障碍,在这一领域的研究。这应提供新的机遇和直流电信号的研究可能有助于在开发基于DC免疫治疗的进步。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

该项目是由美国国立卫生研究院NIAID的合同号HHSN2662000500021C支持。我们感谢他的技术援助名臣。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Lonza Inc. 108S0109 Serial number
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit Lonza Inc. VHPA-2007 Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates
RIG-I siRNA Dharmacon L-012511-00
GLO siRNA Dharmacon D-001600-01-20
RPMI 1640 Invitrogen 11875 Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium
DMEM Invitrogen 11965
L-glutamine Invitrogen 25030081
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070063
Fetal Calf Serum Hyclone 3070.03
Dendritic Cells New York Blood center DCs are purified from buffy coats using a standard procedure

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References

  1. Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
  2. Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  3. Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
  4. Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
  5. Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
  6. Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
  7. Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
  8. Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
  9. Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
  10. Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
  11. Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
  12. Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
  13. Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
  14. Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
  15. Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
  16. Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. Forthcoming Forthcoming.
  17. Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
  18. Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
  19. Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).

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