Author Produced

Cecal Ligation Punktering Förfarande

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den musmodell av cecal ligation och punktera som ett värdefullt verktyg för studiet av mänskliga sepsis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mänskliga sepsis kännetecknas av en uppsättning av systemiska reaktioner som svar på intensiv och massiva infektion som inte kunde vara lokalt tillbaka av värden. För närvarande sepsis rankas bland de tio dödsorsakerna i USA intensivvårdsavdelningar 1. Vid sepsis finns två etablerade hemodynamisk faser som kan överlappa varandra. Den första fasen (hyperdynamic) definieras som en massiv produktion av proinflammatoriska cytokiner och reaktiva ämnen syrgas makrofager och neutrofiler som påverkar vaskulär permeabilitet (som leder till hypotension), hjärtfunktion och inducerar metabola förändringar kulminerade i vävnadsnekros och organsvikt. Följaktligen är den vanligaste dödsorsaken akut njurskada. Den andra fasen (hypodynamic) är en anti-inflammatorisk process med förändrat monocyter antigen presentation, minskade lymfocyter spridning och funktion och ökad apoptos. Detta tillstånd kallas immunsuppression eller immun depression ökar kraftigt risken för nocosomial infektioner och slutligen döden. Mekanismen bakom dessa patofysiologiska processer är inte väl karakteriserade. Eftersom båda faserna av sepsis kan medföra oåterkallelig och irreparabel skada är det viktigt att fastställa de immunologiska och fysiologiska status patienten. Detta är den främsta anledningen till många terapeutiska läkemedel har misslyckats. Samma läkemedel ges i olika stadier av sepsis kan vara terapeutiskt eller på annat sätt skadliga eller ha någon effekt 2,3. För att förstå sepsis på olika nivåer är det avgörande att ha en lämplig och omfattande djur-modell som återger det kliniska förloppet av sjukdomen. Det är viktigt att karakterisera patofysiologiska mekanismer som uppstår vid sepsis och kontroll modellen förutsättningar för att testa potentiella läkemedel.

För att studera etiologin av mänskliga sepsis forskare har utvecklat olika djurmodeller. Den mest använda kliniska modellen är cecal ligation och punktering (CLP). CLP-modellen består av perforation av blindtarmen låta utsläpp av fekalt material in i bukhålan för att skapa ett förvärrat immunsvar som framkallas av polymikrobiella infektion. Denna modell uppfyller människans villkor som är kliniskt relevant. Liksom hos människor, möss som genomgår CLP med vätsketillförsel visar den första (tidiga) hyperdynamic fas som med tiden utvecklas till den andra (sent) hypodynamic fas. Dessutom är den cytokin profil som liknar den som ses hos människa sepsis där det finns ökad lymfocyt apoptos (över 4,5). På grund av de många och överlappande mekanismer involverade i sepsis, forskare behöver en lämplig sepsis modell av kontrollerade svårighetsgrad för att få enhetliga och reproducerbara resultat.

Protocol

1. Cecal Ligation och punktering som en musmodell för mänskliga Sepsis

För detta förfarande C57BL / 6 möss (7-9 veckor) används.

  1. Bedöva musen genom att injicera intraperitonealt en lösning på 1:1 ketamin (75mg/kg) och xylazin (15mg/kg). Som referens, injicera 30 ìl av 01:01 lösningen i en mus som väger 20 gram. Alternativt kan möss vara bedövas med inhalerade isofluran med ett bedövningsmedel förångaren.
  2. Shave buken av musen och desinficera området genom att först ansöka Betadine lösning följt av avtorkning med en 70% alkoholservett (nummer 1 i bilden sekvensen nedan). Klorhexidin kan användas som ett alternativ antiseptisk. Tillval: en steril duk kan användas för att hålla området rent.
  3. Under aseptiska förhållanden, öva en 1 till 2 cm mittlinje laparotomi och exponera blindtarmen med angränsande tarm (2 och 3).
  4. Blindtarmen är tätt knyts ihop med en 6,0 silke sutur (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) vid basen under ileoanal reservoar-cecal ventil, och är perforerat en eller två gånger med en 19-nål (4 och 5) på samma sidan av blindtarmen. Observera att längden på knyts ihop blindtarmen definieras som avståndet från distala änden av blindtarmen till ligation punkt kommer att bestämma svårighetsgrad. Ett avstånd på> 1 cm ger hög kvalitet sepsis medan ett avstånd av ≤ 1 cm producerar mitten till låggradig sepsis. Observera också att använda cecal perforeringen metod som visas här skiljer sig från den standard rakt igenom punktering teknik (införande av en nål genom blindtarmen). Båda metoderna ger ett tillförlitligt samma sepsis resultat. Det är dock en nackdel med den alltigenom teknik att det inte lättare att kontrollera mängden avföring extruderade när blindtarmen pressas.
  5. Blindtarmen är sedan försiktigt pressas att pressa en liten mängd avföring från perforeringen platser (6). Blindtarmen är tillbaka till bukhålan och bukhinna är stängd med 6,0 ​​silke suturer. (7).
  6. Huden är stängd med Reflex 7mm clips (RS-9258, Roboz kirurgiska instrument) eller Michel klipp sår (7 mm, RS-9270) (8).
  7. Återuppliva möss genom att injicera subkutant 1 ml förvärmda 0,9% koksaltlösning med en 25G nål. Detta vätsketillförsel åtgärd kommer inducera hyperdynamic fasen av sepsis. Denna kritiska steg beskrivs vidare i diskussionen avsnittet.
  8. Tillval: Injicera subkutant buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvikt) eller tramadol (20mg/kg kroppsvikt) för postoperativ smärtlindring. Tänk på att dessa opiater kan hämma andningen och förflyttning och dessa effekter kan misstolkas som tecken på sepsis.
  9. Djuren placeras tillfälligt på en värmedyna eller alternativt återvände omedelbart till en bur med exponering för en infraröd värme lampa 150W tills de återhämta sig från narkosen. Återhämtningen är från 30 min till 1 timme.
  10. Ger fri tillgång till mat och vatten (hydrogel) placeras på botten av buren.
  11. Möss övervakas var 12 timmar för överlevnad i en till två veckor eller avlivas vid olika tidpunkter för analys av olika parametrar.

Som kontroll för experimentell design, skulle bluff djur följa laparotomi tekniken utan ligatur och punktering.
Sex till 12 timmar efter det kirurgiska ingreppet mössen blir slö och får feber, piloerektion, diarré, trängas, och sjukdomskänsla, alla symtom på sepsis. Möss med mycket svår sepsis kan knappt gå före död och uppvisar en dramatisk minskning av kroppstemperaturen. I detta steg möss bör avlivas för att undvika långvarig smärta och lidande.

Figur 0

2. De vanligaste Analyzed Parametrar

För att utvärdera resultatet av förfarandet, kan olika parametrar analyseras i organ, utdrag cell eller kroppsvätskor. Prover kan samlas in vid olika tidpunkter från 3 timmar till en vecka efter det kirurgiska ingreppet.

  1. Möss överlevnad.
  2. Cytokiner och kemokiner i serum, bukhålan och extrakt orgel.
    1. Interleukin-6: Producerad och släpptes av monocyter, dendritiska celler, makrofager, B-celler, T-celler, granulocyter, mastceller och många fler celltyper. Den spelar en viktig roll i akut fas reaktion och inflammation.
    2. Tumörnekrosfaktor-α: Pleiotrophic cytokin som spelar en central roll i inflammation och apoptos. Producerad av monocyter, makrofager, neutrofiler, dendritiska celler och fibroblaster.
    3. nterleukin-1β: Producerad av monocyter, NK-celler, dendritiska celler, B-och T-celler. Inducerar feber och akuta proteinsyntesen.
    4. Interleukin 10: Främjar fagocytiska upptag och Th2 svar men undertrycker antigen presentation och Th1 proinflammatoriska svar.
    5. Interleukin 10: Främjar fagocytiska upptag och Th2 svar men undertrycker antigen presentation och Th1 proinflammatoriska svar.
    6. Monocyte kemotaxi protein-1 (även känd som CCL2): Rekryterar monocyter, minnesceller T och dendritiska celler till webbplatser av vävnadsskada och infektion.
    7. KC (CXCL1): Producerad av makrofager och endotelceller. Musen KC är en potent neutrofila lockmedel och aktivator.
    8. RANTES: En monocyt chemoattractant. Det kan chemoattract ostimulerade CD4 + / CD45RO + minne T-celler och stimuleras CD4 + och CD8 + T celler med na ve och fenotyper minne.
    9. Interferon-γ: utsöndras av Th1 celler, cytotoxiska T-celler, dendritiska celler och naturliga mördarceller (NK) celler. Ökar antigen presentation och lytisk aktivitet i makrofager och dämpar Th2 celler aktivitet. Främjar vidhäftning och bindande krävs för leukocytmigration och främjar NK cells aktivitet.
    10. Hög rörlighet grupp B-1 protein: I monocyter är en nukleär faktor kappa B aktivator genom att binda till det cellulära receptorn för slutet förväg glykation produkter (RAGE), aktivera frisättning av proinflammatoriska mediatorer i den sena fasen av sepsis.
  3. Myeloperoxidas beslutsamhet i organ som ett mått på neutrofil infiltration. Myeloperoxidas (MPO) är ett peroxidasenzym mest högst närvarande i neutrofila granulocyter. Det är ett lysosomalt protein lagras i azurophilic korn av neutrofila granulocyter. MPO har en heme pigment, som orsakar dess gröna färg i sekret rik på neutrofiler, såsom pus och vissa former av slem.
  4. Bakterier belastning i organ och blodet, mäta eftersom antalet kolonibildande enheter per ml.

3. Representativa resultat

CLP Förfarandet inledningsvis göras i C57BL / 6 musstam. Vi testade flera parametrar att modulera svårighetsgraden av sepsis genom att ändra längden på ligation och tjockleken på nålen som visas i figur 1 och 2. Bland dessa två faktorer verkar längd ligering att vara mer effektiv än tjockleken på nålen för att ändra procent överlevnad. Som visas i figur 1, provocerar öka längden på ligation med mer än 1 cm en ökning av dödligheten med 100% jämfört med möss som har en ligation på ≤ 1 cm. Öka tjockleken på nålen även minskat procent överlevnad från 100% (med en 22g nål) till 55% (med en 19G nål) med två punkteringar. Vi testade också effekten av CLP på C57BL / 6 och 129SvJ möss för att avgöra om olika musstammar visa liknande eller olika känslighet för CLP-inducerad sepsis. Figur 3 visar att under samma förutsättningar, var 129SvJ möss mer mottagliga för infektioner än C57BL / 6, framgår av en ökad procent dödlighet.

Figur 1
Figur 1. Effekt av ligation längd blindtarmen i djur överlevnad. CLP utfördes i C57BL / 6 möss med två olika längder cecal ligatur. Det enda parameter påverkar dramatiskt djur överlevnad eftersom alla djur i gruppen med en ligatur område längre än 1 cm dog i mindre än 3 dagar jämfört med en grupp djur som har en ligation yta på 1 cm ca. (N = 8).

Figur 2
Figur 2. Inverkan av nål tjocklek på överlevnad. CLP utfördes i C57BL / 6 möss med två olika nålar storlekar, 19g och 22g. Möss med blindtarmen perforerade med en 19G nål visade en 55-60% överlevnad. Däremot visade möss med blindtarmen perforerade med en 22g nål 100% överlevnad trots att de upplevde typiska symtom på inflammation under de första 3-4 dagarna, som försvann efter 4 dagar (n = 8).

Figur 3
Figur 3. Jämförelse av sepsis mottaglighet mellan två olika musstammar. CLP-modellen utfördes i 129SvJ och C57BL / 6 på samma villkor. I slutet av utvärderingen perioden procent överlevnad 129SvJ stammen var 25% mindre än i C57BL / 6 stam, vilket tyder på en högre känslighet för inflammation framkallas av polymikrobiella infektion. (N = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här visar vi i detalj hur du utför CLP-modell i möss och modulera svårighetsgrad.

Jämfört med andra djurmodeller av sepsis kan CLP utföras i något musstam av olika ålder och kön. Det är ett relativt enkelt och billigt kirurgiska ingrepp. I denna modell har den svårighetsgrad en direkt inverkan på andelen överlevnad. Längden på ligation, tjockleken på nålen och antalet punkteringar är parametrar som kan styras för att modulera svårighetsgrad / dödlighet i CLP. Därför att få dramatiska förändringar i CLP svårighetsgrad, kan användaren ändra längden på ligation medan mindre ändring i svårighetsgrad kan införas genom att justera tjockleken på nålen.

Andra viktiga parametrar som skulle kunna införa en betydande variation i CLP-resultaten är musstam 6,7, kön 8 och djurets ålder 9. I detta avseende visar vi att olika musstammar visa olika mottaglighet förfarandet när den utförs på samma villkor. I själva verket har skillnaderna i plasma cytokin och vävnadsskada upptäckts mellan olika musstammar 10-12. Införande av vätsketillförsel och analgetiska administration är faktorer som kan införa betydande variation i CLP-modellen. Till exempel ökar vätsketillförsel överlevnad möjligen genom att minska produktionen av tidiga proinflammatoriska cytokiner 11, 13, 14 därmed dölja effekterna av potentiella terapeutiska ingrepp. Däremot kan narkotiska analgetika undertrycka andning och rörelseorgan i djuret och provocera en irreversibel effekt samband med sepsis. Deras användning kan därför påverka överlevnad och immunceller funktion 15.

Sammanfattningsvis, vid verkställandet av CLP-modellen alla dessa villkor och tekniska parametrar måste övervägas noga för att få reproducerbara och konsekventa resultat. Därför är en djup kunskap och behärska förfarandet absolut behövs för att utföra CLP-modellen exakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från Pennsylvania Department of Health.
Dr Miguel Garcia Toscano var en forskarassistent vid Temple University, finansierat av Alfonso Martin Escudero stiftelsen under denna studie.
Vi vill tacka Iliya Yordanov och Kevin Kotredes för framställning av videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
  2. Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
  3. Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
  4. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
  5. Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
  6. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
  7. De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
  8. Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
  9. Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
  10. Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
  11. Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
  12. Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
  13. Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
  14. Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
  15. Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).

Comments

7 Comments

  1. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:03 AM
  2. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:27 AM
  3. Hello Colleges, we are very interested in your model of abdominal sepsis, we would very much like to ask you a complete description, unfortunately we can not pay money for it. We'll be very grateful, and try using it to make a drop in the ocean of the world science.

    Reply
    Posted by: Roma Z.
    November 26, 2013 - 3:33 PM
  4. I'll be happy to send you the complete description. please provide me an e-mail address where to send the information.
    Ana

    Reply
    Posted by: ana g.
    November 26, 2013 - 4:43 PM
  5. medroma03@gmail.com I am very grateful to you and I promise you that all this will not be publicized.

    Reply
    Posted by: Roma Z.
    November 27, 2013 - 12:21 AM
  6. dear sir:I am a student of zhejiang University of China,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!
    my e-mail:li.renjun@yahoo.com

    Reply
    Posted by: li r.
    January 12, 2014 - 9:42 PM
  7. Dear sir:I am a student from Jiangsu University. Recently we will do some experiment in this CLP model. however, we all don't understand the detail about the procedure. So when we search your video, we are very excited. Would you please send it to us,because we can't afford it? Thank you very much! my e-mail: 191853184@qq.com.

    Reply
    Posted by: Yuyun X.
    January 14, 2014 - 2:26 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics