Author Produced

الأعور إجراء ربط البزل

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الفأر نموذج من ربط الأعور وثقب باعتبارها أداة قيمة لدراسة الإنتان الإنسان.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتتميز الإنتان الإنسان من قبل مجموعة من ردود الفعل الشاملة في الاستجابة للعدوى المكثفة والواسعة النطاق التي فشلت في أن ترد محليا من قبل المضيف. حاليا ، الإنتان صفوف من بين الأسباب العشرة الأولى للوفيات في الولايات المتحدة الأمريكية وحدات الرعاية المركزة 1. خلال الإنتان هناك مرحلتين الديناميكية الدموية التي قد أنشأت التداخل. تعرف المرحلة الأولى (مفرط الديناميكية) وإنتاج هائلة من السيتوكينات proinflammatory وأنواع الاكسجين التفاعلية التي الضامة ، والتي تؤثر على العدلات نفاذية الأوعية الدموية (مما يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم) ، وظيفة القلب ويؤدي الى تغييرات الأيضية وبلغت ذروتها في نخر الأنسجة وفشل الجهاز. وبالتالي فإن السبب الأكثر شيوعا للوفيات وإصابات حادة في الكلى. انخفض انتشار الخلايا اللمفاوية والخلايا وظيفة وزيادة في المرحلة الثانية (hypodynamic) هو عملية المضادة للالتهابات التي تنطوي على تغيير العرض مستضد الوحيدات. هذه الحالة تعرف باسم كبت المناعة أو الاكتئاب يزيد من المناعة بشدة لخطر العدوى nocosomial والموت في نهاية المطاف. ليست آليات عملية من هذه العمليات الفيزيولوجية المرضية تتميز أيضا. لأن كلا من مراحل الإنتان قد يسبب ضررا لا يمكن اصلاحه لا رجعة فيه وأنه لا بد من تحديد الحالة المناعية والفسيولوجية للمريض. هذا هو السبب الرئيسي وراء العديد من العقاقير العلاجية قد باءت بالفشل. قد يعطى الدواء نفسه في مراحل مختلفة من التعفن تكون علاجية أو الضارة أو غير ذلك ليس لها أي أثر 2،3 لفهم الإنتان على مختلف المستويات من المهم أن يكون النموذج الحيواني مناسب وشامل يعيد مسار السريرية لهذا المرض. من المهم أن تميز الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تحدث أثناء الإنتان والتحكم في ظروف نموذجية لاختبار العوامل العلاجية المحتملة.

لدراسة مسببات تسمم الإنسان من الباحثين قد وضعت نماذج حيوانية مختلفة. النموذج الأكثر استخداما السريرية هو ربط الأعور وثقب (CLP). طراز CLP يتكون من ثقب في الأعور السماح بالإفراج عن المواد البرازية في التجويف البريتوني لتوليد استجابة مناعية تتفاقم الناجم عن الإصابة متعدد المكروبات. هذا النموذج يستوفي الشرط البشري الذي هو ذات الصلة سريريا. كما هو الحال في البشر والفئران التي تتعرض CLP مع الانعاش السوائل تظهر الأول (المبكر) المرحلة مفرط الديناميكية التي تقدم في الوقت المناسب للمرحلة (الراحل) الثاني hypodynamic. بالإضافة إلى ذلك ، ملف خلوى مشابهة لتلك التي شوهدت في الإنتان البشرية حيث هناك زيادة في الخلايا اللمفاوية (4،5 في استعراض). يرجع ذلك إلى آليات متعددة ومتداخلة المشاركة في التعفن ، يحتاج الباحثون نموذجا لشدة الإنتان مناسبة للرقابة من أجل الحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار.

Protocol

1. الأعور ربط والبزل نموذجا فأرة للالإنتان الإنسان

لهذا الإجراء C57BL / 6 تستخدم الفئران (7-9 أسابيع من العمر).

  1. تخدير عن طريق حقن فأر intraperitoneally حل الكيتامين 1:1 (75mg/kg) وزيلازين (15mg/kg). كمرجع ، وضخ 30 ميكرولتر من الحل في 01:01 ماوس وزنها 20 غراما. بدلا من ذلك ، يمكن أن يكون تخدير الفئران مع isoflurane استنشاق باستخدام المرذاذ مخدر.
  2. حلق البطن من الفأر وتطهير المنطقة من قبل أول حل betadine تطبيق تليها المسح مع مسحة الكحول 70 ٪ (رقم 1 في تسلسل الصورة أدناه). ويمكن استخدام الكلورهكسيدين كمطهر البديلة. اختياري : يمكن استخدام ثنى المعقمة للحفاظ على المنطقة نظيفة.
  3. تحت ظروف معقمة وممارسة 1-2 البطن خط الوسط الطول وفضح الأعور مع الأمعاء المجاورة (2 و 3).
  4. هو ligated بإحكام الأعور مع خياطة الحرير 6.0 (6-0 PROLENE ، 8680G ؛ Ethicon) عند قاعدته دون صمام اللفائفي الأعور ، ومثقوبة مرة أو مرتين بابرة عيار 19 (4 و 5) على نفس جانب من الأعور. يرجى ملاحظة أن طول الأعور ligated يعرف بأنه المسافة من نهاية القاصية من الأعور إلى نقطة ربط وتحديد درجة شدتها. مسافة> 1cm تنتج الإنتان درجة عالية بينما مسافة 1 سم ≤ تنتج منتصف إلى انخفاض درجة التعفن. نلاحظ أيضا أن استخدام أسلوب ثقب الأعور هو موضح هنا يختلف عن معيار من خلال وعبر تقنية ثقب (إدخال إبرة عبر الأعور). كلا أساليب إنتاج موثوق نتائج الإنتان نفسه. ومع ذلك ، واحدة من عيوب هذه التقنية من خلال وعبر هو أنه لا يسهل التحكم في كمية البراز مقذوف عندما محشورة في الأعور.
  5. ومن ثم الأعور محشورة برفق لقذف كمية صغيرة من البراز من مواقع ثقب (6). يتم إرجاع الأعور إلى التجويف البريتوني وإغلاق الصفاق مع خيوط الحرير 6.0. (7).
  6. إغلاق الجلد مع مقاطع 7mm ريفلكس (RS - 9258 ، الآلات الجراحية Roboz) أو مقاطع الجرح ميشال (7 ملم ، RS - 9270) (8).
  7. إحياء طريق حقن تحت الجلد الفئران 1 مل من محلول ملحي قبل تحسنت بنسبة 0.9 ٪ باستخدام إبرة 25G. وهذا التدبير الانعاش السوائل تحفز مرحلة مفرط الديناميكية الإنتان. وصفت هذه الخطوة الحاسمة في المقطع مزيد من المناقشة.
  8. اختياري : حقن تحت الجلد البوبرينورفين (0.05mg / كيلوغرام من وزن الجسم) أو ترامادول (20mg/kg وزن الجسم) لتسكين بعد العملية. أخذ العلم بأن هذه المواد الأفيونية يمكن منع التنفس وتنقل ، ويمكن تفسيره هذه الآثار باعتبارها علامات التسمم.
  9. توضع الحيوانات مؤقتا على وسادة التدفئة أو بدلا من ذلك على الفور وعاد الى قفص مع التعرض لمصباح الأشعة تحت الحمراء التدفئة 150W حتى يشفى من التخدير. الوقت التعافي من أكثر من 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
  10. توفير حرية الوصول إلى الغذاء والماء (هيدروجيل) وضعت على الجزء السفلي من القفص.
  11. ويتم رصد الفئران كل 12 ساعة للبقاء لمدة أسبوع أو أسبوعين أو الموت الرحيم في نقاط زمنية مختلفة لتحليل معلمات مختلفة.

كما تحكم لتصميم تجريبي ، والحيوانات الشام اتبع أسلوب البطن دون ربط والبزل.
سوف ست ساعات إلى 12 ساعة بعد العملية الجراحية الفئران تصبح السبات العميق ، وتطوير الحمى ، وانتصاب الشعر ، والإسهال ، جالسين ، والشعور بالضيق ، وكلها أعراض التسمم. يمكن أن الفئران مع التسمم الحاد جدا بالكاد تحرك قبل وفاته ويحمل الانخفاض الكبير في حرارة الجسم. وينبغي في هذه الخطوة يتم التخلص الفئران لتجنب الألم والمعاناة لفترة طويلة.

الرقم 0

2. الأكثر شيوعا معلمات حلل

لتقييم نتائج هذا الإجراء ، يمكن تحليل المعلمات في الأجهزة المختلفة ، ومقتطفات الخلية أو سوائل الجسم. ويمكن جمع عينات في نقاط زمنية مختلفة في الفترة من 3 ساعات لمدة أسبوع بعد إجراء العملية الجراحية.

  1. الفئران البقاء على قيد الحياة.
  2. السيتوكينات وchemokines في تجويف والمصل البريتوني ومقتطفات الجهاز.
    1. انترلوكين 6 : إنتاج ، وصدر عن حيدات ، والخلايا الجذعية ، الضامة ، وخلايا B وخلايا T ، المحببة ، والخلايا البدينة وأنواع الخلايا غيرها الكثير. انها تلعب دورا مهما في رد فعل المرحلة الحادة والالتهابات.
    2. نخر الورم عامل α : خلوى Pleiotrophic التي تلعب دورا رئيسيا في التهاب وموت الخلايا المبرمج. التي تنتجها حيدات ، الضامة ، العدلات ، والخلايا الجذعية ، والخلايا الليفية.
    3. nterleukin - 1β : إنتاج حيدات ، وخلايا NK ، والخلايا الجذعية ، والخلايا البائية والخلايا التائية. الحث الحمى الحادة وتخليق البروتين المرحلة.
    4. انترلوكين 10 : يعزز امتصاص أكلة واستجابات TH2لكن العرض مستضد ويقمع TH1 ردود proinflammatory.
    5. انترلوكين 10 : يعزز امتصاص أكلة واستجابات TH2 لكن يقمع العرض مستضد وTH1 ردود proinflammatory.
    6. الوحيدات الكيميائي البروتين - 1 (المعروف أيضا باسم CCL2) : المجندون حيدات ، وخلايا T الذاكرة ، والخلايا الجذعية إلى مواقع الإصابة الأنسجة والعدوى.
    7. KC (CXCL1) : إنتاج الضامة ، والخلايا البطانية. KC الماوس هو جاذب العدلة ومنشط قوي.
    8. RANTES : A الوحيدات جاذب كيميائي. يمكن أن chemoattract CD4 unstimulated + / + CD45RO الخلايا التائية الذاكرة وCD4 + وحفز الخلايا التائية CD8 + مع هاء والظواهر غير متوفر الذاكرة.
    9. انترفيرون γ : يفرزها TH1 الخلايا ، الخلايا التائية السامة للخلايا ، والخلايا الجذعية ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK). زيادة العرض مستضد والنشاط lytic في الضامة ، ويقمع TH2 نشاط الخلايا. وتعزز التصاق ملزمة المطلوبة للهجرة الكريات البيض ويعزز نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية.
    10. عالية تنقل مجموعة B - 1 البروتين : وحيدات هي العامل النووي كابا بي منشط بواسطة ملزم لمستقبلات الخلوية للمنتجات مقدما نهاية glycation (الغضب) ، وتفعيل للوساطة في اطلاق سراح proinflammatory في مرحلة متأخرة من التعفن.
  3. تقرير الميلوبيروكسيديز في الهيئات كمقياس للتسلل العدلة. الميلوبيروكسيديز (MPO) هو انزيم البيروكسيديز معظم الحاضرين بكثرة في المحببة العدلة. وهو بروتين الليزوزومية المخزنة في حبيبات أليف اللازورد من العدلات. MPO له صبغة الهيم ، والذي يسبب لونه أخضر في إفرازات غنية العدلات ، مثل القيح وبعض أشكال من المخاط.
  4. تحميل البكتيريا في مجرى الدم ، وأجهزة ، وقياس وعدد مستعمرة في الملليمتر الواحد.

3. ممثل النتائج

في البداية تم تنفيذ الإجراء CLP في سلالة الفأر C57BL / 6. اختبرنا العديد من المعلمات لتعديل شدة الإنتان عن طريق تغيير طول وسمك ربط الإبرة كما هو موضح في الشكلين 1 و 2. من بين هذه العوامل ، وهما طول الربط يبدو أن يكون أكثر فعالية من سمك الإبرة لتغيير البقاء في المئة. كما هو مبين في الشكل (1) ، وزيادة طول الربط بأكثر من 1cm يثير زيادة في معدل الوفيات بنسبة 100 ٪ مقارنة مع الفئران من وجود ربط ≤ 1cm. زيادة سمك الإبرة انخفضت أيضا بقاء في المئة من 100 ٪ (باستخدام إبرة 22G) إلى 55 ٪ (باستخدام إبرة 19G) مع اثنين من الثقوب. اختبرنا أيضا تأثير على CLP C57BL / 6 و 129SvJ الفئران لتحديد ما إذا سلالات مختلفة الماوس حساسية مماثلة أو عرض متميز لCLP التي يسببها التسمم. الشكل 3 يوضح أنه في ظل الظروف نفسها ، وكانت الفئران 129SvJ أكثر عرضة للإصابة من C57BL / 6 ، وأشار في المئة عن طريق زيادة وفيات.

الشكل 1
الشكل 1. تم تنفيذ ربط تأثير طول من الأعور في البقاء على قيد الحياة الحيوانية. CLP في C57BL / 6 الفئران باستخدام اثنين من أطوال مختلفة من ربط الأعور. هذا يؤثر بشكل كبير معلمة واحدة البقاء على قيد الحياة الحيوانية حيث أن جميع الحيوانات في المجموعة برصيد منطقة ربط أطول من 1 سم لقوا حتفهم في أقل من 3 أيام بالمقارنة مع مجموعة من الحيوانات وجود مجال للربط حوالي 1 سم. (ن = 8).

الشكل 2
الشكل 2. أنجز تأثير إبرة سمك على البقاء. CLP في C57BL / 6 الفئران باستخدام إبرة بمرتين مختلفة ، و19G 22G. وأظهرت الفئران مع الأعور مثقبة باستخدام إبرة 19G البقاء على قيد الحياة 55-60 ٪. في المقابل ، أظهرت الفئران مع الأعور مثقبة باستخدام إبرة 22G البقاء على قيد الحياة بنسبة 100 ٪ على الرغم من أنهم من ذوي الخبرة تظهر عليهم اعراض الالتهاب خلال الأيام 3-4 الأولى ، التي اختفت بعد 4 أيام (ن = 8).

الشكل 3
الشكل 3. المقارنة بين قابلية الإنتان سلالتين الماوس مختلفة. أنجز هذا النموذج في CLP 129SvJ وC57BL 6 / في ظل نفس الظروف. في نهاية فترة التقييم هو البقاء على قيد الحياة في المئة من سلالة 129SvJ 25 ٪ أقل مما كانت عليه في السلالة C57BL / 6 ، مما يدل على ارتفاع القابلية للالتهاب الناجم عن الإصابة متعدد المكروبات. (ن = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نعرض بالتفصيل كيفية تنفيذ نموذج CLP في الفئران وتعدل الدرجة من الشدة.

بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأخرى الإنتان ، ويمكن أن يؤديها في أي سلالة CLP الماوس من مختلف الأعمار والجنس. فمن السهل إجراء العمليات الجراحية وغير مكلفة نسبيا. في هذا النموذج ، ودرجة من الخطورة لديها تأثير مباشر على نسبة البقاء على قيد الحياة. طول الربط ، سمك الإبرة وعدد الثقوب والمعلمات التي يمكن السيطرة عليها لتعدل من شدة / وفيات CLP. وبالتالي ، للحصول على تغييرات جذرية في شدة CLP ، يمكن للمستخدم تغيير طول ربط بينما يمكن إدخال تعديل طفيف في شدتها عن طريق ضبط سمك الإبرة.

المعالم الهامة الأخرى التي يمكن الأخذ تقلب كبير في نتائج CLP هي سلالة 6،7 الماوس ، والجنس (8) وعمر الحيوان 9. في هذا الصدد أن نظهر أن سلالات مختلفة الماوس عرض حساسيات مختلفة لإجراء عندما تتم تحت نفس الظروف. في الواقع ، تم الكشف عن الاختلافات في مستويات البلازما خلوى وتلف الأنسجة بين سلالات مختلفة الماوس 10-12. إدراج إنعاش السوائل وإدارة مسكن هي العوامل التي يمكن أن تقلب كبير في تقديم نموذج CLP. على سبيل المثال ، يزيد معدل الانعاش السوائل البقاء على قيد الحياة ربما يقلل من إنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات المبكرة 11 ، 13 ، 14 وبالتالي اخفاء آثار التدخلات العلاجية المحتملة. في المقابل ، يمكن أن المسكنات المخدرة قمع تحرك في التنفس والحيوان واستفزاز لها تأثير لا رجعة فيه لا علاقة لها الإنتان. استخدامها ، وبالتالي ، يمكن أن تؤثر على معدل البقاء على قيد الحياة وظيفة الخلايا المناعية 15.

في الختام ، لا بد عند تنفيذ النموذج CLP تكون كل هذه الشروط والمعايير الفنية مدروسة بعناية من أجل الحصول على نتائج يمكن استنساخه ومتسقة. لذا ، لا بد من معرفة عميقة للغاية واتقان لإجراء لتنفيذ طراز CLP بدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة من وزارة الصحة ولاية بنسلفانيا.
وكان الدكتور ميغيل غارسيا توسكانو زميل ما بعد الدكتوراه في جامعة تمبل ، الذي تموله مؤسسة ألفونسو مارتن اسكوديرو خلال هذه الدراسة.
نريد ان نشكر إيليا يوردانوف وKotredes كيفن لصنع شريط الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
  2. Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
  3. Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
  4. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
  5. Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
  6. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
  7. De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
  8. Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
  9. Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
  10. Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
  11. Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
  12. Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
  13. Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
  14. Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
  15. Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).

Comments

7 Comments

  1. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:03 AM
  2. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:27 AM
  3. Hello Colleges, we are very interested in your model of abdominal sepsis, we would very much like to ask you a complete description, unfortunately we can not pay money for it. We'll be very grateful, and try using it to make a drop in the ocean of the world science.

    Reply
    Posted by: Roma Z.
    November 26, 2013 - 3:33 PM
  4. I'll be happy to send you the complete description. please provide me an e-mail address where to send the information.
    Ana

    Reply
    Posted by: ana g.
    November 26, 2013 - 4:43 PM
  5. medroma03@gmail.com I am very grateful to you and I promise you that all this will not be publicized.

    Reply
    Posted by: Roma Z.
    November 27, 2013 - 12:21 AM
  6. dear sir:I am a student of zhejiang University of China,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!
    my e-mail:li.renjun@yahoo.com

    Reply
    Posted by: li r.
    January 12, 2014 - 9:42 PM
  7. Dear sir:I am a student from Jiangsu University. Recently we will do some experiment in this CLP model. however, we all don't understand the detail about the procedure. So when we search your video, we are very excited. Would you please send it to us,because we can't afford it? Thank you very much! my e-mail: 191853184@qq.com.

    Reply
    Posted by: Yuyun X.
    January 14, 2014 - 2:26 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics