Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

Biology
 

Summary

제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

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Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish. J. Vis. Exp. (53), e2790, doi:10.3791/2790 (2011).

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Abstract

자기 갱신 암 세포가 종양 성장을 촉진하기 위해 무제한 능력을 가지고 종양 내에있는 유일한 세포 유형이며, 따라서 종양 - 증식 세포 또는 종양 - 시작 세포로 알려져 있습니다. 그것은 파괴를 위해 이러한 자기 갱신 세포를 대상으로하는 것은 크게 환자 예후 (豫后) 1 개선, 종양 진행을 차단하고 재발을 막을 수 있다고 생각합니다. 의 빈도를 결정하는 가장 일반적인 방법은 자기 갱신 종양 내에서 세포를하면 종양 세포가 증가 복용에받는 동물에 이식하는 제한 희석 세포 이식 분석이다; 종양을 개발하는 동물의 비율은 숫자를 계산하는 데 사용됩니다 의 자기 갱신 원래 종양 샘플 2, 3 이내에 세포를. 이상적으로, 동물의 많은 정확하게 종양 - 전파 세포의 빈도를 결정하기 위해 각각의 제한 희석 실험에 사용되는 것입니다. 그러나, 마우스를 포함한 대규모 실험 비용이며, 대부분의 제한 희석 assays 실험마다 10-15 생쥐를 사용합니다.

Zebrafish는 유전자 조작과 대규모 실험을 수행할 수있는가 경제의 그들의 용이성으로 인해 많은 부분에서 암 모델로 프로미넨스를 얻고있다. 또한, zebrafish 모델에서 암 종류 밀접하게 자신의 대응 인간의 질병 4 모방을 발견했습니다. 그것이받는 동물의 하위 치명적인 조사, 21 일 후에 면역 시스템의 재생하여 한 물고기에서 다른 종양 세포를 이식하는 것이 가능이지만 종종 종양 역행 5됩니다. syngeneic zebrafish의 최근 생성은 크게 종양 이식 연구에게 6-8를 촉진하고 있습니다. 동물들이받는 생선, 종양 성장에 견고하게 유전자 동일, 이식 종양 세포의 합치다 있기 때문에 시간이 오랜 기간 동안 모니터링할 수 있습니다. Syngeneic zebrafish 자기 갱신 세포 주파수 9, 10을 과소 평가 수있는 외국 microenvironment 성장에 적응하지 않아도 종양 세포에 희석 이식 assays 제한에 이상적입니다. 또한 한 세포 이식이 성공적으로 자기 갱신 셀 주파수의보다 정확한 견적을 제공하는 역할을 모두하는 쉽고 경제적으로 한 번에 이식 수 있습니다 syngeneic zebrafish 8 수백 동물을 사용하여 완료되었습니다.

여기 방법 syngeneic zebrafish의 기본, 찬란 - 라벨 T - 세포 급성 lymphoblastic 백혈병 (T - ALL) 작성과 자기 갱신 세포 주파수를 결정하기 위해 어른 물고기로 희석을 제한에서 이러한 종양을 이식을 위해 제공됩니다. 백혈병이 예제로 제공되는 동안,이 프로토콜은 zebrafish에 암 모델을 사용하여 종양 - 전파 세포의 빈도를 결정하기 위해 적합합니다.

Protocol

1. zebrafish 배아의 유전자 microinjection

  1. rag2를 Linearize : cMycrag2 : GFP 11 DNA 구조를 37 ° C 하룻밤에 노티 각 플라스미드의 10μg을 소화하여.
  2. 페놀 : 클로로포름 추출하고 plasmids을 촉진하고, 20μL H 2 O.에서 각 resuspend
  3. 높은 범위의 DNA 사다리 20μL, 10μL 및 5μL와 1 % 아가로 오스 겔 각 소화 플라스미드의 1:1, 1시 5분 및 1시 10분 희석을 실행하여 DNA의 농도를 결정합니다. 부량 이러한 유형의 일반적으로 분광계 읽기보다 더 정확합니다.
  4. CG1 - 스트레인 (또는 다른 syngeneic 변형)로 분사에 대한 1M KCl 0.5 X TE에 60ng/μL의 최종 농도로 DNA를 희석 30ng/μL rag2를 사용하여 zebrafish의 배아 : cMyc + 30ng/μL rag2 : : GFP.
  5. 주사는 이전에 다음 ID로 시연 12, 13로 수행되어야합니다. 간단히, 남성과 여성 zebrafish는 짝짓기 실에서 주입하기 전에 밤새 설정되어 있습니다. 주사 당일, DNA가 주사 바늘에로드되어 압력이 50μm 직경 거품이 무대 마이크로 미터로 측정되는 (30pg DNA) 퇴학되도록 조정됩니다. 그렇다면, 배아는 DNA가 노른자에 안 세포에 직접 주입하고 있기 때문에 한 세포 단계에서 주입하고 있습니다. 주입 CG1 배아 및 유충의 생존은 일반적으로 가난하고, 물고기의 5 % 만 성공적으로 transgene를 통합할 것이며 따라서,> 600 배아는 어떤 물고기가 백혈병을 개발합니다 수 있도록 주입해야합니다.
  6. 28.5 ° C에서 주입된 배아를 저장하고, 이용하려면 이후에 죽은 태아를 제거합니다. 동물은 그 삶의 오일에 대형 탱크로 전송하고 이전 14 설명된대로 사육하고 있습니다.

2. 기본 T - ALL zebrafish 애벌레에 대한 심사

  1. 주사 후 약 28일, 배양 접시에있는 생선 시스템 물 25mL에 4ng / M Tricane - S의 200μL를 추가하여 애벌레를 마취 zebrafish.
  2. T - ALL 20분의 485 여기 파장과 GFP 형광 (그림 1)을 감지하는 필터 25분의 530 방출을 사용하여, 20X 확대 epifluorescence 현미경을 사용하여 찬란 - 라벨의 개발을위한 애벌레를 검사합니다.
  3. 부정하는 이들과는 별도로 종양 긍정적인 애벌레. 부정 애벌레가 나중 지점에서 검사 수 있습니다, 일단 종양은 T - ALL 긍정적인 물고기보고하지 않은 것을 보장하기 위해, 더 큰 성장 수 있습니다.
  4. 모니터 T - ALL 종양 성장을 추적하는 epifluorescence 현미경을 사용하여 주 적어도 한번 긍정적인 물고기.

3. 찬란 - 표시 주요 백혈병 세포의 분리 및 정화

  1. GFP 양성 백혈병 세포는 동물의> 50 % 잡힐 때, 9mL 생선 시스템 물을 포함하고있는 배양 접시에있는 4ng/mL Tricane - S의 1mL를 추가하여 물고기를 희생.
  2. 세포를 버퍼 5 % 태아 소 혈청 1mL 0.9X PBS를 포함하는 새로운 배양 접시에있는 물고기를 놓습니다. 면도날, pipet 대형 세포 대단히 짧은 시간을 떼어 놓다 수있는 혼합과 생선을 물에 담가서 부드럽게, 다음 50mL 튜브로 40μm 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 그것은 하나의 세포로 모든 조직 대단히 짧은 시간을 떼어 놓다 필요는 없습니다.
  3. 4mL 폴리스티렌 튜브에 세포의 Pipet의 500μL. 죽은 세포를 분류합니다 1μL 1mg/mL propidium 요오드화물의 (PI)를 추가합니다. 와동 후, 얼음에 세포를 유지.
  4. , 야생 타입 CG1 생선을 희생 더운 물에 담가서 부드럽게하고 총 50mL 튜브에 0.9X PBS에 transplant.Add 4mL 5% FBS 동안 종양 세포에 대해 캐리어 역할을 정상 세포를 수집하기 위해 위와 같은 방법으로 변형 5mL의 볼륨.
  5. 96 - 웰 플레이트의 pipet의 100μL/well 다음 0.9X PBS에서 5% FBS에있는 정상 세포, 희석에 3x10 5 셀 / ML 카운트.
  6. 다음 복용량에서 혈액 세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 형광 활성 세포 분류기 (외과), 정렬 GFP 양성, PI 부정적인 종양 세포 (그림 2A, B)을 사용 : 10 셀 / 물론 48 우물, 100 세포 / 음에 24 우물, 1000 세포에 / 물론 12 우물, 그리고 10,000 세포로 / 음 6 웰스에. 또한, 만 세포는 정상 혈액 세포가없이 잘으로 분류하고, reanalyzed는 정렬 세포의 순도와 생존 (그림 2C)를 평가 외과를 사용해야합니다.

4. 성인 zebrafish에 희석 이식을 제한

  1. 10 분 2000xg에서 96 - 웰 플레이트 centrifuging하여 펠렛 세포.
  2. 뜨는의 95μL 제거하고 나머지 5μL에있는 세포를 resuspend.
  3. 성인 (> 60 일이 지나면) syngeneic zebrafish 복부 쪽을 잡고, 그리고 26G / 2 "마이크로 주사기를 사용하여 복막 캐비티에 세포 현탁액을 주입. Zebrafish는 이식하기 전에 anesthetized 될 필요가 없습니다. 일반적으로 45 물고기 10 백혈병 세포와 이식 아르, 20 100 세포로 이식되며, 7 천 세포 5 생선 이식 아르는 10000 T - ALL 세포로 이식하고 있습니다.

5. 백혈병 - 시작 셀 주파수를 결정하기 위해 분석

  1. 약 28일 이식 후 20분의 485 여기 파장과 GFP 형광을 감지 필터 25분의 530 방출을 사용하여 epifluoresence 현미경으로 이식 생선을 확인합니다. 주입 물고기의 총계 당 긍정적인 물고기의 수를 기록합니다.
  2. 다시 검사 최대 90 일 동안 모든 십사일 생선과 긍정적인 물고기의 수를 기록합니다. 종양 - 긍정적인 물고기가 죽어가는가하면, Tricane - S 과다 복용으로 동물을 희생.
  3. 그림 3D와 같이 테이블에 결과를 입력. 웹 기반 엘다 (익스 트림 제한 희석 분석)에 대한 통계 소프트웨어로 데이터를 업로드 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html 에서 종양 긍정적이고 부정적인 동물의 주파수를 사용하여 15 기본 T - ALL 내에서 자기 갱신 백혈병 세포의 빈도를 결정하기 위해 각 이식 선량.

6. 대표 결과 :

syngeneic 생선 배아로의 DNA microinjection은 종종 태아의 <60% 24 시간 동안 생존과 주입 배아의 낮은 생존율을 초래합니다. 또한, 주입 syngeneic 물고기의 생존은 자주, 애벌레 개발하는 동안 일반적으로 가난한 사람입니다 <20%은 28 일 동안 살아. T - ALL 개발할 것입니다 유전자 변형 물고기를 만들려면 배아들 중 다수를 주입하는 것이 중요하다.

예를 들어, CG1 변형 배아가 rag2 주사되었습니다 : cMyc + rag2 : : GFP. transgenes는 GFP를 표현하는 모든 세포는 또한 cMyc 표현되도록, 개발 배아 공동 분리. 애벌레는 T - ALL 28일 (그림 1) 이후 기본에 대한 상영되었다. 이전 작업은 주입된 물고기의 약 5 %가 (그림 1)은 thymus 내에 T - 세포가 GFP - 긍정적인 것이라고 표시하고, T - 세포가 변형되어 11 이러한 물고기의 100 %가 백혈병을 개발합니다. zebrafish의 작은 비율은 일 28에 탐지하는 것은 매우 쉬운 고급 백혈병가있을 수 있지만, 대부분은 GFP 양성 thymus (그림 1)이되므로, 애벌레는 모든 긍정적인 보장하기 위해 높은 배율에 따라 개별적으로 검사해야합니다 물고기가 선택됩니다. GFP 양성 T - ALL 세포가 45-70 일 사이에 동물의> 50 %를 추월합니다.

제공된 예제에서, zebrafish는 삶의 65일에 희생되었고, 백혈병 세포는 고립되었고 외과는 희석 이식을 제한을위한 정렬. propidium 요오드화물 부정과 GFP 양성 (그림 2)되었습니다 단일 세포는 96 - 웰 플레이트로 정렬되었습니다. Reanalysis는 생존 (이상> 95%)와 순결을 평가하기 위해 10,000 정렬 세포에서 수행되었다 (이상> 92%, 그림 2). 이식 T - 올스은 일반적으로 28일 전에 발생하지만, 일부 종양 개발에 60 일 이상 소요될 수 있습니다. 일부 T - 올스은 복막 캐비티 (그림 3C)을 채우기 위해 확장하는 데 더 진행하는 동안이 예제에서는, 하루 28에서 초기 단계의 종양은 사출 사이트 (그림 3B) 근처 GFP 양성 세포의 영역으로 간주되었다 . T - 올스 세 가지 기본에서 희석 세포 이식의 assays을 제한에서 데이터는 그림 3D로 표시됩니다. 이러한 실험의 경우, 220 이상의 동물은 쉽게 몇 시간 이내에 한 사람에 의해 성취 수있는, 이식되었다. 엘다 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석은 평균 135 1 T - ALL 세포 백혈병 - 전파 전지 (그림 3E) 자기 갱신했고 것으로 나타났다.

그림 1
그림 1 걸레로 한 세포 단계에 주입 Zebrafish의 유충 :. : - cMyc + 걸레 : - eGFP는 기본 백혈병 성장을위한 상영되었습니다 28일 포스트 주사. 물고기 (*) thymus 내에 T - 세포가 GFP 양성을했다, T - 세포가 시간이 지남에 따라 변형되기로 물고기 T - ALL을 개발할 것입니다. 이 단계는 28 일 아주 일반적입니다. 한 물고기 (**) 고급 있었 T - ALL 부드러운 조직으로 퍼져있다. 나머지 물고기 두 마리는 종양 성장을 위해 아무것도 없습니다. 이미지 16X 배율에서 촬영되었다.

그림 2
그림 2. 찬란 - 분류 T - ALL 세포가 질병 동물의 분류 및 제한 희석 세포 이식 분석에 사용되었다. 첫째, 게이트가 하나의 세포 (왼쪽 상단 패널)을 선택 부른 후 propidium 요오드화물 부정적인 세포 (가운데 왼쪽 패널)을 선택합니다. 마지막으로, 게이트는 GFP - 긍정적인 정렬을위한 백혈병 세포를 (왼쪽 아래 패널)를 선택 그립습니다. 정렬 세포는 이식하기 전에 생존 및 순도 (오른쪽 패널)을 평가하기 위해 reanalyzed한다.

그림 3
그림 3. Zebrafish는 28일 이식 후 백혈병의 성장에 대한 검사를했다. 물고기도 종양 neg 아르ative은 (A), 사출 사이트 (B)에서 성장 작은 종양이 있거나 진행 백혈병 (C)가. 이미지 7X 확대 촬영했다. 각 희석에 이식 물고기의 총계 당 백혈병 - 긍정적인 생선의 총수은 (D)과 같이 기록됩니다. 데이터의 개수를 계산하는 웹 기반 엘다 프로그램에 입력 아르 자기 갱신 백혈병 세포 및 상위 및 하위 95 % 신뢰 간격 (E)를.

Discussion

암 연구에 zebrafish를 사용하여의 주요 장점은 동물의 다수가 상대적으로 저렴한 비용으로 사용할 수있다는 것입니다. 이것은 이식의 총 개수에 종양을 개발 이식 동물의 비율은 종양 세포 - 시작 주파수를 결정하는 데 사용되는 희석 세포 이식의 assays을 제한 특히 중요합니다. 여기서 제시하는 방법에서, 70 이식받는 동물 종양 - 전파 휴대폰 번호의 정확한 견적을 제공하는 분석마다 사용됩니다. 사용된 동물의 숫자와 이식 종양 세포의 방사선이 모두가 주어진 암 모델에 맞게 최적화되어 있어야합니다, 예를 들어, 초기 실험 종양 - 시작 세포가 드물게 보여주면, 유용한 이식 접종은 100,000, 50,000, 10,000 1,000 세포 수 있습니다 이식.

Syngeneic zebrafish의 변종은 희석 분석을 제한에 유용합니다. 그러나 이러한 변종이 아직 일반적으로 모든 실험실에서 사용하고, 일부 암 zebrafish 모델은 allogenic 물고기 존재하지 않습니다. 자동 갱신 셀 주파수가 syngeneic zebrafish가 8을 사용한다면보다 10-100 배 이상으로 계산 수 있지만 제한 희석 세포 transplantations은 면역 절제를받은 야생 형 변종으로 수행할 수 있습니다. 일부 종양 세포가 외국 microenvironment에 이식 생존하지 않습니다, 세포의 큰 복용량이 아닌 면역 일치, 조사받는 사람에 이식에 사용되어야합니다하는 것이 중요합니다. 또한, 많은 종양받는 동물의 면역 시스템이 복구 21일 후 복귀하기 시작되므로 동물은 매 7 일마다 이식 후 종양 성장에 대한 평가해야합니다.

여기에 제시 방법은 zebrafish 암 모델에서 사용하기에 적합하며, 지금까지 결정하는 데 사용되었습니다 종양 - 시작 T - 세포 급성 lymphoblastic 백혈병 8, 고체 종양 모델, rhabdomyosarcoma 16 모두 셀 주파수를. 이러한 종양은 찬란 oncogene과 형광 마커 모두와 배아의 공동 주사로 라벨이 붙지만, DNA 공동 segregates는 oncogene을 표현하는 세포는 형광 단백질 17 표현 때문에. 그것은 동물을 희생하지 않고 종양 성장의 추적 촉진 및 외과 의해 종양 세포를 분리하기 위해 스트레이트 전달 방법을 제공하기 때문에 형광 권장하는 동안, 그것은 자신의 정화를 촉진하는 종양이 특정 업체에 항체로 종양 세포를 분류 할 수 있습니다 , zebrafish에 불구하고 항체 얼룩이 최적화가 필요할 수 있습니다.

마지막으로, 한번 종양 - 증식 세포의 발병률이 주어진 종양의 유형에 대한 결정되었습니다, 그것은 그들의 셀룰라 주파수를 제어 메커니즘을 식별하는 데 이러한 assays를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 기본 종양 세포는 희석 이식, 또는 자신이 마약을 복용한 수 이식 물고기를 제한하기 전에 특정 경로 억제제로 치료하실 수 있습니다. 또한, 종양 자체의 유전자는 결과 기본 종양 유전자를 과다 표현되도록, 관심있는 유전자를 가진 세포 단계 생선을 주사에 의해 조작 수 있습니다. 이 실험에서, 자기 갱신 세포 주파수에 대한 영향은 제한 희석 assays에서 관찰됩니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

기금은 NIH 보조금 5T32CA09216 - 26 (JSB) 및 K01 AR055619 - 01A1 3 K01 AR055619 - 03S1 (DML)을,뿐만 아니라 알렉 스의 레모네이드 스탠드 재단, 하버드 줄기 세포 연구소 미국 암에 의해 제공되었습니다 사회.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NotI restriction enzyme New England Biolabs R0189
Phenol:Chloroform EMD Millipore 6805-OP
5M KCl Sigma-Aldrich P9541
100X Tris-EDTA Sigma-Aldrich T9285
High Range DNA ladder Fermentas R0621
Syngeneic zebrafish References6-8
Fetal Bovine Serum GIBCO, by Life Technologies 16000-036
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864
26G/2" Microsyringe Hamilton Co 80366
40μm mesh cell strainer BD Biosciences 352340

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References

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Comments

1 Comment

  1. Extremely interested video and very useful model to study cancer genetics.

    Reply
    Posted by: Alessandra P.
    July 8, 2013 - 9:02 AM

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