增强生物安全与聚合物复合物Ecotropic慢病毒的人体细胞的转导

Published 7/24/2011
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Biology
 

Summary

慢病毒是一个有价值的研究工具,为探索基因功能,然而,研究人员可能希望避免生产pantropic慢病毒,已知的编码或怀疑致癌基因。作为替代方案,我们目前使用ecotropic慢病毒修改的人体细胞表达ecotropic的受体mSlc7a1一个更安全的协议。

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Barrilleaux, B., Knoepfler, P. Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety. J. Vis. Exp. (53), e2822, doi:10.3791/2822 (2011).

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Abstract

干细胞和肿瘤细胞生物学的研究往往需要与已知或怀疑有致癌基因的人类细胞中的病毒转导,提高实验室工作人员的主要的安全问题。 Pantropic慢病毒,如常用VSV - G伪的,是一个有价值的工具,为研究基因的功能,因为他们可以转导多种细胞类型,包括非分裂细胞。然而,研究人员可能希望避免生产和离心pantropic病毒编码的癌基因,由于较高的生物安全水平的处理要求和安全问题。几个强有力的癌基因,包括c - Myc和SV40大T抗原,被称为诱导多能干细胞(IPSC),以提高生产。所有其他已知的IPSC -诱导的基因变化(OCT​​4,SOX2,KLF4,NANOG,LIN28,和p53功能的丧失)也有癌症的链接,以及相对高的安全问题。

虽然这些与癌症有关的的病毒是有用的细胞重新编程和多能性研究,他们必须使用安全。为了解决这些生物安全问题,我们证明ecotropic慢病毒的人体细胞传导的方法,进一步强调降低成本和方便处理。我们产生足够高滴度ecotropic的慢病毒转导大于90%受体表达人类细胞暴露在病毒,验证了这种方法的疗效。

慢病毒往往集中超速离心法,但是,这个过程需要几个小时的,并且能够产生气溶胶传染给人类生物医学研究人员。作为替代方案,病毒颗粒可更安全地沉淀到细胞与硫酸软骨素及聚凝胺(CS / PB)的络合。这种技术增加了功能的病毒滴度,细胞稳定表达小鼠逆转录病毒的受体,可以忽略不计时间和成本的3倍。使用CS /铅浓度比以前报道癌细胞株的最优值低约4倍,这表明,聚合物浓度应滴定利益的靶细胞类型,是最大限度地提高了人类的皮肤成纤维细胞(HDFS)传导。因此,我们描述使用methylthiazolyldiphenyl四唑溴化物(MTT)聚合物中的一个新类型的细胞毒性检测。我们观察后,无论是使用聚合物络合或聚凝胺(PB,6微克​​/毫升)的标准剂量的病毒传导HDFS相当于可行性,表示最小的急性毒性。

在这个协议中,我们描述了使用ecotropic慢病毒在人体细胞癌基因的过度表达,减少生物安全风险和提高转导率。我们也证明了高分子络合使用,以提高转导,同时避免形成气溶胶病毒颗粒的离心。

Discussion

莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和其受体mSlc7a1的基础上重组ecotropic gammaretrovirus很好的研究和广泛使用,已使用超过20年提供的转基因小鼠细胞。最近Ecotropic gammaretrovirus也被用来提供对人体细胞的原癌基因在细胞重新编程的情况下,mSlc7a1使用amphotropic窝藏人类癌基因的病毒,以避免产生是公认的4,5然而,慢病毒提供了显着的优势超过gammaretrovirus在转导难治性细胞群包括原代细胞,往往是理想的目标进行重新编程,因为慢病毒的预集成的复杂允许7转导非分裂细胞。

已经产生不同的伪几十个,包括MLV在努力改变嗜性病毒,毒性和其他属性。已8 MLV的假型ecotropic慢病毒转导小鼠细胞中,9,但已很少被用于对人体细胞的慢病毒, 10因此,我们建议使用假型MLV - ecotropic慢病毒作为一种安全,成本效益,高效的车辆提供已知或怀疑有致癌基因,包括细胞重新编程因素 ​​,对人体细胞。

要注意,这个协议并没有完全消除需要制作和使用pantropic慢病毒,相反,这个协议从pantropic病毒分离的癌基因(S),绝缘与癌症相关的病毒研究人员从潜在的自我接种,这是关键。广泛表达的蛋白质mSlc7a1和人类的同源hSlc7a1氨基酸转运与任何已知的致瘤性或赋予受体细胞的选择性生长优势的能力,11 mSlc7a1纳入amphotropic病毒的风险相对较低。这增加的步骤可能会特别有用,在缺乏专门的病毒或组织文化设施所需要的生物安全水平的实验室。

在某些情况下,它可能是可能完全消除pantropic病毒转染质粒Slc7a1直接进入靶细胞的使用,然而,许多细胞,将这种技术非常有用的目标也难治性转染。作为一种替代方法,隔离Slc7a1能力转导的细胞杀稻瘟选择一次,VSV - G假型慢病毒可用于生成一个受体表达的细胞,ecotropic病毒后可用于常规转导这些细胞对于许多股票实验。研究人员应始终遵循与任何慢病毒工作的机构的安全指引,无论其向性。

这个协议取得ecotropic病毒滴度比VSV的假型病毒,一般为10-20%的pantropic病毒滴度与以往的研究一致,适度降低这些滴度分别在人体细胞中测稳定与Slc7a1转,所以较低的观察ecotropic病毒滴度,部分原因可能是由于不同的靶细胞受体基因的表达。尽管如此,对于大多数应用已经足够,在我们的协议中所取得的病毒滴度,并导致在某些情况下,多数细胞的转导,细胞> 90%。

基于离心技术常用集中的病毒颗粒。然而,离心需要几个小时,产生传染性气溶胶,并可能导致重大损失的病毒颗粒,作为替代方案,络合与CS / PB 12可用于没有改变病毒嗜增强 3,此方法是快速(5分钟)和廉价(每10毫升病毒0.03元),而大约三倍观察滴度。需不需要特殊的设备或专有试剂,并在与其他细胞系的前期工作的协议,我们观察后HDFS接触到CS / PB最小急性毒性,13本议定书的一个潜在的缺点是,一些微观可见的高分子复合物坚持文化中的数天的细胞。我们不能排除这种可能性,这些复合物,而没有明显细胞毒性,可能对细胞过程的更微妙的影响。

在这里,我们所描述的安全和有效地转导与致癌因素的人体细胞的方法。这种做法应包括iPS细胞癌基因和干细胞生物学研究的伟大事业。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

这个项目的经费是由美国加州再生医学研究所。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 Murine MLV receptor
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G envelope
pCMV-dR8.91 Addgene D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-Ec–nv Addgene 15802 Ecotropic envelope
FUGW Addgene 14883 GFP control plasmid
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD Roche Group 04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma-Aldrich C4384
Blasticidin S Fisher Scientific BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021

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References

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