Transduktion av mänskliga celler med polymer-komplexbundet Ecotropic lentivirus för förbättrade biosäkerhet

Published 7/24/2011
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Lentiviruses är ett värdefullt forskningsverktyg för att undersöka geners funktion, men kan forskare vill undvika produktion av pantropic kända lentivirus kodning eller misstänkt onkogener. Som ett alternativ, presenterar vi en säkrare protokoll för användning av ecotropic lentivirus på mänskliga celler modifierats för att uttrycka ecotropic receptorn mSlc7a1.

Cite this Article

Copy Citation

Barrilleaux, B., Knoepfler, P. Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety. J. Vis. Exp. (53), e2822, doi:10.3791/2822 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stamceller och tumör cellbiologi studier kräver ofta viralt transduktion av mänskliga celler med känd eller misstänkt onkogener, höja viktiga säkerhetsfrågor för laboratorie-personal. Pantropic lentiviruses, som vanligen används VSV-G pseudotype, är ett värdefullt verktyg för att studera geners funktion eftersom de kan transduce många celltyper, inklusive icke-delande celler. Däremot kan forskarna vill undvika produktion och centrifugering av pantropic virus kodning onkogener på grund av högre biosäkerhet krav nivå hantering och säkerhetsfrågor. Flera potenta onkogener, inklusive c-Myc och SV40 stora T-antigen, är känd för att öka produktionen av inducerade pluripotenta stamceller (IPSC). Alla andra kända IPSC-inducerande genetiska förändringar (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 och p53 förlust av funktion) har också länkar till cancer, vilket gör dem relativt hög säkerhet oro också.

Även om dessa cancer-relaterade virus är användbara för att studera cellulära omprogrammering och pluripotens, måste de användas säkert. För att lösa dessa biosäkerhet frågor, visar vi en metod för transduktion av mänskliga celler med ecotropic lentivirus, med extra betoning på minskade kostnader och bekväm hantering. Vi har tagit fram ecotropic lentivirus med tillräckligt hög titer till transduce mer än 90% av receptor-uttrycka mänskliga celler utsätts för viruset, validera effekten av denna strategi.

Lentivirus ofta koncentreras genom ultracentrifugering, men tar detta flera timmar och kan producera aerosoler smittsamt för människor biomedicinska forskare. Som ett alternativ viruspartiklar kan vara mer säkert sjunkit ned cellerna genom komplexbildning med kondroitinsulfat och polybrene (CS / PB). Denna teknik ökar den funktionella virus titer upp till 3-faldig i celler stabilt uttrycka murina retrovirus-receptorn, med försumbar lagt tid och kostnad. Transduktion av mänskliga dermal fibroblaster (HDFS) är maximalt förstärkt med CS / PB koncentrationer ca 4-faldigt lägre än det optimala värdet som tidigare rapporterats för cancercellinjer, vilket tyder på att polymer koncentrationen bör titreras till målcellen typ av intresse. Vi beskriver därför användning av methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromid (MTT) för analys för polymer toxicitet i en ny celltyp. Vi iakttar motsvarande livskraft HDFS efter virus transduktion med antingen polymer komplexbildning eller standard dos polybrene (PB, 6 mikrogram / ml), vilket tyder på minimal akut toxicitet.

I detta protokoll, beskriver vi användning av ecotropic lentivirus för överuttryck av onkogener i mänskliga celler, vilket minskar biosäkerhet riskerna och öka transduktion takt. Vi visar också användningen av polymera komplexbildning att förbättra transduktion och samtidigt undvika aerosol-bildande centrifugering av viruspartiklar.

Discussion

Rekombinant ecotropic gammaretrovirus baserat på Moloney murina leukemi virus (MLV) och dess receptor mSlc7a1 är väl studerat och allmänt tillgängliga, har använts i över 20 år att leverera transgener mot murina celler. Ecotropic gammaretrovirus har också använts på senare tid för att leverera onkogener till mänskliga celler,. I samband med cellulär omprogrammering, användning av mSlc7a1 undvika generation amphotropic virus hysa mänskligt onkogener är väl etablerad 4,5 ger dock lentivirus betydande fördelar jämfört med gammaretrovirus i transducing refraktär cellpopulationer, 6 inklusive primära celler som ofta är önskvärt mål för omprogrammering, eftersom Lentiviral före integrationen komplex kan transduktion av icke-delande celler. 7

Lentiviruses har producerats med dussintals olika pseudotypes, bland MLV, i ett försök att ändra virus tropism, toxicitet och andra egenskaper. 8 MLV-pseudotyped ecotropic lentivirus har använts för att transduce musceller, 9 men har sällan använts på mänskliga celler . 10 Vi föreslår därför att använda MLV-pseudotyped ecotropic lentivirus som en säker, kostnadseffektiv och mycket effektiva fordon för att leverera kända eller misstänkta onkogener, inbegripet cellplattor omprogrammering faktorer, till mänskliga celler.

Det är viktigt att notera att detta protokoll inte helt eliminera behovet av att producera och använda pantropic lentivirus, utan skiljer detta protokoll onkogen (s) från pantropic viruset, isolerande forskare från potentiella själv inokulering med cancer-relaterade virus. Proteinet mSlc7a1 och dess mänskliga homolog hSlc7a1 är ubiquitously uttrycks aminosyra transportörer utan känd tumorigenicitetsprov eller förmåga att ge en selektiv tillväxt fördel mottagaren celler, 11 vilket gör mSlc7a1 relativt låg risk för inbyggnad i amphotropic virus. Denna extra steg kan vara särskilt användbart i laboratorier som saknar dedikerad virus eller vävnad anläggningar kultur krävs biosäkerhetsnivån.

I vissa situationer kan det vara möjligt att helt eliminera användningen av pantropic virus genom transfecting den Slc7a1 plasmiden direkt i målceller, men många celler som skulle vara bra måltavlor för denna teknik är också refraktära mot transfektion. Som ett alternativ, förmågan att isolera Slc7a1-transduced celler genom blasticidin val innebär att VSV-G pseudotyped lentivirus kan användas en gång för att generera ett lager av receptor-innehållande celler, varefter ecotropic virus kan användas rutinmässigt för att transduce dessa celler för många experiment. Forskare bör alltid följa sina institutionella riktlinjer för säkerheten för att arbeta med någon lentivirus, oavsett dess tropism.

Titrar av ecotropic virus uppnås med detta protokoll är något lägre än VSV-pseudotyped virus, i allmänhet 10-20% av pantropic viruset titer, i samförstånd med tidigare studier. 9 Dessa titrar mättes i mänskliga celler stabilt transduced med Slc7a1, så den lägre observerade titer för ecotropic virus kan delvis bero på olika uttryck av receptorn genen i målceller. Trots den virala titrar uppnås i våra protokoll är mer än tillräckligt för de flesta applikationer och leda till transduktion för majoriteten av celler, i vissa fall> 90% av celler.

Centrifugering-tekniker används ofta för att koncentrera viruspartiklar. Kräver dock centrifugering flera timmar, genererar smittsamma aerosoler, och kan resultera i betydande förlust av viruspartiklar. 12 Som ett alternativ, komplexbildning med CS / PB kan användas för att förbättra transduktion utan att ändra viral tropism. 3 Denna metod är snabb (5 minuter ) och billig ($ 0,03 per 10 ml-virus), medan ungefär tredubblas de observerade titer. Ingen speciell utrustning eller egenutvecklade reagenser som krävs, och vi observerade minimal akut toxicitet efter exponering av HDFS CS / PB, i samförstånd med tidigare arbete i andra cellinjer. 13 En potentiell nackdel med detta protokoll är att vissa mikroskopiskt synliga polymer komplex följa cellerna i flera dagar i kulturen. Vi kan inte utesluta att dessa komplex, men inte direkt toxiska för cellerna, kan ha mer subtila effekter på cellulära processer.

Här har vi beskrivit en metod för säkert och effektivt transducing mänskliga celler med onkogena faktorer. Denna strategi bör vara till stor nytta för forskare att studera onkogener och stamcellsbiologi inklusive iPS-celler.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Finansieringen för detta projekt från California Institute för regenerativ medicin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 Murine MLV receptor
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G envelope
pCMV-dR8.91 Addgene D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-Ec–nv Addgene 15802 Ecotropic envelope
FUGW Addgene 14883 GFP control plasmid
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD Roche Group 04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma-Aldrich C4384
Blasticidin S Fisher Scientific BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats