PCR multiplex et de test d'hybridation inverse Ligne Blot (MPCR / RLB)

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Summary

Un peu coûteuse, la méthode à haut débit pour la détection simultanée de jusqu'à 43 cibles moléculaires est décrit. Applications de MPCR / RLB comprennent tapant microbienne et la détection de pathogènes multiples à partir d'échantillons cliniques.

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O'Sullivan, M. V. N., Zhou, F., Sintchenko, V., Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB). J. Vis. Exp. (54), e2781, doi:10.3791/2781 (2011).

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Abstract

PCR multiplex / test d'hybridation inverse Ligne Blot permet la détection de jusqu'à 43 cibles moléculaires dans 43 échantillons en utilisant une PCR multiplex de réaction suivie par hybridation de sonde sur une membrane de nylon, qui est ré-utilisable. Les sondes sont 5 'amine modifiée pour permettre la fixation à la membrane. Les amorces sont 5 'biotine modifiée qui permet la détection de produits de PCR utilisant hybridées streptavidine-peroxydase et un substrat chimiluminescent via un film photosensible. Avec une configuration faible et les coûts de consommables, cette technique est peu coûteuse (environ 2 $ US par échantillon), à haut débit (plusieurs membranes peuvent être traitées simultanément) et dispose d'un délai court (environ 10 heures).

La technique peut être utilisée dans un certain nombre de façons. Plusieurs sondes peuvent être conçus pour détecter des variations de séquence dans un seul produit amplifié, ou plusieurs produits peuvent être amplifiés simultanément, avec un (ou plusieurs) des sondes utilisées pour la détection ultérieure. Une combinaison des deux approches peuvent aussi être utilisés dans un seul test. La possibilité d'inclure plusieurs sondes pour une séquence cible unique permet le dosage très précis.

Les applications publiées du MPCR / RLB comprennent la détection des gènes de résistance aux antibiotiques 1,2, tapant du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline 3-5 et Salmonella sp 6, sérotypage moléculaire de Streptococcus pneumoniae 7,8, 9 et Streptococcus agalactiae entérovirus 10,11, l'identification de Mycobacterium sp 12, la détection des organes génitaux 13-15 et 16 voies respiratoires et d'autres 17 agents pathogènes et de détection et d'identification des mollicutes 18. Toutefois, la polyvalence de la technique des moyens les applications sont quasiment illimitées et ne se limite pas à l'analyse moléculaire des micro-organismes.

Les cinq étapes de MPCR / RLB sont un Primer) et la conception de la sonde, b) l'extraction d'ADN et la PCR d'amplification c) Préparation de la membrane, d) Hybridation et détection, et e) La régénération de la membrane.

Protocol

Une attention particulière doit être accordée à l'apprêt et la conception de la sonde. Toutes les séquences disponibles des objectifs d'intérêt à partir des bases de données telles que GenBank devraient être utilisées pour identifier les domaines conservés qui sont des cibles appropriées. Si un grand nombre de cibles sont amplifiées dans un essai MPCR unique, chaque séquence doit être amplifié de longueur similaire, et ne doit pas dépasser 300 paires de base pour éviter la concurrence. Une autre application de la méthode est d'amplifier une cible de plus en utilisant des amorces contre les régions conservées et d'utiliser des sondes multiples pour identifier des variations de séquence dans l'amplicon. Dans ce cas, le produit amplifié par PCR peut être plus long. Températures de recuit Primer devraient tous être semblables, avec des conditions de PCR ajusté en conséquence. Amorces qui forme forte structure secondaire ou dimère primaire doit être évitée. Le Sigma Aldrich ADN calculatrice ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) peut être utilisé pour prédire de façon fiable ces caractéristiques.

Des sondes d'ADN devraient être conçus pour avoir recuit des températures proches de 60 ° C. Afin de maximiser la spécificité, deux sondes pour chaque cible d'intérêt peuvent être inclus dans le test, une hybridation à l'avant du brin d'ADN adjacent au site amorce reverse contraignant, et l'autre pour le volet arrière à côté du site amorce sens contraignant. Dans ce cas, les deux amorces avant et arrière doivent être modifiés à la biotine. Si une seule sonde par cible amplifiée est utilisée, alors seulement une amorce besoin biotine modifiée.

Lors de la conception des amorces et des sondes pour l'analyse MPCR / RLB, il est fortement conseillé d'utiliser des méthodes in silico pour prédire les produits de PCR et hybridation de sonde la corrélation avec les résultats in vitro. Idéalement cela est fait à partir d'isolats dont la séquence du génome entier est disponible. Des logiciels tels que FastPCR (disponible à http://primerdigital.com/fastpcr.html) peuvent être utilisés à cette fin. Signal de la sonde faible ou absent peut être prédit, où l'analyse in silico indique inadéquation de paires de bases résultant de la température de sonde recuit à basse.

Techniques d'extraction d'ADN varie selon les échantillons testés, et les conditions de PCR sera dépendante de conception d'amorce. Les lecteurs sont priés de publications sur des dosages individuels pour plus d'informations concernant l'extraction d'ADN et de réactifs de PCR et les conditions de 1-19.

Chaque test est exécuté avec des contrôles appropriés pour fournir au moins un signal positif et négatif pour une sonde de chaque sonde sur la membrane, ainsi que d'un ADN sans contrôle. Par ailleurs, il est avantageux d'inclure une sonde dans la partie supérieure de la membrane qui devrait être positif pour tous les échantillons (ex.: une espèce ou un genre de sonde spécifiques dans le cas d'un micro-organisme). Cela sert d'une sonde contrôle positif, mais elle permet aussi une orientation facile des résultats.

1. Préparation de la membrane

  1. Préparer les solutions suivantes:
    • 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4)
    • 100 ml de NaHCO 3 0,5 M
    • 20 ml EDAC 16%
    • 250 ml NaOH 0,1 M
    • 250 ml 2xSSPE
    • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - lieu en bain-marie à 60 ° C
    • 250 ml EDTA 20 mM.
  2. Préchauffer le four à 60 ° C.
  3. Nettoyez le Miniblotter Immunetics avec de l'éthanol à 70%.
  4. Diluer les sondes oligonucléotidiques dans 0,5 M de NaHCO 3 à une concentration finale de 2 pmol / ul et un volume de 200 pl.
  5. Couper une membrane de nylon BiodyneC à 15x15 cm. En utilisant un crayon et une règle, la règle hors d'un espace de 0,5 cm à travers le dessus de la membrane et donner les détails ici.
  6. Sceau de membrane dans un sac plastique avec 20 ml solution fraîchement préparée EDAC 16% et de rock à la température ambiante pendant 10 minutes.
  7. Laver la membrane dans de l'eau déminéralisée pendant 30 secondes.
  8. Placer dans la membrane miniblotter avec chaînes courir à travers la membrane (parallèle à la ligne de crayon). Mettez coussin de soutien en place et à proximité buvard. Aspirer le fluide de canaux.
  9. Remplissez les lignes 1 et 45 avec 150 pl 0,5 M de NaHCO 3. Utilisez 150 ul de chaque solution de sonde pour remplir voies 2-44 de la séquence, en faisant attention à éviter les bulles d'air. Si une bulle d'air apparaît dans le canal, en gardant la pipette en place, rapidement aspirer la solution pour permettre à la bulle d'air de flotter au sommet de la pipette, puis réessayez. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
  10. Aspirer des solutions de sonde, retirez la membrane et se laver dans 250 ml de NaOH 0,1 M à température ambiante pendant 9 minutes.
  11. Laver la membrane dans 250 ml 2xSSPE pendant 30 secondes.
  12. Laver la membrane dans 250 ml pré-chauffé 2xSSPE/0.1% SDS dans un four à 60 ° C pendant 5 minutes.
  13. Si ce n'est pas être utilisées pour l'hybridation immédiatement, se laver la membrane dans 240 ml d'EDTA 20 mM à température ambiante pendant 20 minutes (réserver 10 ml restants), puis sceller la membrane dans un sac en plastique avec 10 ml d'EDTA reste 20 mM et de stockagee au réfrigérateur à 4 ° C.
  14. Lavez miniblotter avec Pyroneg détergent et une brosse. Rincer et laisser sécher.

2. Hybridation et détection

  1. Préparer les solutions suivantes:
    • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - magasin au bain-marie à 60 ° C.
    • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - magasin au bain-marie à 60 ° C
    • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - un magasin dans le four à 42 ° C
    • 500 ml 2xSSPE - conserver à température ambiante
    • 500 ml SDS à 1% - un magasin au bain-marie à 60 ° C au départ (pour l'étape 3)
    • 250 ml EDTA 20 mM - stocker à température ambiante (pour l'étape 3).
  2. Tourner sur un four à 60 ° C et un four à 42 ° C. Porter l'eau à bouillir dans un grand bécher sur une plaque chauffante.
  3. Nettoyer Immunetics Miniblotter à l'éthanol 70%.
  4. Aliquote de 10 ml de 2xSSPE/0.1% SDS dans un petit récipient. Ajouter 20 ul de chaque produit de PCR à 150 ul 2xSSPE/0.1% de SDS dans des tubes numérotés.
  5. Faire bouillir les produits de PCR pendant 10 min à 100 ° C en utilisant les détenteurs de styromousse. Placez-le sur la glace immédiatement pendant au moins 5 minutes.
  6. Lavez la membrane en restant 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS à 60 ° C au four pendant 5 minutes.
  7. Placer dans la membrane miniblotter avec coussin d'appui. Orientez donc canaux courir verticalement (perpendiculaire à la ligne de crayon).
  8. L'excès de liquide d'aspiration des canaux miniblotter.
  9. Ajouter le reste 150 ul 2xSSPE/0.1% de SDS à des canaux et prénom. Ajouter bouillie produits de PCR à des canaux restants (2-44) dans la séquence, en prenant soin d'éviter les bulles d'air.
  10. Miniblotter Placer à plat dans le four à 60 ° C pendant 1 heure pour permettre l'hybridation ait lieu.
  11. Aspirer liquides à partir de chaque canal puis retirer la membrane du miniblotter.
  12. Laver deux fois dans préchauffée SDS 250 ml 2xSSPE/0.5% à 60 ° C au four pendant 10 minutes.
  13. Humidifiez filet de nylon séparant par 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C et l'utiliser pour rouler la membrane.
  14. Placez retroussé membrane dans le tube d'enroulement, et se déploient pour assurer la membrane bute contre la surface intérieure. Ajouter 3 pi conjugué streptavidine-peroxydase (Roche Applied Science) à 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C et ajouter à tube d'enroulement. Bouchon sur hermétiquement et laisser incuber dans un four à rouleaux à 42 ° C pendant 60 minutes. Assurer la direction du rouleau est telle que la membrane ne pas serrer. Vérifiez périodiquement s'il ya des fuites.
  15. Lavez miniblotter dans Pyroneg eau et du détergent, rincer et laisser sécher.
  16. Retirer la membrane du tube d'enroulement. Laver deux fois en restant 2xSSPE/0.5% SDS à 42 ° C pendant 10 minutes.
  17. Laver deux fois dans 2xSSPE à température ambiante pendant 5 min.
  18. Éteindre le four à 80 ° C et le lieu de 500ml 1% de SDS dans le four à préchauffer.
  19. Maquillage 15 ml Amersham solution de détection ECL (7,5 ml de solution A et 7,5 ml de solution B). Jeter 2xSSPE et ajouter la solution de détection. Rocher doucement par la main pendant 2 minutes en assurant une couverture complète de la membrane avec une solution. Jeter la solution chimiluminescente.
  20. Couper deux feuilles de matière plastique transparente pour s'adapter cartouche d'exposition. Placez la membrane entre les deux feuilles et le placer dans la cartouche d'exposition.
  21. Procéder à la chambre noire. Sous une lumière rouge, ajoutez du film de détection ECL à la cartouche et exposer pendant 5 minutes. Chien-oreille coin inférieur droit d'un film lors de l'enlèvement afin de permettre une orientation correcte lors de la visualisation.
  22. Développer film avec développeur automatisé ou bains chimiques selon les directives du fabricant.
  23. Répétez l'exposition avec des temps d'exposition plus longs ou plus courts, si nécessaire.

3. Régénération des membranes

  1. Laver la membrane dans 250 ml à 1% de SDS à 80 ° C pendant 30 minutes deux fois.
  2. Laver la membrane dans 240 ml d'EDTA 20 mM à température ambiante pendant 15 minutes.
  3. Sceau de membrane dans un sac plastique avec 10 ml d'EDTA 20 mM et réfrigérer à 4 ° C pour une réutilisation future.

4. Les résultats représentatifs:

Les résultats sont meilleurs vu en plaçant le film sur une grille imprimée, ou bien la numérisation de l'image et l'importer dans un logiciel tel que BioNumerics (Mathématiques appliquées, Sint-Martens-Latem, Belgique). Chaque résultat de la sonde doit être interprété en référence à des sondes de contrôle positif et négatif. Les résultats sont meilleurs classés comme négatifs, faible ou positif. Les résultats positifs sont là où le signal est plus fort ou plus fort que celui de la sonde contrôle positif. Les résultats négatifs sont là où le signal est absent ou égal au contrôle négatif (dans le cas du signal de fond). Faibles résultats sont là où le signal est plus faible que la sonde contrôle positif, mais plus fort que le contrôle négatif. La faiblesse des résultats peut être le résultat de mutations ponctuelles conduisant à la fixation de sonde faible, ou pour cause de non-spécifiques signaux de la formation de dimères d'amorces. L'utilisation de deux sondes par cible d'intérêt peut améliorer la spécificité, où un seul résultat faible peut sans risque être interprété comme signal non spécifique. Si un doute subsiste, une seule réaction complexes PCR peut être effectuée avec du gel à base de détection et le séquençage de n'importe quel amplilified produit pour déterminer si le résultat est vraiment positif. Un résultat représentatif est montré dans la figure 2.

Figure 1
Figure 1. Les principes MPCR / RLB (P1) Étape 1.9. Amine sondes modifiées sont liés de manière covalente à une membrane de nylon. (P2) Étape 2,10. Biotine modifiés produits de PCR sont hybridés aux sondes. (P3) Étape 2,14. Streptavidine marquée à la peroxydase, est incubé avec la membrane et se lie à la biotine. (P4) étapes 2.19 à 2.21. Peroxydase catalyse une réaction dans les réactifs de détection ECL, produire de la lumière à laquelle la lumière pellicule sensible est exposée. La membrane est ensuite lavée pour la réutilisation.

Figure 2
Figure 2. Représentant MPCR / RLB résultat. Des échantillons de 1 à 6 représentent les contrôles positifs - entre eux, il ya au moins un signal de la sonde positive pour chacun des 43 sondes. Chaque séquence cible (de A à U) est détectée avec deux sondes différentes pour optimiser la spécificité. Sondes A1 et A2 représentent des espèces sondes spécifiques qui devraient être positifs pour chaque échantillon et d'aider à orienter le film. Sonde A1 est répété au bas de la membrane. Les échantillons 7 et 8 sont des contrôles négatifs. Notez que Q1 sondes, T2, T1 et T2 ont signal dans les contrôles négatifs, indiquant probablement une liaison non spécifique des amorces ou un produit dimère d'amorces. Re-conception de ces sondes ou d'amorces serait nécessaire. Sondes C1, D1 et F1 montrent des stries à travers la membrane probablement dû à une certaine absorption non spécifique du conjugué streptavidine-peroxydase ou substrat chimioluminescent, mais cela est facilement distingués des vrais signaux de la sonde positive. Sondes D1 et D2 ont signal relativement faible par rapport à d'autres sondes, cela peut être dû à de plus grands amplicons conduisant à une amplification moins efficace. Sonde J2 est négative est de plusieurs échantillons (1, 3, 4, 6, 39) où la sonde J1 est positif. Il est fort probable représente une mutation dans le site J2 contraignantes pour ces échantillons.

Discussion

La méthode MPCR / RLB permet la détection simultanée d'un grand nombre d'amplicons de PCR. En raison de la grande sensibilité de chimioluminescence basé sur les sondes de détection, un seul multiplex PCR avec un grand nombre de paires d'amorces peuvent être utilisées pour amplifier l'ADN matrice.

Si aucun signal de la sonde sont obtenues avec un ou plusieurs échantillons, effectuer l'électrophorèse sur gel avec tout produit restant PCR peut aider à distinguer si le problème est avec l'amplification PCR ou l'hybridation de la sonde. Lorsque tous les signaux de la sonde sur la membrane sont faibles ou inexistantes, mais l'électrophorèse sur gel indique réussie amplification par PCR, des possibilités incluent des problèmes avec l'étiquetage de la membrane, la régénération incorrecte de la membrane après l'utilisation antérieure, des températures incorrectes lors de l'incubation d'hybridation ou de la streptavidine, ou défectueux streptavidine- conjugué à la peroxydase ou de réactif de détection.

Si les échantillons de contrôle indiquent que les sondes individuelles peuvent produire de faux signaux négatifs, seule PCR avec un gel à base de détection et de séquençage ultérieur peut être effectué pour vérifier l'amplification du produit de PCR et de chercher des variations de séquence sur le site de la sonde contraignant. Signal de la sonde faible ou absent peut être dû à la taille de l'amplicon grande: si possible tous les amplicons doivent être de longueur similaire et moins de 300 pb. Structures d'ADN secondaire d'amplicons peuvent également produire contraignante sonde pauvres, et peut nécessiter une nouvelle conception d'amorces. Apprêt individuels ou les concentrations de sonde peut également être modifiée afin d'optimiser la puissance du signal.

Faux signaux positifs en raison de la sonde contraignante d'amorces nonamplified ou une amorce-dimère produit peut être étudié en effectuant seule PCR avec un gel à base de détection et de séquençage ultérieur. Si cela se produit, la refonte des sondes peut être nécessaire. Des mutations ponctuelles dans les sites de la sonde de liaison peuvent conduire à des signaux faibles ou absents. Permettre deux sondes pour chaque produit amplifié rend cela facile à détecter. Cette caractéristique peut être exploitée avec un apprêt et une conception rigoureuses sonde pour détecter des variations de séquence d'ADN cible dans les petites.

En résumé, alors qu'il existe de nombreuses méthodes de détection des produits réactions suivantes PCR multiplex disponibles, MPCR / RLB a l'avantage d'être à haut débit et peu coûteuse avec de faibles coûts de configuration-. La souplesse de la méthode permet son utilisation dans une large gamme d'applications.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Matthew O'Sullivan et Fei Zhou sont bénéficiaires de l'Australian National Santé et du Medical Research Council Bourses d'études supérieures de la recherche médicale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5’ amine C6 modified oligonucleotide probes Sigma-Aldrich
NaHCO3 Sigma-Aldrich S-8875 0.5 M solution made up to pH 8.4
NaOH Sigma-Aldrich S5881 0.1M solution
20xSSPE buffer Amresco 0810-4L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L-4390 Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884 Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) Sigma-Aldrich E7750 Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm Pall Corporation 74480C
Deionised, purified water
Liquid Pyroneg detergent Johnson Diversey HH12291
Streptavidin-peroxidase conjugate Roche Group 11 089 153 001
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
OHP Transparency film Corporate Express EXP 504 OHP
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm GE Healthcare 28906837
Ice
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh Thermo Fisher Scientific, Inc. HBSNSRS220 Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use
The Belly Dancer rocking platform Stovall Life Sciences, IBI Sciences Euro BDbo
Miniblotter Immunetics MN100-45
Water bath
Suction
Hot plate
Exposure cartridge Sigma-Aldrich Z36,009-0
X-ray film developer Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.

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References

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