संक्रामक वायरस के फील्ड एकत्र मच्छरों से वेरो सेल संस्कृति परख द्वारा जांच

Immunology and Infection

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Summary

हम प्रक्रिया के लिए एक विधि का वर्णन है और स्क्रीन क्षेत्र एकत्र वायरस का एक विविधता के लिए वेरो सेल संस्कृति परख द्वारा मच्छरों. इस तकनीक काम करके, हम कनेक्टिकट में एकत्र मच्छरों में 4 वर्गीकरण परिवारों से 9 विभिन्न वायरस का पता लगाया है.

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Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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Abstract

मच्छरों पश्चिम नील नदी वायरस, डेंगू वायरस, और chickungunya वायरस जैसे महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ों सहित अलग वायरस के एक संख्या संचारित. उनके स्थानिकमारी वाले श्रेणियों में इन वायरस से कई तेज है और नए क्षेत्रों के लिए विस्तारित, इन धमकियों का जवाब प्रभावी निगरानी और नियंत्रण कार्यक्रम की जरूरत महसूस. एक वायरस गतिविधि पर नजर रखने की रणनीति के स्थानिकमारी वाले साइटों से मच्छरों की बड़ी संख्या का संग्रह शामिल है और उन्हें वायरल संक्रमण के लिए परीक्षण. इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे संभाल करने के लिए, प्रक्रिया, और स्क्रीन वेरो सेल संस्कृति परख द्वारा संक्रामक वायरस के लिए मच्छरों क्षेत्र एकत्र. मच्छरों जाल स्थान और प्रजातियों के द्वारा हल कर रहे हैं, और ≤ 50 व्यक्तियों युक्त पूल में बांटा है. जमा नमूनों बफर मिल एक मिक्सर और जलीय चरण मिला हुआ वेरो सेल संस्कृतियों (E6 क्लोन) पर inoculated है का उपयोग खारा में homogenized हैं. सेल संस्कृतियों दिनों 3-7 के बाद टीका और किसी भी वायरस सेल संस्कृति में हो उपयुक्त निदान assays के द्वारा पहचाने जाते हैं cytopathic प्रभाव के लिए निगरानी कर रहे हैं. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम कनेक्टिकट, संयुक्त राज्य अमेरिका में एकत्र मच्छरों से 9 विभिन्न वायरस अलग है, और इनमें से 5 के लिए मानव रोग का कारण जाना जाता है. इन वायरस के तीन (पश्चिम नील नदी वायरस, पोटोसी वायरस, और La Crosse वायरस) उत्तर अमेरिका या 1999 के बाद से नई इंग्लैंड क्षेत्र के लिए नए रिकॉर्ड का प्रतिनिधित्व करते हैं. वायरस की एक विस्तृत विविधता का पता लगाने की क्षमता की निगरानी दोनों स्थापित और मच्छर आबादी में नए उभरते वायरस के लिए महत्वपूर्ण है.

Protocol

1. मच्छर छँटाई और पहचान

  1. निम्नलिखित प्रक्रियाओं एक खुली प्रयोगशाला बेंच पर एक समर्पित जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL-2) कर्मचारियों के साथ जो रहते मच्छरों के साथ काम करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है द्वारा प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं. एक "कोल्ड चेन" प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा है.
  2. 5 मिनट के लिए -20 ° फ्रीजर में मच्छर संग्रह बैग रखकर वयस्क मच्छरों को जीने anesthetize. स्थानांतरण संग्रह एक अछूता सूखी बर्फ युक्त कंटेनर बैग. ढक्कन बंद करें और 1-3 मिनट के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के लिए मच्छरों को बेनकाब करने के लिए पूरा नीचे दस्तक सुनिश्चित.
  3. एक पूर्व ठंडा सूखी बर्फ के एक बिस्तर पर रखा पैन anesthetized मच्छरों पर ठोकर. अलग व्यक्ति महिला ठीक संदंश और प्लास्टिक भाग कप में जगह का उपयोग कर मच्छरों. गीला बर्फ पर ढक्कन और जगह कप के साथ कवर.
  4. वर्णनात्मक एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप (10-60x ज़ूम) की सहायता से बाहरी मच्छर आकारिकी पर आधारित वर्गीकरण कुंजियों का उपयोग प्रजातियों के लिए मच्छरों को पहचानें एक इलेक्ट्रॉनिक चिल मेज पर मुहिम शुरू की.
  5. ≤ 2 एमएल स्नैप - टोपी तांबे बी.बी. युक्त शीशियों में 50 व्यक्तियों के पूल में मच्छर प्रजातियों की पहचान का मिश्रण. शीशियों एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल रहे हैं.
  6. सभी मच्छरों की पहचान के बाद, शीशियों लेबल बैग में रखा जाता है और सूखी बर्फ युक्त एक स्टायरोफोम कूलर में आयोजित.
  7. -80 ° जब तक फ्रीजर सी वायरस परीक्षण में मच्छर पूल स्टोर.

2. जैवसुरक्षा मच्छरों से वायरस को अलग विचार

  1. निम्न कार्यविधियों जैव सुरक्षा स्तर 3 (BSL-3) कर्मचारियों के साथ जो 1 रोकथाम के इस स्तर पर काम करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है के द्वारा प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं. प्रयोगशाला सुविधाओं, उपकरण, प्रक्रियाओं और प्रथाओं संस्थागत, राज्य और संघीय निरीक्षण और निरीक्षण के अधीन हैं. उचित प्रशिक्षण और निम्नलिखित प्रोटोकॉल के प्रयास करने से पहले अनुमोदन की शोध करो.
  2. प्रत्येक डिस्पोजेबल गाउन, दस्ताने, चेहरा ढाल, और respirators के रूप में ऐसी प्रक्रिया के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें.
  3. 70% शराब के साथ पहले और बाद में पूरा प्रक्रियाओं काम की सतहों कीटाणुरहित.
  4. सेल संस्कृतियों और संभावित संक्रामक सामग्री द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में नियंत्रित किया जाता है.
  5. मच्छर पूल एक मिक्सर चक्की है कि एक BSC अंदर रखा है में homogenized हैं.
  6. मच्छर homogenates एक एयरोसोल तंग microcentrifuge में centrifuged हैं. यदि इस कार्यविधि को एक BSC के भीतर नहीं किया जा सकता है, ऑपरेटर एक श्वासयंत्र पहनने जब संचालन और पुन: प्राप्त करने से नमूने अपकेंद्रित्र चाहिए.
  7. Pipets और pipet सुझावों बीएससी (जैव सुरक्षा कैबिनेट) में सामग्री प्रहस्तन 10% autoclaving के लिए पहले ब्लीच में भिगो कर रहे हैं. सभी प्रयोगशाला अपशिष्ट निपटान से पहले autoclaving द्वारा decontaminated है.

3. वेरो कोशिकाओं की तैयारी

  1. बेकार बीकर में मिला हुआ वेरो कोशिकाओं (E6 क्लोन) ब्लीच युक्त बड़े टिशू कल्चर फ्लास्क (175 2 सेमी) से छानना संस्कृति मीडिया.
  2. पीबीएस के 5 एमएल विभाज्य और कोशिकाओं की परत पर ज़ुल्फ़ और कुप्पी के पक्ष अच्छी तरह से पूरे monolayer कवर सुनिश्चित करने के साथ जोड़कर वेरो कोशिकाओं धो लें.
  3. छानना बेकार बीकर में पीबीएस.
  4. Trypsin - EDTA की 2.5 एमएल और अच्छी तरह से पूरे monolayer कवर सुनिश्चित करने के कोशिकाओं की परत से अधिक ज़ुल्फ़ जोड़ें.
  5. 5 मिनट के लिए 37 बजे इनक्यूबेटर में फ्लास्क ° सी, 5% सीओ 2 सेते हैं.
  6. धीरे हिला और ज़ुल्फ़ कुप्पी के नीचे सतह से कोशिकाओं को हटाने. कोशिकाओं से आसानी से स्लाइड चाहिए, एक अतिरिक्त 1-5 मिनट सेते अगर कोशिकाओं को आसानी से स्लाइड नहीं.
  7. मिनिमल आवश्यक मीडिया के 5 एमएल (सदस्य), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और एक सीरम विज्ञानी pipet का उपयोग pipet जोड़ें ऊपर और नीचे 10-20 बार कोशिकाओं के clumps को तोड़ने.
  8. 22.5 एमएल की कुल मात्रा के लिए एक अतिरिक्त 15 एमएल सदस्य, 5% FBS जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
  9. 40 छोटे टिशू कल्चर बोतल (25 2 सेमी) दो रैक (20 बोतल / रैक) ​​में ईमानदार प्लेस.
  10. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर बोतल युक्त रैक प्लेस और कुप्पी टोपियां निकालने के लिए, सीधे बोतल के सामने रखकर टोपियां.
  11. प्रत्येक एक सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग फ्लास्क में सदस्य, 5% FBS की 4 एमएल बांटना.
  12. प्रत्येक फ्लास्क (~ 01:06 बंटवारे अनुपात) बदलें फ्लास्क कैप में 0.5 एमएल निलंबित कोशिकाओं बग़ैर.
  13. जोड़ें सदस्य के 50 एमएल, 5% FBS वापस मूल बड़े टिशू कल्चर शेष सेल निलंबन (~ 2.5 MLS) युक्त कुप्पी और इनक्यूबेटर के लिए फ्लास्क वापसी. एक ही बड़े टिशू कल्चर फ्लास्क हो सकता है 5 मार्ग को फिर से इस्तेमाल किया और तब एक नया फ्लास्क सेट अप के लिए यह जगह चाहिए.
  14. प्लेस छोटे टिशू कल्चर ट्रे पर ढेर में बोतल. ट्रे भंवर लगता है कि मीडिया समान flaks के नीचे शामिल है.
  15. 37 में इनक्यूबेटर में छोटी बोतल रखें डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 80-90% मिला हुआ तक रातोंरात बढ़ने.

4. मच्छर पूल तैयार करना

  1. परीक्षण प्रक्रिया के दौरान मच्छर पूल ठंड रखें. पूर्व - ठंडा का उपयोग करेंफ्रीजर रैक और कैसेट - मिश्रक चक्की, ठंडा अभिकर्मकों, और एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र जब मच्छर पूल प्रसंस्करण.
  2. प्लेस ट्यूबों एक फ्रीजर पूर्व ठंडा रैक में मच्छरों से युक्त और 1 जोड़ने - मच्छरों के प्रत्येक ट्यूब 1.5 एमएल पीबीएस जी.
  3. मिक्सर - चक्की कैसेट फ्रीजर से पुनर्प्राप्त करें. प्रत्येक कैसेट में 24 ट्यूब प्लेस और फिर मिश्रक चक्की में सुरक्षित है.
  4. 25 चक्र / दूसरे पर 4 मिनट के लिए नमूने homogenize. मिश्रक चक्की उच्च वेग में और प्रत्येक ट्यूब के अंदर एक धातु बी.बी. ट्यूबों हिलाता मच्छर ऊतक बाधित.
  5. +७,००० Rpm पर 6 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
  6. फ्रीजर रैक में वापस प्लेस ट्यूबों जब तक वेरो कोशिकाओं में inoculated.

5. मच्छर पूल homogenates साथ वेरो कोशिकाओं का टीका

  1. प्रत्येक श्रृंखला से उलटा माइक्रोस्कोप के तहत कम से कम एक टिशू कल्चर फ्लास्क के लिए पर्याप्त confluency और सेल स्वास्थ्य आश्वासन की जाँच करें, कवरेज के बारे में 80-90% की उम्मीद है.
  2. 20 और प्रत्येक मच्छर पूल से इसी परिग्रहण संख्या के साथ रैक लेबल बोतल में छोटे टिशू कल्चर बोतल लाइन.
  3. कैप और छानना बेकार बीकर में ऊतक संस्कृति बोतल से मीडिया के सबसे ढीला. पूरी तरह से कोट सेल monolayer फ्लास्क में पर्याप्त मीडिया छोड़ दें.
  4. सतह पर तैरनेवाला के प्रत्येक संसाधित इसी टिशू कल्चर फ्लास्क में मच्छर पूल से विभाज्य 100μL.
  5. बदलें और संस्कृति फ्लास्क टोपी कस.
  6. संस्कृति बोतल हिलनेवाला पर फ्लैट 35-40 rpm पर 5 मिनट (कमरे के तापमान) के लिए निर्धारित करना.
  7. और BSC में रैक जगह में ईमानदार स्थिति 20 टिशू कल्चर बोतल लौटें.
  8. Uncapping एक समय में 3 टिशू कल्चर बोतल, प्रत्येक फ्लास्क में 4 एमएल विकास मीडिया बग़ैर एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, टोपियां की जगह.
  9. यकीन है कि विंदुक टिप संस्कृति फ्लास्क गर्दन या होंठ से संपर्क नहीं करता है. विंदुक युक्तियाँ आवश्यक के रूप में बदलें यदि संपर्क कुप्पी के साथ बनाया है.
  10. 37 में सेते टिशू कल्चर बोतल ° सी, 5% सीओ 2.

6. वायरस के विकास के लिए वेरो कोशिकाओं स्क्रीनिंग

  1. 3-7 के बाद टीका दिनों से स्क्रीन वायरल संक्रमण के लक्षण, cytopathic प्रभाव (CPE) के लिए टिशू कल्चर बोतल, inoculated.
  2. दिखने में बोतल झुकने द्वारा CPE और या संदूषण / सेल संस्कृतियों और निरीक्षण है कि मीडिया की जांच फ्लास्क के नीचे पूल. मीडिया बादल दिखाई के रूप में कोशिकाओं CPE दौरान खराब या खमीर, कवक, या बैक्टीरियल संदूषण के विकास के कारण.
  3. सेल संस्कृतियों है कि एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत बादल मीडिया प्रदर्शन पुनः जांच करते हैं. वायरस कोशिकाओं विकृत बनने के लिए और संस्कृति बोतल से ढीले टूट जाएगा कारण होगा. दिखाई contaminants, जैसे खमीर, अन्य जीवाणु, कवक या भारी मच्छर मलबे, के साथ सेल संस्कृतियों कर रहे हैं एक 0.22μM सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मूल मच्छर पूल गुजर द्वारा फिर से परीक्षण किया गया.
  4. Aseptically वायरस पॉजिटिव सेल संस्कृतियों से लेबल एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग cryotubes में 1-2 MLS मीडिया के बग़ैर.
  5. वायरस संस्कृतियों -80 पर संग्रहित कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस तक उचित निदान assays का उपयोग पहचान की.

7. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. सदस्य, 5% FBS. Dd एच 2 0 4 एल के अंतिम मात्रा में भंग पाउडर सदस्य के 37.6 ग्राम. मीडिया की बोतलें और आटोक्लेव में 500 एमएल aliquots में समाधान बग़ैर. जब समाधान ठंडा है, aseptically प्रत्येक बोतल 26 एमएल गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 5.2 एल Glutamine एमएल 5.2 एमएल anti-biotic/mycotic, और 10.4 एमएल 7.5% सोडियम बिकारबोनिट जोड़ने. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
  2. पीबीएस - जी. 16 छ NaCl, 0.4 छ KCl, 2.3 जी ना 2 4 HPO, 0.4 जी के.एच. 2 पीओ 4, और 0.5% Phenol लाल 4 एमएल 1000 एमएल dd एच 0 2 में भंग. 7.1-7.4 के लिए 2 एन NaOH (यदि आवश्यक) के साथ पीएच को समायोजित करें. बीकर में एक अलग गर्मी 600 2 0 एच के एक फोड़ा करने के लिए एमएल. गर्म थाली से निकालें, 10 ग्राम जिलेटिन जोड़ने के लिए, और भंग. पीबीएस समाधान के लिए भंग जिलेटिन समाधान जोड़ें और dd एच 2 ओ के साथ 2 एल अंतिम मात्रा को समायोजित समाधान के 100 एमएल बोतलें और आटोक्लेव में बांटना. जब समाधान ठंडा है, aseptically 42.8 एमएल गर्मी निष्क्रिय खरगोश सीरम और 1.4 एमएल anti-biotic/mycotic जोड़ें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
  3. पीबीएस सेल धोने. 400 एमएल dd एच 2 ओ 50 एमएल 10X Dulbecco पीबीएस जोड़ें 7,1 करने के लिए 2 एन NaOH साथ पीएच को समायोजित करें. 500 एमएल dd एच 2 ओ के साथ अंतिम मात्रा समायोजित 0.2uM वैक्यूम फिल्टर यूनिट के साथ फ़िल्टर समाधान. 8 एमएल पेंच टोपी ट्यूबों में 5 एमएल aliquots में बांटना. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस

8. प्रतिनिधि परिणाम

नौ 4 वर्गीकरण परिवारों से वायरस के विभिन्न 1997-2010 (तालिका 1) से लगातार कनेक्टिकट में राज्यव्यापी निगरानी के दौरान एकत्र मच्छरों से बरामद किए गए. पांच इन वायरस के मानव रोग, सबसे महत्वपूर्ण रोगज़नक़ों जा रहा है पश्चिम नील नदी वायरस और पूर्वी इक्वाइन इन्सेफेलाइटिस वायरस के कारण जाना जाता है. नई खोजों में शामिल हैं: में एकत्र मच्छरों से WNV के पहले अलगाव2 1999 में उत्तरी अमेरिका, 3 2000 में पूर्वोत्तर अमेरिका में पोटोसी वायरस के पहले, अलगाव और 4 2005 में न्यू इंग्लैंड में La Crosse वायरस के पहले अलगाव.

वायरस परिवार सं आइसोलेट्स सं स्थानों सं साल का पता चला मानव रोग Refs.
पश्चिम नील नदी वायरस Flaviviridae 1002 94 12 गंभीर, बुखार, इन्सेफेलाइटिस के लिए मॉडरेट 2,5
पूर्वी घोड़ा इन्सेफेलाइटिस वायरस Togaviridae 292 41 10 गंभीर इन्सेफेलाइटिस, 6,7
हाइलैंड्स जम्मू वायरस Togaviridae 178 39 11 ज्ञात नहीं 6
जेम्सटाउन घाटी वायरस Bunyaviridae 305 74 14 उदारवादी हल्के, बुखार, मैनिंजाइटिस, 8
पोटोसी वायरस Bunyaviridae 259 76 4 ज्ञात नहीं 3
कैश घाटी वायरस Bunyaviridae 114 51 8 गंभीर, बुखार, दो मामलों में प्रलेखित स्नायविक बीमारी के लिए हल्के
Trivittatus वायरस Bunyaviridae 83 21 11 ज्ञात नहीं
La Crosse वायरस Bunyaviridae 1 1 1 गंभीर इन्सेफेलाइटिस के लिए उदार 4
फ़्लैंडर्स वायरस Rhabdoviridae 4 4 2 ज्ञात नहीं

तालिका 1. वायरस वेरो सेल संस्कृति परख द्वारा क्षेत्र एकत्र मच्छरों में पाया. मच्छरों कनेक्टिकट में 1997-2010 से राज्यव्यापी निगरानी के दौरान एकत्र किए गए थे.

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Discussion

वेरो सेल संस्कृति परख वायरस का एक विविधता के लिए स्क्रीन क्षेत्र एकत्र मच्छरों के लिए एक प्रभावी तरीका के रूप में कार्य करता है. यह आणविक विधियों है कि विशेष रूप से एक लक्ष्य या ब्याज की कुछ वायरस को विरोधाभासों है. इसके अलावा, हमने पाया है कि वेरो सेल संस्कृति परख भी उतना ही नहीं तो 7 RT-पीसीआर की तुलना में अधिक संवेदनशील और हमें वायरस आइसोलेट्स है कि भविष्य के अध्ययन के लिए हमारे संदर्भ संग्रह में संग्रहीत किए जाते हैं के साथ प्रदान करता है. फिर भी, सेल संस्कृति प्रणालियों कई मामलों में उपयुक्त नहीं हो सकता. इस दृष्टिकोण के अतिरिक्त खर्च और बीएसएल -3 एक प्रयोगशाला में वायरस को बढ़ने के लिए आवश्यक प्रशिक्षण incurs, तथापि, इन लागत अपेक्षाकृत सस्ती आपूर्ति सेल संस्कृति के लिए द्वारा ऑफसेट किया जा सकता है. यह भी यह देखते हुए कि ज्यादातर लेकिन मच्छर जनित वायरस नहीं सभी वेरो सेल संस्कृति 9,10 में CPE उत्पादन के लायक है. डेंगू वायरस एक उल्लेखनीय अपवाद है कि अन्य नैदानिक ​​परीक्षण द्वारा जांच की जानी चाहिए है. आदर्श रूप में, दोनों आणविक और सेल संस्कृति तरीके के एक संयोजन वायरल संक्रमण के लिए परीक्षण किया जाता है. वर्तमान में हम पारंपरिक और मात्रात्मक RT-पीसीआर 4,11,12 assays का उपयोग कर रहे हैं, कभी कभी अनुक्रमण के साथ संयोजन के रूप में, सेल संस्कृति में अलग - अलग वायरस की पहचान करने, और मच्छर पूल में संक्रमण reconfirm.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम कृतज्ञता डीआरएस के महत्वपूर्ण योगदान को स्वीकार करते हैं. जॉन एंडरसन, एंड्रयू मुख्य और शर्ली Tirrell इस अध्ययन करने के लिए. इस काम के हिस्से में रोग नियंत्रण और रोकथाम (U50/CCU116806-01-1) और अमेरिकी कृषि विभाग (58-6615-1-218, CONH00768, और CONH00773) के लिए केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16140
Anti-biotic/mycotic GIBCO, by Life Technologies 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. GIBCO, by Life Technologies 25080
L-Glutamine 200mM 100x GIBCO, by Life Technologies 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 11700
10X Dulbecco’s PBS GIBCO, by Life Technologies 14080
Trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 15400
Rabbit serum GIBCO, by Life Technologies 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon BD 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon BD 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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