उच्च आण्विक वजन डीएनए के माइक्रोबियल मैट से निकालना

Biology

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Summary

हम hypersaline माइक्रोबियल मैट से उच्च आणविक भार डीएनए निकालने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. माइक्रोबियल कोशिकाओं चटाई मैट्रिक्स से अलग कर रहे हैं डीएनए निष्कर्षण और शुद्धि के लिए पहले. यह सांद्रता, गुणवत्ता, और डीएनए के आकार को बढ़ाता है. प्रोटोकॉल अन्य दुर्दम्य नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Bey, B. S., Fichot, E. B., Norman, R. S. Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats. J. Vis. Exp. (53), e2887, doi:10.3791/2887 (2011).

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Abstract

सफल और सटीक metagenomic डेटा का विश्लेषण और व्याख्या उच्च गुणवत्ता, उच्च आणविक वजन (HMW) समुदाय डीएनए के कुशल निकासी पर निर्भर है. हालांकि, पर्यावरण चटाई नमूने अक्सर उच्च गुणवत्ता, HMW डीएनए के बड़े सांद्रता प्राप्त करने में कठिनाइयों मुद्रा. Hypersaline माइक्रोबियल मैट कोशिकी polymeric पदार्थों की उच्च मात्रा (ईपीएस) 1 और लवण कि निकाले डीएनए के बहाव के अनुप्रयोगों को बाधित कर सकते हैं होते हैं. सीधी और कठोर तरीकों अक्सर दुर्दम्य नमूने से डीएनए निष्कर्षण में किया जाता है. इन विधियों आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है क्योंकि मैट, चिपकने वाला एक मैट्रिक्स में ईपीएस प्रत्यक्ष lysis के दौरान 2,3 डीएनए बांध. कठोर निकासी तरीकों का एक परिणाम के के रूप में हो जाता है डीएनए छोटे 4,5,6 आकार में खंडित.

डीएनए इस तरह बड़े सम्मिलित करने के लिए वेक्टर क्लोनिंग के लिए अनुपयुक्त हो जाता है. आदेश में इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, हम अच्छा और hypersaline माइक्रोबियल मैट से गुणवत्ता और मात्रा के HMW डीएनए निकालने के लिए एक बेहतर कार्यप्रणाली की रिपोर्ट. हम एक अप्रत्यक्ष सम्मिश्रण और अंतर centrifugation के माध्यम से पृष्ठभूमि चटाई मैट्रिक्स से माइक्रोबियल कोशिकाओं की जुदाई से जुड़े विधि कार्यरत हैं. यांत्रिक और रासायनिक प्रक्रियाओं का एक संयोजन निकालने और निकाले माइक्रोबियल कोशिकाओं से डीएनए को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमारी प्रोटोकॉल एक 1.6 260/280 अनुपात के साथ चटाई नमूना के प्रति ग्राम HMW डीएनए (35-50 केबी) के लगभग 2 μg पैदावार . इसके अलावा, rRNA जीन -16 7 का प्रवर्धन पता चलता है कि प्रोटोकॉल के लिए कम से कम या contaminants के किसी भी निरोधात्मक प्रभाव को खत्म करने में सक्षम है . हमारे परिणाम कार्यात्मक metagenomic अध्ययन के लिए माइक्रोबियल मैट से HMW डीएनए के निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त पद्धति प्रदान करते हैं और अन्य पर्यावरणीय नमूने से डीएनए निष्कर्षण चुनौती दे रहा है के लिए लागू किया जा सकता है.

Protocol

1. माइक्रोबियल सेल निष्कर्षण:

  1. एक बाँझ पीस मूसल के साथ अच्छी तरह से मिश्रण से माइक्रोबियल मैट homogenize. लगभग Waring ब्लेंडर के बाँझ कंटेनर में homogenized चटाई सामग्री के सभी 30 g (गीला वजन), 1 एम NaCl (या एक उपयोग में नमूना के लिए विशिष्ट एकाग्रता) के 100 एमएल के बारे में जोड़ने के लिए, और साथ में 1 मिनट के लिए मध्यम गति से तीन गुना मिश्रण प्लेस 1 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में आंतरायिक ठंडा. एक 250 एमएल अपकेंद्रित्र बोतल में घोल स्थानांतरण और 1 एम NaCl के साथ शेष खाली मात्रा भरने. Autoclaved डि पानी में NaCl समाधान तैयार है और यह बाँझ फिल्टर.
  2. इसके अलावा (150 आरपीएम) मिलाते हुए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक vortexer (भंवर - जिनी 2 आर) का उपयोग करके मैट्रिक्स से माइक्रोबियल कोशिकाओं बेदखल .
  3. 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कम गति (500x छ) पर अपकेंद्रित्र धीरे से एक फ्लास्क में तलछट के लिए न्यूनतम अशांति के साथ सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
  4. Pelleted तलछट का प्रयोग, ताजा NaCl 1.3 कदम के अंत में प्रत्येक तलछट गोली के अलावा के साथ सम्मिश्रण और कदम 1.2 और 1.3 चार अतिरिक्त बार दोहराएँ. प्रत्येक NaCl निष्कर्षण से सतह पर तैरनेवाला एक ताजा फ्लास्क में स्थानांतरित किया है.
  5. 5 सेल extractions और 200 एमएल के 15 मिनट के लिए उच्च गति (25,000 XG) में aliquots में अपकेंद्रित्र से 4 बजे supernatants कम्बाइन डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 2% सोडियम hexametaphosphate के 10 एमएल में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend, छर्रों गठबंधन और 2% सोडियम hexametaphosphate के साथ मात्रा 200 एमएल के लिए. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर (150 आरपीएम) मिलाते द्वारा कोशिकाओं को धो लें. इस कदम के अंत में आप केवल कक्षों की एक ट्यूब के लिए अगले कदम के लिए आगे बढ़ना चाहिए.
  6. 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए उच्च गति (25,000 XG) में अपकेंद्रित्र ते (50 मिमी EDTA) 200 एमएल में सतह पर तैरनेवाला, resuspend सेल गोली त्यागें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर (150 आरपीएम) मिलाते द्वारा कोशिकाओं को धोने.
  7. 4 में 15 मिनट के लिए उच्च गति (25,000 XG) अपकेंद्रित्र ° ° जब तक सी सी, सतह पर तैरनेवाला, 15 एमएल ते (10 मिमी EDTA) में resuspend त्यागें, और दुकान -80 पर 200 μL aliquots डीएनए extractions के लिए की जरूरत है.

2. डीएनए निष्कर्षण और शोधन:

  1. 200 μL 5 एम NaCl, 200 μL 10% एसडीएस, और 100 μL 14.3 एम 200 μL माइक्रोबियल सेल विभाज्य β-mercaptoethanol जोड़ें. Inverting 4-6 बार द्वारा धीरे मिलाएं.
  2. विषय 3 2 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में विगलन द्वारा बाद मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में submerging द्वारा फ्रीज पिघलना के दौर मिश्रण. 10 मिनट के लिए अंतिम विगलन बढ़ाएँ.
  3. 200 μL 5 एम पोटेशियम (5.5 पीएच) एसीटेट और 10 मिनट के लिए बर्फ पर स्थान जोड़ें. 4 में 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और एक नया एक व्यापक बोर विंदुक टिप का उपयोग ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. 1hr के लिए एक और 37 में सेते सी ° RNase 3 μL जोड़ें.
  4. क्लोरोफॉर्म की बराबर मात्रा में जोड़ें, उलटा द्वारा संक्षिप्त हिला, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. सावधानी से एक नया एक व्यापक बोर विंदुक टिप का उपयोग कर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के ऊपर परत को हस्तांतरण. सफेद अंतरफलक ऊपर और नीचे परतों के बीच स्थित परत pipetting से बचें. क्लोरोफॉर्म - निष्कर्षण प्रक्रिया दोहराएँ.
  6. ठंडा के एक बराबर मात्रा (-20 पर डिग्री सेल्सियस) से सतह पर तैरनेवाला सेते हैं और बर्फ पर 30 मिनट के लिए वेग डीएनए isopropanol. जोड़ें
  7. 4 में 10 मिनट के लिए अधिकतम गति (20,800 XG) में अपकेंद्रित्र ° सी गोली डीएनए के लिए.
  8. ठंडा के 1 एमएल 70% इथेनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस पर) के साथ सतह पर तैरनेवाला और धोने डीएनए गोली त्यागें.
  9. 4 में 10 मिनट के लिए अधिकतम गति ° सी (20,800 XG) में अपकेंद्रित्र है, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल धोने, और सूखी हवा डीएनए गोली दोहराने. 70% इथेनॉल धोने दोहराएँ.
  10. 25 μL ते (10 मिमी EDTA) में Resuspend डीएनए, 65 में गर्म ° सी के 5 मिनट के लिए, एक ट्यूब में गठबंधन अगर एकाधिक ट्यूबों का इस्तेमाल किया गया है, और ते के साथ 500 μL मात्रा मेकअप.
  11. जोड़ें 500 μL बर्फ ठंडा (या 4 डिग्री सेल्सियस) 20% polyethylene (खूंटी) glycol (1.2 एम NaCl में तैयार). गोली डीएनए उलटा, 10 मिनट, और अपकेंद्रित्र के लिए बर्फ पर 4 बजे 10 मिनट के लिए अधिकतम गति पर सेते ° सी द्वारा धीरे मिश्रण. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने और ठंडा 70% इथेनॉल, 10 मिनट के लिए हवा शुष्क 1 एमएल के साथ pelleted डीएनए धोने, और 30-50 μL ते या आणविक ग्रेड पानी में resuspend. वार्मिंग द्वारा 65 में डीएनए के resuspension की सुविधा ° -80 पर 5 मिनट और स्टोर डीएनए के लिए सी डिग्री सेल्सियस

3. डीएनए पवित्रता, एकाग्रता, और आकार निर्धारण:

  1. 260/280 एक और एक 260/230 Nanodrop 1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या किसी अन्य उपयुक्त इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग अनुपात को मापने के द्वारा डीएनए की गुणवत्ता का निर्धारण करते हैं.
  2. डीएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार dsDNA परख किट क्वांट इसे का उपयोग एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
  3. डीएनए नाड़ी क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर आकार का निर्धारण करते हैं. तैयार 0.5X TBE के साथ 1% agarose जेल और CHEF मैपर XA सिस्टम पर निम्न पैरामीटर का उपयोग करें, 0.35 एस के प्रारंभिक स्विच समय, 7.67 के अंतिम स्विच समय, और 120 ° पर 6.0 वी सेमी / ढाल के लिए कोण शामिल एक रैखिक rकारक amping. 1 x SYBR ग्रीन मैं के साथ 30 मिनट के लिए जेल में दाग. 700-1000 एनजी कुल डीएनए के बीच जेल पर लोड. चित्र देखें. पूरा प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त रूप के लिए 3.

प्रतिनिधि परिणाम:

सेल निष्कर्षण:

अनुक्रमिक माइक्रोबियल सेल अर्क (supernatants) से पता चला है कि अर्क के turbidity extractions वृद्धि की संख्या के रूप में घट जाती है. यह प्रत्येक लगातार सेल निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं की संख्या में कमी से पता चलता है. यहाँ ध्यान दें महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक अतिरिक्त सेल निष्कर्षण कदम के रूप में contaminant के परिचय के लिए अवसर प्रदान करता है, सेल extractions की संख्या कम से कम हो ताकि अंतिम सेल गोली समग्र माइक्रोबियल समुदाय के प्रतिनिधि है चाहिए. संदूषण के अन्य स्रोतों पर्याप्त प्रयोगशाला बाँझ तकनीक अपनाने के द्वारा नियंत्रित किया गया. उदाहरण के लिए, समाधान autoclaved डि पानी में तैयार किए गए और निष्फल फिल्टर. कंटेनरों निष्फल रहे थे शराब के साथ autoclaved, और यूवी प्रकाश और पराबैंगनी crosslinker के तहत इलाज किया.

डीएनए एकाग्रता और गुणवत्ता दृढ़ संकल्प:

प्रोटोकॉल चटाई नमूना के प्रति ग्राम HMW डीएनए (35-50 केबी) (4 छवि) के लगभग 2 μg एक 1.6 260/280 अनुपात के साथ, झुकेंगे और 0.7 के 260/230 अनुपात (तालिका 1) . हालांकि एक 260/230 अनुपात कम हो, -16 rRNA जीन एक अलग 7 अध्ययन में मनाया गया की पीसीआर प्रवर्धन जैसे बहाव आणविक आधारित आवेदन का कोई निषेध दिखाई दिया. यह महत्वपूर्ण है hypersaline मैट संदूषण के दो मुख्य स्रोत है कि डीएनए से ध्यान दें, EPS और लवण. इसलिए यह संभव है कि इन contaminants के निशान जबरदस्त डाउन स्ट्रीम अनुप्रयोगों पर उनके प्रभाव को कम करने के प्रयासों के बावजूद एक 260/230 अनुपात प्रभावित हो सकता है.

आकार दृढ़ संकल्प डीएनए:

पल्स क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन आंतरायिक दिशात्मक एक डीएनए स्मियर में जिसके परिणामस्वरूप आंकड़ा 3 में दिखाया गया है के रूप में स्विच के साथ एक pulsating वर्तमान प्रवाह को रोजगार. हमारी लगभग 35-50 केबी की HMW डीएनए प्रोटोकॉल झुकेंगे. जबकि कुछ डीएनए आकार 30 केबी की तुलना में छोटे हो सकता है, यह महत्वपूर्ण है के लिए 35 केबी ऊपर धब्बा दिया है कि fosmid क्लोनिंग ~ 40 केबी डीएनए आवेषण की आवश्यकता है और बड़ा डीएनए टुकड़े बरकरार biosynthetic रास्ते के लिए अधिक से अधिक पहुँच प्रदान का हिस्सा है. हमारे अध्ययन में, 35 केबी ऊपर डीएनए स्मियर excised और बड़े सम्मिलित करने के लिए वेक्टर क्लोनिंग और अन्य आणविक अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध.

चित्रा 1
चित्रा 1. Hypersaline माइक्रोबियल चटाई नमूने (बड़ा तालाब) Eleuthera, बहामा साइट पर स्थित है .

चित्रा 2
चित्रा 2. Hypersaline माइक्रोबियल इस अध्ययन में इस्तेमाल चटाई के पार अनुभाग. माइक्रोबियल चटाई एक hypersaline Eleuthera, बहामा पर स्थित तालाब से प्राप्त किया गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. माइक्रोबियल सेल निष्कर्षण, सेल lysis, निष्कर्षण, और metagenomic डीएनए की शुद्धि में शामिल प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. एक बड़ी छवि को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4 निकाली पल्स क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग डीएनए की आण्विक वजन लक्षण वर्णन . लेन एम HMW मार्कर है, और गलियों 1 और 2 metagenomic Eleuthera hypersaline ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग कर चटाई से निकाले डीएनए की प्रतिकृति हैं.

निष्कर्षण विधि एकाग्रता / एनजी जी एक 260/280 एक 260/230
खूंटी एक प्रतिनिधि 1806.1 1.64 0.76
दो प्रतिनिधि 2010.8 1.61 0.75

तालिका 1. डीएनए की एकाग्रता और गुणवत्ता के मापन माइक्रोबियल hypersaline चटाई से निकाली गई.

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Discussion

यह देखते हुए कि जटिल और उच्च विविध माइक्रोबियल चटाई नमूनों से कुल सेल हटाने व्यावहारिक नहीं है, प्राथमिक चिंता का विषय है कितनी अच्छी तरह निकाली गई कोशिकाओं समग्र माइक्रोबियल चटाई समुदाय का प्रतिनिधित्व करते हैं. पिछले एक अध्ययन में, पीसीआर - DGGE माइक्रोबियल -16 rRNA जीन के विश्लेषण से पता चला है कि पांच सेल हटाने इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कदम कोशिकाओं है कि समग्र माइक्रोबियल चटाई 7 समुदाय के प्रतिनिधि हैं अर्क. सेल निष्कर्षण की वास्तविक संख्या के लिए एक सेल गोली है कि समग्र माइक्रोबियल समुदाय के प्रतिनिधि की संभावना नमूना प्रकार पर निर्भर बदल जाएगा प्रदान करने के लिए आवश्यक कदम. विभिन्न नमूनों के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल के विकास के लिए छोटे पैमाने पर एक पायलट अध्ययन माइक्रोबियल बरामद समृद्धि के अनुभवजन्य परीक्षण जिसमें प्रत्येक सेल निष्कर्षण कदम के बाद मूल समुदाय की समृद्धि की तुलना में है के लिए सिफारिश की है.

Fosmid क्लोनिंग क्लोन पुस्तकालय 8 निर्माण के लिए 35-40 केबी की HWM डीएनए की आवश्यकता है. हमारी प्रोटोकॉल 35-50 केबी (4 छवि) से लेकर आकारों के साथ डीएनए झुकेंगे था और सफलतापूर्वक एक fosmid आधारित metagenomic लायब्रेरी (अप्रकाशित परिणाम) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. अन्य ईपीएस उत्पादन समुद्री बैक्टीरिया से डीएनए निष्कर्षण में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल ~ 23 केबी 4 झुकेंगे. कार्यात्मक metagenomic अध्ययन में, बड़े डीएनए टुकड़े biosynthetic रास्ते के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह कार्यात्मक 9,10 व्यवहार के लिए एन्कोडिंग जीन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अधिक से अधिक उपयोग प्रदान करते हैं. इस प्रकार, HMW डीएनए metagenomic अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. बड़े पर्यावरणीय नमूनों से सम्मिलित करने के लिए metagenomic पुस्तकालयों उत्पन्न खोज उपन्यास biosynthetic मार्ग है कि उपन्यास जीन की खोज करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के अवसरों में वृद्धि होगी. इस प्रोटोकॉल के लिए अन्य दुर्दम्य पर्यावरणीय नमूनों से डीएनए निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पर्यावरण जीनोमिक्स कार्यक्रम (अनुदान सं एफई-0,723,707) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M3148
Polyethylene glycol 8000 Promega Corp. V3011 20% in 1.2 M NaCl
Potassium acetate Fisher Scientific Fisher Scientific
Quant-iT dsDNA Assay kit Invitrogen Q33130
RNase Epicentre Biotechnologies MRNA092
Sodium Chloride VWR BDH8014 Appropriate conc.
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher Scientific 03-500-509 10% in water
sodium hexametaphosphate EMD Millipore SX0583-3 2% in water
TBE Fisher Scientific BP1333-1
CHEF Mapper XA System Bio-Rad 170-3670
NanoDrop 1000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-1000
Vortexer Scientific Industries Inc.
Ultraviolet Crosslinker UVP Inc.
Waring blender Waring Laboratory LB10S

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References

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