मल्टीप्लेक्स पीसीआर और रिवर्स रेखा ब्लाट संकरण परख (mPCR / RLB)

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Summary

एक सस्ती, 43 आणविक लक्ष्य तक की एक साथ पता लगाने के लिए उच्च throughput विधि वर्णित है. MPCR / RLB के आवेदन माइक्रोबियल टाइपिंग और नैदानिक ​​नमूनों से कई रोगज़नक़ों का पता लगाने में शामिल हैं.

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O'Sullivan, M. V. N., Zhou, F., Sintchenko, V., Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB). J. Vis. Exp. (54), e2781, doi:10.3791/2781 (2011).

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Abstract

मल्टीप्लेक्स पीसीआर / रिवर्स रेखा ब्लाट संकरण परख एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर एक नायलॉन झिल्ली, जो फिर से प्रयोग करने योग्य है पर जांच संकरण द्वारा पीछा प्रतिक्रिया का उपयोग 43 नमूनों में 43 आणविक लक्ष्य तक का पता लगाने की अनुमति देता है. जांच 5 'झिल्ली को निर्धारण की अनुमति के लिए संशोधित amine कर रहे हैं. प्राइमर्स हैं 5 'बायोटिन संशोधित जो संकरित पीसीआर streptavidin peroxidase और सहज फिल्म के माध्यम से एक chemiluminescent सब्सट्रेट का उपयोग उत्पादों का पता लगाने की अनुमति देता है. कम सेटअप और उपभोज्य लागत के साथ, इस तकनीक सस्ती है (अमेरिकी डॉलर प्रति नमूना लगभग 2), उच्च (एक साथ कई झिल्ली संसाधित किया जा सकता है) throughput और एक छोटे प्रतिवर्तन समय (लगभग 10 घंटे) है.

तकनीक तरीके का एक संख्या में उपयोग किया जा सकता है. एकाधिक जांच के लिए एक एकल उत्पाद प्रवर्धित भीतर अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, या एक साथ कई उत्पादों परिलक्षित किया जा सकता है, एक (या अधिक) बाद में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जांच के साथ. दोनों तरीकों का एक संयोजन भी एक एकल परख के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ही लक्ष्य अनुक्रम के लिए कई जांच को शामिल करने की क्षमता परख अत्यधिक विशिष्ट बनाता है.

MPCR / RLB के प्रकाशन अनुप्रयोगों के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों 1,2 का पता लगाने में शामिल हैं, Methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus aureus 3-5 और साल्मोनेला 6 एसपी, स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया 7,8, 9 स्ट्रैपटोकोकस agalactiae और 10,11 enteroviruses, पहचान की आणविक serotyping के टाइप माइकोबैक्टीरियम सपा 12, 13-15 जननांग और श्वसन पथ के 16 और अन्य 17 रोगज़नक़ों और पता लगाने और 18 mollicutes की पहचान का पता लगाने के के . हालांकि, तकनीक के बहुमुखी प्रतिभा का मतलब है अनुप्रयोगों वस्तुतः असीमित है और सूक्ष्म जीवों की आणविक विश्लेषण करने के लिए सीमित नहीं हैं.

mPCR / RLB में पांच चरणों में एक प्राइमर) और जांच डिजाइन, ख) डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर प्रवर्धन ग) झिल्ली की तैयारी, घ) संकरण और पहचान कर रहे हैं, और ई) झिल्ली के उत्थान.

Protocol

सावधानी से विचार प्राइमर और जांच डिजाइन को दिया जाना चाहिए. GenBank जैसे डेटाबेस से हित के लक्ष्य के सभी उपलब्ध दृश्यों के लिए संरक्षित क्षेत्रों में जो उपयुक्त लक्ष्य कर रहे हैं की पहचान के लिए उपयोग किया जाना चाहिए. कहाँ लक्ष्य की एक बड़ी संख्या में एक एकल mPCR परख में परिलक्षित कर रहे हैं किया जा रहा है, प्रत्येक प्रवर्धित अनुक्रम समान लंबाई की, और अधिक प्रतिस्पर्धा से बचने नहीं करना चाहिए 300 आधार जोड़े चाहिए. विधि का एक वैकल्पिक आवेदन करने के लिए एक लंबे समय तक संरक्षित क्षेत्रों के खिलाफ प्राइमरों का उपयोग कर लक्ष्य बढ़ाना और एकाधिक जांच का उपयोग करने के लिए amplicon भीतर अनुक्रम भिन्नता की पहचान है. इस उदाहरण में, प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद अब हो सकता है. प्राइमर annealing तापमान तदनुसार समायोजित पीसीआर स्थितियों के साथ सभी समान होना चाहिए,. प्राइमर्स जो मजबूत माध्यमिक संरचना या प्राइमर डिमर रूप से बचा जाना चाहिए. सिग्मा Aldrich डीएनए कैलकुलेटर ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) मज़बूती से इन सुविधाओं की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

डीएनए जांच करने के लिए 60 से करीब तापमान ° सी. annealing है डिजाइन किया जाना चाहिए विशिष्टता को अधिकतम करने के लिए, ब्याज की प्रत्येक लक्ष्य के लिए दो जांच परख, एक आगे डीएनए रिवर्स प्राइमर बाध्यकारी साइट के लिए आसन्न कतरा के लिए hybridizing, और रिवर्स आगे प्राइमर बाध्यकारी साइट के लिए आसन्न कतरा के लिए अन्य में शामिल किया जा सकता है. इस मामले में, दोनों को आगे और रिवर्स प्राइमरों बायोटिन संशोधित किया जाना चाहिए. यदि प्रवर्धित लक्ष्य प्रति केवल एक ही जांच इस्तेमाल किया जा रहा है, तो केवल एक प्राइमर हो बायोटिन संशोधित की जरूरत है.

जब प्राइमरों और जांच परख / mPCR RLB के लिए डिजाइन यह दृढ़ता सिलिको तरीकों में का उपयोग करने के लिए पीसीआर उत्पादों और जांच संकरण की भविष्यवाणी के लिए इन विट्रो परिणामों में के साथ सहसंबंधी करने की सलाह दी है. आदर्श रूप में यह आइसोलेट्स जिसके लिए पूरे जीनोम अनुक्रम उपलब्ध है का उपयोग किया जाता है. FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html पर उपलब्ध है) के रूप में सॉफ्टवेयर इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कमजोर या अनुपस्थित जांच सिग्नल जहां सिलिको विश्लेषण में आधार जोड़ी बेमेल कम तापमान annealing जांच में जिसके परिणामस्वरूप का संकेत भविष्यवाणी की जा सकती है.

डीएनए निष्कर्षण तकनीकों परीक्षण किया जा रहा नमूनों के आधार पर भिन्न होगा, और पीसीआर स्थितियों प्राइमर डिजाइन पर निर्भर हो जाएगा. पाठकों व्यक्तिगत assays पर डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर अभिकर्मकों और 1-19 शर्तों के बारे में अधिक जानकारी के लिए प्रकाशन के लिए भेजा जाता है.

प्रत्येक परख उचित नियंत्रण के साथ चलाया जाता है कम से कम एक सकारात्मक और एक नकारात्मक झिल्ली पर प्रत्येक जांच के लिए जांच संकेत, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक डीएनए से मुक्त नियंत्रण प्रदान. इसके अलावा यह झिल्ली है कि सभी नमूनों (जैसे: एक सूक्ष्म जीव के मामले में या प्रजातियों जीनस विशिष्ट जांच) के लिए सकारात्मक होने की उम्मीद है के शीर्ष पर एक जांच में शामिल करने के लिए फायदेमंद है. यह एक सकारात्मक नियंत्रण जांच के रूप में कार्य करता है, लेकिन यह भी परिणामों की आसान अभिविन्यास परमिट.

1. झिल्ली की तैयारी

  1. निम्न समाधानों को तैयार:
    • 100ml 0.5m NaHCO3 (8.4 पीएच)
    • 100 मिलीलीटर 0.5m 3 NaHCO
    • 20 मिली 16% EDAC
    • 250 मिलीलीटर 0.1 एम NaOH
    • 250 मिलीलीटर 2xSSPE
    • Waterbath में 60 डिग्री सेल्सियस पर जगह - 250 मिलीलीटर 2xSSPE/0.1% एसडीएस
    • 250 मिलीलीटर 20 मिमी EDTA.
  2. पूर्व गर्मी 60 डिग्री सेल्सियस के लिए ओवन
  3. 70% इथेनॉल के साथ साफ Immunetics Miniblotter.
  4. 2 pmol / μl के अंतिम एकाग्रता और 200 μl की एक मात्रा 0.5 एम 3 NaHCO में oligonucleotide जांच पतला.
  5. 15x15 सेमी BiodyneC नायलॉन झिल्ली कट. एक पेंसिल और शासक का प्रयोग, झिल्ली के शीर्ष भर में एक 0.5 सेमी अंतरिक्ष नियम और विवरण यहाँ लिखने के.
  6. 20 मिलीलीटर से प्लास्टिक की थैली में सील झिल्ली हौसले से 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16% EDAC समाधान और रॉक बनाया.
  7. Deionised पानी में 30 सेकंड के लिए झिल्ली धो लें.
  8. Miniblotter में झिल्ली (पेंसिल लाइन के समानांतर) के पार चल रहे चैनलों के साथ प्लेस झिल्ली. जगह और करीब स्याहीचट में समर्थन तकिया रखो. चैनलों से तरल पदार्थ Aspirate.
  9. गलियों 1 और 45 150 μl 0.5 एम 3 NaHCO के साथ भरें . प्रत्येक जांच के समाधान के 150 μl प्रयोग 2-44 अनुक्रम में गलियों को भरने के लिए, हवाई बुलबुले से बचने के सावधान किया जा रहा है. यदि एक हवाई बुलबुले चैनल में प्रकट होता है, जगह में पिपेट रखने, तेजी से समाधान aspirate हवा बुलबुला विंदुक के शीर्ष करने के लिए फ्लोट करने की अनुमति है, तो पुन: प्रयास करें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  10. जांच के समाधान Aspirate के लिए, झिल्ली को हटा दें और 9 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 250 मिलीलीटर 0.1 एम NaOH में धो.
  11. 250 मिलीलीटर 2xSSPE में 30 सेकंड के लिए झिल्ली धो लें.
  12. 250 मिलीलीटर पूर्व गर्म ओवन में 2xSSPE/0.1% एसडीएस में 60 झिल्ली धो डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए.
  13. यदि संकरण के लिए नहीं इस्तेमाल किया जा रहा तुरंत, 20 मिनट (शेष 10ml आरक्षित) के लिए 240 मिलीलीटर 20 मिमी EDTA में झिल्ली कमरे के तापमान पर धो, तो प्लास्टिक की थैली में शेष 10 मिलीलीटर 20 मिमी EDTA और stor के साथ झिल्ली सीलरेफ्रिजरेटर में 4 पर ई ° सी.
  14. डिटर्जेंट और ब्रश Pyroneg के साथ miniblotter धो लें. कुल्ला और सूखी अनुमति देते हैं.

2. संकरण और पता लगाने

  1. निम्न समाधानों को तैयार:
    • पानी के स्नान में में 60 स्टोर डिग्री सेल्सियस - 250 मिलीलीटर 2xSSPE/0.1% एसडीएस
    • पानी के स्नान में दुकान पर 60 ° C-500 मिलीलीटर 2xSSPE/0.5% एसडीएस
    • 500 मिलीलीटर 2xSSPE/0.5% एसडीएस - ओवन में 42 स्टोर डिग्री सेल्सियस
    • 500 मिलीलीटर 2xSSPE - कमरे के तापमान पर रखना
    • पानी के स्नान में 60 स्टोर ° सी शुरू (3 कदम के लिए) - 500 मिलीलीटर 1% एसडीएस
    • कमरे के तापमान पर दुकान (3 कदम के लिए) - 250 मिलीलीटर 20 मिमी EDTA.
  2. 60 में एक ओवन पर मुड़ें डिग्री सेल्सियस और एक ओवन 42 डिग्री सेल्सियस पानी लाओ एक hotplate पर एक बड़े बीकर में उबाल है.
  3. साफ 70% इथेनॉल के साथ Miniblotter Immunetics.
  4. विभाज्य 2xSSPE/0.1% एसडीएस के एक छोटे कंटेनर में 10 मिलीलीटर. गिने ट्यूबों में 150 μl 2xSSPE/0.1% एसडीएस प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 20 μl जोड़ें.
  5. पीसीआर उत्पादों उबाल लें 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस स्टायरोफोम धारकों का उपयोग कर. कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर तुरंत प्लेस.
  6. शेष 60 में 240 मिलीलीटर 2xSSPE/0.1% एसडीएस में झिल्ली धो ° 5 मिनट के लिए ओवन सी.
  7. समर्थन तकिया के साथ miniblotter में रखें झिल्ली. ओर मालूम इतना चैनलों खड़ी रन आउट (पेंसिल लाइन को सीधा).
  8. सक्शन miniblotter चैनलों से अधिक तरल.
  9. पहली और आखिरी चैनलों के लिए शेष 150 μl 2xSSPE/0.1% एसडीएस जोड़ें. अनुक्रम में शेष चैनल (2-44) उबला हुआ पीसीआर उत्पादों जोड़ें, हवाई बुलबुले से बचने के सावधान किया जा रहा है.
  10. 60 में रखें फ्लैट miniblotter ° सी 1 घंटे के लिए ओवन संकरण जगह लेने के लिए अनुमति देते हैं.
  11. प्रत्येक चैनल से तरल Aspirate फिर miniblotter से झिल्ली को हटा दें.
  12. Prewarmed 250 मिलीलीटर 2xSSPE/0.5% एसडीएस में दो बार 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेंटीग्रेड ओवन में धो डालें.
  13. 2xSSPE/0.5% एसडीएस के साथ 42 नायलॉन अलग जाल गीला डिग्री सेल्सियस और इसका इस्तेमाल करने के लिए झिल्ली रोल.
  14. प्लेस ऊपर रोलर ट्यूब में झिल्ली लुढ़का, और करने के लिए सुनिश्चित करें झिल्ली आंतरिक सतह abuts फहरा. 42 में से 15 मिलीलीटर 2xSSPE/0.5% एसडीएस तक 3 μl संयुग्म streptavidin-peroxidase (Roche एप्लाइड साइंस) जोड़ें डिग्री सेल्सियस और रोलर ट्यूब को जोड़ने. कस पर टोपी भाड़ और 42 पर रोलर ओवन में सेते ° C 60 मिनट के लिए. सुनिश्चित करें रोल की दिशा ऐसी है कि झिल्ली नहीं कस है. लीक के लिए समय - समय पर जाँच करें.
  15. डिटर्जेंट और पानी Pyroneg में miniblotter धो, कुल्ला और सूखी अनुमति देते हैं.
  16. रोलर ट्यूब से झिल्ली निकालें. 42 में 2xSSPE/0.5% एसडीएस शेष ° 10 मिनट के लिए सी में दो बार धोएं.
  17. 2xSSPE में दो बार कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए धो.
  18. 80 अप करने के लिए ओवन डिग्री सेल्सियस और 500ml जगह 1% एसडीएस पूर्व गर्म ओवन में. मुड़ें
  19. 15 मिलीलीटर Amersham ईसीएल का पता लगाने के समाधान (समाधान का 7.5 मिलीग्राम एक और समाधान बी के 7.5 मिलीलीटर). 2xSSPE और पता लगाने के समाधान जोड़ने त्यागें. 2 मिनट के समाधान के साथ झिल्ली की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए हाथ से धीरे रॉक. Chemiluminescent समाधान त्यागें.
  20. कट प्लास्टिक पारदर्शिता के दो चादरें के लिए जोखिम कारतूस के लायक है. दो चादरें और जोखिम कारतूस में जगह के बीच प्लेस झिल्ली.
  21. Darkroom के लिए आगे बढ़ें. लाल बत्ती के तहत, कारतूस ईसीएल पता लगाने फिल्म को जोड़ने और 5 मिनट के लिए बेनकाब. कुत्ता कान फिल्म के निचले दाएँ कोने हटाने पर सही उन्मुखीकरण जब देखने की अनुमति.
  22. स्वचालित या के अनुसार निर्माता के निर्देशों का के रूप में रासायनिक स्नान के साथ फिल्म का विकास करना.
  23. अब या कम जोखिम बार के साथ प्रदर्शन दोहराएँ यदि आवश्यक हो.

3. झिल्ली के उत्थान

  1. 80 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए दो बार में 250 मिलीलीटर 1% एसडीएस में झिल्ली धो लें.
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 240 मिलीलीटर 20 मिमी EDTA में झिल्ली धो लें.
  3. 10 मिलीलीटर 20 मिमी EDTA के साथ प्लास्टिक बैग में सील झिल्ली और 4 ° भविष्य पुनः उपयोग के लिए सी में सर्द.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

परिणाम सबसे अच्छा एक मुद्रित ग्रिड पर फिल्म दे, या और छवि स्कैनिंग और BioNumerics (एप्लाइड गणित, Sint-Martens-Latem, बेल्जियम) के रूप में सॉफ्टवेयर में आयात द्वारा देखा जाता है. प्रत्येक जांच के परिणाम सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण जांच करने के लिए संदर्भ के साथ व्याख्या की जानी चाहिए. परिणाम सबसे अच्छा, कमजोर नकारात्मक या सकारात्मक रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. सकारात्मक परिणाम रहे हैं, जहां के रूप में के रूप में मजबूत या सकारात्मक नियंत्रण जांच की तुलना में मजबूत संकेत है. नकारात्मक परिणाम हैं जहां संकेत अनुपस्थित या नकारात्मक नियंत्रण (पृष्ठभूमि संकेत के मामले में) के बराबर है. कमजोर परिणाम हैं जहां संकेत सकारात्मक नियंत्रण जांच से fainter है, लेकिन नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में मजबूत है. कमजोर परिणाम कमजोर जांच बाध्यकारी है, या प्राइमर डिमर गठन से गैर विशिष्ट संकेतों की वजह से प्रमुख बिंदु म्यूटेशनों का नतीजा हो सकता है. ब्याज के लक्ष्य के प्रति दो जांच का प्रयोग विशिष्टता है, जहां एक एकल कमजोर परिणाम सुरक्षित रूप से गैर विशिष्ट संकेत के रूप में व्याख्या की जा सकती सुधार कर सकते हैं. यदि कोई संदेह रहता है, एक एकल plex पीसीआर प्रतिक्रिया जेल आधारित पता लगाने और किसी भी amp के अनुक्रमण के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है हैयदि परिणाम सही मायने में सकारात्मक है निर्धारित करने के लिए उत्पाद lified. एक प्रतिनिधि परिणाम आंकड़ा 2 में दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1 / mPCR RLB सिद्धांतों (P1) चरण 1.9. Amine संशोधित जांच covalently एक नायलॉन झिल्ली करने के लिए बाध्य कर रहे हैं. (P2) 2.10 चरण. बायोटिन संशोधित पीसीआर उत्पादों जांच करने के लिए संकरित हैं. (P3) 2.14 चरण. Streptavidin, peroxidase के साथ लेबल, झिल्ली के साथ incubated है और बायोटिन को बांधता है. (P4) 2.19-2.21 कदम. Peroxidase ईसीएल पता लगाने अभिकर्मकों में एक प्रतिक्रिया catalyses, उत्पादन प्रकाश है जो प्रकाश के प्रति संवेदनशील फिल्म अवगत कराया है. झिल्ली तो फिर से उपयोग के लिए धोया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रतिनिधि परिणाम / mPCR RLB. 1 से 6 नमूने सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं - उन दोनों के बीच कम से कम 43 जांच के प्रत्येक के लिए सकारात्मक जांच संकेत है. प्रत्येक लक्ष्य अनुक्रम (यू के माध्यम से एक) विशिष्टता को अधिकतम करने के लिए दो अलग अलग जांच से पता चला है. A1 और A2 जांच प्रजातियों विशेष जांच जो प्रत्येक नमूना के लिए सकारात्मक हो और फिल्म orienting के साथ आपकी सहायता की उम्मीद कर रहे हैं प्रतिनिधित्व करते हैं. जांच A1 झिल्ली के नीचे दोहराया है. नमूने 7 और 8 नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. ध्यान दें कि जांच Q1, Q2 T1, टी 2 और नकारात्मक नियंत्रण में संकेत है, प्राइमरों या प्राइमर डिमर उत्पाद की संभावना nonspecific बंधन का संकेत है. इन जांच या प्राइमरों के पुनः डिजाइन की आवश्यकता होगी. जांच C1, D1 और F1 झिल्ली भर संभावना संयुग्म streptavidin peroxidase या chemiluminescent सब्सट्रेट के कुछ गैर विशिष्ट तेज कारण streaking शो, लेकिन यह आसानी से सच सकारात्मक जांच संकेतों से प्रतिष्ठित है. जांच D1 और D2 अन्य जांच करने के लिए की तुलना में अपेक्षाकृत कमजोर संकेत है, यह बड़ा कम कुशल प्रवर्धन के लिए अग्रणी amplicons की वजह से हो सकता है. जांच J2 नकारात्मक है कई (1, 3, 4, 6, 39) नमूने जहां जांच J1 सकारात्मक है. यह सबसे अधिक संभावना इन नमूनों के लिए J2 बंधनकारी साइट में एक परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है.

Discussion

विधि / mPCR RLB पीसीआर amplicons की एक बड़ी संख्या के साथ - साथ पता लगाने के परमिट. Chemiluminescent जांच के आधार पर पता लगाने के उच्च संवेदनशीलता की वजह से, प्राइमर जोड़े की बड़ी संख्या के साथ एक एकल मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया डीएनए टेम्पलेट बढ़ाना इस्तेमाल किया जा सकता है.

यदि कोई जांच संकेतों को एक या एक से अधिक नमूने, किसी भी शेष पीसीआर उत्पाद के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन के साथ प्राप्त कर रहे हैं मदद कर सकता है भेद कि क्या समस्या पीसीआर प्रवर्धन या जांच के संकरण के साथ है. झिल्ली पर सभी जांच संकेतों कहाँ कमजोर या अनुपस्थित रहे हैं, लेकिन जेल वैद्युतकणसंचलन सफल पीसीआर प्रवर्धन इंगित करता है, संभावनाओं झिल्ली की लेबलिंग के साथ समस्याओं, पिछले उपयोग के बाद झिल्ली के गलत उत्थान, संकरण या streptavidin ऊष्मायन के दौरान गलत तापमान, या दोषपूर्ण शामिल streptavidin- peroxidase संयुग्म या पता लगाने अभिकर्मक.

यदि नियंत्रण के नमूनों से संकेत मिलता है कि अलग - अलग जांच के उत्पादन हो झूठी नकारात्मक संकेतों, जेल आधारित पता लगाने और बाद में अनुक्रमण के साथ एक पीसीआर पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए और जांच बाध्यकारी साइट पर अनुक्रम बदलाव के लिए देखो करने के लिए किया जा सकता है है हो सकता है. कमजोर या अनुपस्थित जांच संकेत बड़े amplicon आकार के कारण हो सकता है: यदि संभव हो तो सभी amplicons समान लंबाई और 300 से कम बीपी होना चाहिए. Amplicons माध्यमिक डीएनए संरचना को भी गरीब जांच बंधन का उत्पादन कर सकते हैं और प्राइमरों की फिर से डिजाइन की जरूरत हो सकती है. व्यक्तिगत प्राइमर या जांच सांद्रता भी सिग्नल की शक्ति का अनुकूलन करने के लिए विविध किया जा सकता है.

झूठी सकारात्मक nonamplified प्राइमरों या प्राइमर - डिमर उत्पाद के बंधन जांच के कारण संकेतों जेल आधारित पता लगाने और बाद में अनुक्रमण के साथ एक पीसीआर प्रदर्शन द्वारा जांच किया जा सकता है. यदि ऐसा होता है, जांच को नया स्वरूप देना जरूरी किया जा सकता है. प्वाइंट जांच बाध्यकारी साइटों में म्यूटेशनों कमजोर या अनुपस्थित संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रवर्धित प्रत्येक उत्पाद के लिए दो जांच की अनुमति दे इस का पता लगाने के लिए आसान बनाता है. यह विशेषता सावधान प्राइमर और जांच डिजाइन के लक्ष्य डीएनए में छोटे अनुक्रम विविधताओं का पता लगाने के साथ शोषण किया जा सकता है.

संक्षेप में, जबकि वहाँ उत्पाद का पता लगाने निम्नलिखित मल्टीप्लेक्स पीसीआर उपलब्ध प्रतिक्रियाओं के कई तरीके हैं mPCR / RLB कम सेटअप लागत के साथ उच्च throughput और सस्ती होने का लाभ है. विधि के लचीलेपन में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इसके प्रयोग परमिट.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

मैथ्यू O'Sullivan और फी झोउ ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद स्नातकोत्तर चिकित्सा अनुसंधान छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5’ amine C6 modified oligonucleotide probes Sigma-Aldrich
NaHCO3 Sigma-Aldrich S-8875 0.5 M solution made up to pH 8.4
NaOH Sigma-Aldrich S5881 0.1M solution
20xSSPE buffer Amresco 0810-4L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L-4390 Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884 Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) Sigma-Aldrich E7750 Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm Pall Corporation 74480C
Deionised, purified water
Liquid Pyroneg detergent Johnson Diversey HH12291
Streptavidin-peroxidase conjugate Roche Group 11 089 153 001
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
OHP Transparency film Corporate Express EXP 504 OHP
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm GE Healthcare 28906837
Ice
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh Thermo Fisher Scientific, Inc. HBSNSRS220 Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use
The Belly Dancer rocking platform Stovall Life Sciences, IBI Sciences Euro BDbo
Miniblotter Immunetics MN100-45
Water bath
Suction
Hot plate
Exposure cartridge Sigma-Aldrich Z36,009-0
X-ray film developer Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.

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References

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