איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יתושים לשדר מספר וירוסים שונים כולל פתוגנים אנושיים חשובים כמו וירוס הנילוס המערבי, וירוס דנגה, וירוס chickungunya. רבים של וירוסים אלה הגבירו בטווחים אנדמיים שלהם התרחבו השטחים החדשים, דבר המחייב מעקב יעיל תוכניות ובקרת להגיב לאיומים אלה. אסטרטגיה אחת כדי לעקוב אחר פעילות נגיף כרוך באיסוף כמויות גדולות של יתושים מאתרים אנדמיים ובדיקה אותם זיהום ויראלי. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לטפל, לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור וירוס מדבק ידי assay תא Vero תרבות. יתושים ממוינות לפי מיקום מלכודת מינים, מקובצים בריכות המכילות ≤ 50 אנשים. הם אספו דגימות הומוגני ב מלוחים שנאגרו באמצעות מערבל-הטחנה ואת השלב מימית הוא מחוסן ומחוברות על תרביות תאים Vero (Clone E6). בתרביות תאים מנוטרים להשפעת cytopathic מ 3-7 ימים לאחר חיסון וכל וירוסים מגדלים תרבית תאים מזוהים על ידי מבחני אבחון מתאים. על ידי ניצול גישה זו, יש לנו מבודדים 9 וירוסים שונים היתושים שנאספו בקונטיקט, ארה"ב, ובין אלה, 5 ידועים כגורמים למחלות אנושיות. שלושה וירוסים אלה (וירוס הנילוס המערבי, נגיף פוטוסי, ו La Crosse וירוס) מייצגים רשומות חדשות עבור צפון אמריקה או אזור ניו אינגלנד מאז 1999. היכולת לזהות מגוון רחב של וירוסים הוא קריטי ניטור הן הוקמה ווירוסים המתהווה באוכלוסיית היתושים.

Protocol

1. יתוש מיון וזיהוי

  1. הנהלים הבאים מבוצעים על הספסל מעבדה פתוח ייעודי biosafety רמה-2 מעבדה (BSL-2) על ידי צוות אשר מאומנים לעבוד עם יתושים לחיות. "קר שרשרת" נשמר לאורך כל ההליך.
  2. הרדימי לחיות יתושים בוגרים ידי הנחת שקית איסוף יתוש למקפיא -20 מעלות במשך 5 דקות. אוסף העברת התיק מיכל מבודד המכיל קרח יבש. סגור את המכסה ולחשוף יתושים פחמן דו חמצני במשך 1-3 דקות על מנת להבטיח להשלים עקום למטה.
  3. הקש יתושים הרדים על מחבת מראש צונן שהונח על מצע של קרח יבש. הפרד יתושים נקבה בודדים באמצעות מלקחיים בסדר מקום כוסות פלסטיק חלק. מכסים עם מכסה כוסות ומניחים על קרח רטוב.
  4. זיהוי יתושים למינים באמצעות מפתחות טקסונומיות תיאורי מבוסס על מורפולוגיה יתוש חיצוני בעזרת מיקרוסקופ לנתח סטריאו (10-60x זום) רכוב על שולחן צמרמורת אלקטרוניים.
  5. מערבבים מינים שזוהו יתוש לתוך בריכות של ≤ 50 אנשים ב 2 Snap-כובע צלוחיות מ"ל המכיל BB נחושת. בקבוקונים מסומנים עם מזהה ייחודי.
  6. בעקבות זיהוי של יתושים כל, צלוחיות ממוקמים שקיות שכותרתו שנערך צידנית קלקר המכילים קרח יבש.
  7. חנות בריכות יתושים בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לבדיקת וירוס.

2. Biosafety שיקולים לבודד את הנגיף ביתושים

  1. הנהלים הבאים מבוצעות במעבדה biosafety רמה-3 (BSL-3) על ידי צוות אשר הוכשרו והוסמכו לעבוד ברמה זו של ההכלה 1. מתקני מעבדה, ציוד, נהלים ושיטות עבודה כפופים לפיקוח מוסדי, המדינה, הפדרלי בדיקה. חפשו את ההכשרה אישור מתאים לפני שתנסה הפרוטוקולים הבאים.
  2. תלבש את הציוד המתאים מגן אישי (PPE) עבור כל הליך כגון שמלות, כפפות חד פעמיות, מגן פנים, הנשמה.
  3. לחטא את משטחי העבודה עם אלכוהול 70% לפני ואחרי השלמת ההליכים.
  4. בתרביות תאים חומר זיהומיות פוטנציאל מטופלות II מחלקה biosafety הממשלה (BSC).
  5. בריכות יתושים הם הומוגני במפעל, מיקסר כי הוא ממוקם בתוך BSC.
  6. Homogenates יתוש הם centrifuged ב microcentrifuge אירוסול צמודים. אם הליך זה לא ניתן לבצע בתוך BSC, המפעיל צריך ללבוש ההנשמה בעת ההפעלה ואחזור דגימות בצנטריפוגה.
  7. Pipets וטיפים pipet שינוע של BSC (biosafety הממשלה) הם טבול באקונומיקה 10% לפני מעוקר. לבזבז כל מעבדה הוא לחטא על ידי מעוקר לפני סילוק.

3. הכנת התאים Vero

  1. תרבות התקשורת למזוג מאחד בקבוק תרבות גדול רקמות (175 ס"מ 2) של תאים Vero ומחוברות (Clone E6) לתוך כוס פסולת המכילה אקונומיקה.
  2. שטפו תאים Vero ידי הוספת aliquot 5 מ"ל של PBS ו מערבולת מעל שכבה של תאים לאורך צידי הבקבוק והקפד לכסות ביסודיות monolayer כולו.
  3. למזוג לתוך כוס PBS פסולת.
  4. הוסף 2.5 מ"ל של טריפסין-EDTA ו מערבולת מעל שכבה של תאים והקפד לכסות ביסודיות monolayer כולו.
  5. דגירה בקבוק באינקובטור במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  6. נערו בעדינות ואת צפחת מערבולת להסיר תאים מפני השטח לתחתית. התאים צריכה להחליק בקלות; דגירה נוסף 1-5 דקות, אם התאים אינם בקלות להחליק וליפול.
  7. הוסף 5 מ"ל של מדיה Essential מינימלי (מ), 5% בסרום שור העובר (FBS), באמצעות pipet סרולוגיות ו pipet מעלה ומטה 10-20 פעמים כדי לשבור את גושי התאים.
  8. הוסף נוספת 15 מ"ל ממ, 5% עבור FBS בהיקף כולל של 22.5 מ"ל ומערבבים היטב.
  9. מקום 40 בתרבית רקמה צלוחיות קטנות (25 ס"מ 2) זקוף שני מתלים (20 צלוחיות / מתלה).
  10. מניחים את המדפים המכיל צלוחיות בתוך ארון biosafety ולהסיר כמוסות בקבוק, הצבת כמוסות ישירות מול צלוחיות.
  11. לוותר על 4 מ"ל של מזכרות, FBS 5% לתוך בקבוק כל שימוש pipet סרולוגיות.
  12. לוותר על 0.5 מ"ל לתוך תאים מושעה בקבוק אחד (~ 01:06 יחס פיצול) החלף כמוסות בקבוק.
  13. הוסף 50 מ"ל של מזכרות ספורט, 5% FBS בחזרה את הבקבוק המקורי רקמות גדולות התרבות המכילה את ההשעיה תא הנותרים (~ 2.5 MLS) ולחזור הבקבוק אל האינקובטור. תרבות אותו בקבוק גדול רקמה ניתן שימוש חוזר עד 5 קטעים ואז בקבוק חדש אמור להיות הגדרת להחליף אותו.
  14. תרבות מקום קטן רקמות צלוחיות בערימות על מגש. מערבולת את המגש על מנת לוודא כי אמצעי התקשורת באופן אחיד מכסה את החלק התחתון של פלקס.
  15. מניחים צלוחיות קטנות בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולגדול לילה ומחוברות עד 80-90%.

4. הכנת בריכות יתושים

  1. שמור בריכות יתושים קר במהלך הליכי הבדיקה. השתמש טרום מצונניםבמקפיא מתלים מערבל-טחנת קלטות, קר כקרח ריאגנטים, ו צנטריפוגה בקירור בעת עיבוד בריכות יתושים.
  2. צינורות המקום המכיל יתושים למעמד טרום צונן הקפאה להוסיף 1-1.5 מ"ל PBS-G על צינור אחד של יתושים.
  3. אחזר מערבל-טחנת קלטות מהמקפיא. מקום 24 צינורות לתוך קלטת כל כך בטוחים הטחנה מערבל.
  4. Homogenize דגימות במשך 4 דקות במהירות של 25 מחזורים / שנייה. הטחנה מערבל מנענע את צינורות במהירות גבוהה BB מתכת בתוך צינור זה משבש את רקמת יתושים.
  5. צנטריפוגה צינורות במשך 6 דקות בסל"ד 7000.
  6. צינורות המקום בחזרה מתלים במקפיא עד מחוסן לתאי Vero.

5. הרכבה של תאים Vero עם homogenates בריכה יתושים

  1. בדוק אחד לפחות בקבוק תרבות רקמה כל סדרה תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי להבטיח בריאות confluency ותא נאותה; לצפות על כיסוי 80-90%.
  2. הקו עד 20 צלוחיות קטנות בתרבית רקמה במעמד וצפחות ​​תווית עם מספרים ההצטרפות המקביל ממאגר כל יתוש.
  3. שחרר כובעים ביותר למזוג של התקשורת מתרבות צלוחיות רקמה לתוך כוס פסולת. השאירו התקשורת מספיק בקבוק כדי monolayer לחלוטין תא מעיל.
  4. Aliquot 100μL של supernatant ממאגר כל יתוש מעובד לתוך בקבוק רקמות המקביל תרבות.
  5. הברג והדק בקבוק כובע תרבות.
  6. Lay צלוחיות תרבות שטוח על שייקר במשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר) בשעה 35-40 סל"ד.
  7. חזור 20 צלוחיות תרבות רקמות תנוחה זקופה במעמד ומניחים BSC.
  8. פתחה את המיכסה 3 צלוחיות תרבות רקמות בבת אחת, לוותר על 4 התקשורת צמיחה מ"ל לתוך בקבוק אחד באמצעות פיפטה סרולוגיות; להחליף כובעים.
  9. הקפד שקצה פיפטה לא קשר את הבקבוק תרבות הצוואר או שפתיים. שינוי עצות פיפטה לפי הצורך אם הקשר הוא עשה עם הבקבוק.
  10. דגירה בתרבית רקמה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

6. הקרנת תאים Vero לצמיחה וירוס

  1. מסך מחוסן תרבות צלוחיות רקמות סימנים של זיהום ויראלי, השפעה cytopathic (CPE), 3-7 ימים לאחר חיסון.
  2. ראייה לבדוק תרביות תאים עבור CPE ו / או זיהום על ידי הטיית צלוחיות ובחינת המדיה בריכות בתחתית הבקבוק. התקשורת יופיעו מעונן כמו התאים להתדרדר במהלך CPE או בשל הצמיחה של שמרים, פטריות, או זיהום חיידקי.
  3. לבחון מחדש בתרביות תאים כי התערוכה התקשורת מעונן תחת מיקרוסקופ הפוכה. וירוסים יגרמו התאים להיות מעוותים יהיה להשתחרר מן צלוחיות תרבות. בתרביות תאים עם מזהמים לעין, כגון שמרים, חיידקים אחרים, פטריות או פסולת יתוש כבד, הם שוב נבדק על ידי העברת בריכה יתוש המקורי דרך פילטר מזרק 0.22μM.
  4. בסביבה נקייה מחיידקים, לוותר על 1-2 MLS של מדיה וירוס חיובי בתרביות תאים לתוך cryotubes שכותרתו בעזרת פיפטה סרולוגיות.
  5. תרבויות וירוס מאוחסנים ב -80 ° C עד שזוהו באמצעות מבחני אבחון מתאים.

7. הכנה של ריאגנטים

  1. ממ, 5% FBS. ממיסים 37.6 גרם של אבקת ממ בכרך האחרון של L 4 של dd H 2 0. לוותר על פתרון לתוך 500 מ"ל aliquots בבקבוקים מדיה החיטוי. כאשר יש פתרון מקורר, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 26 מ"ל חום מומת בסרום שור עוברית, 5.2 מ"ל-L-גלוטמין, 5.2 anti-biotic/mycotic מ"ל, ו - 10.4 מ"ל סודיום ביקרבונט 7.5% ל כל בקבוק. חנות ב 4 ° C.
  2. PBS-G. ממיסים 16 גרם NaCl, KCl 0.4 גרם, 2.3 גרם Na 2 HPO 4, 0.4 גרם KH 2 PO 4, ו - 4 מ"ל של פנול אדום 0.5% לתוך 1000 מ"ל dd H 2 0. התאם את ה-pH ל 7.1-7.4 עם 2 N NaOH (במידת הצורך). בכוס נפרדת, חום 600 מ"ל של H 2 0 לרתיחה. הסר מהצלחת חם, מוסיפים 10 גרם ג'לטין, וכן לפזר. הוסף פתרון ג'לטין מומס לפתרון PBS ולהתאים נפח סופי 2 L עם dd H 2 O. לוותר על 100 מ"ל של פתרון לתוך בקבוקים החיטוי. כאשר יש פתרון מקורר, בסביבה נקייה מחיידקים להוסיף 42.8 חום מומת מ"ל ארנב בסרום anti-biotic/mycotic 1.4 מ"ל. חנות ב 4 ° C.
  3. PBS לשטוף התא. הוסף 10X 50 מ"ל PBS Dulbecco של עד 400 מ"ל dd H 2 O. התאם ל-pH 7.1 עם 2 N NaOH. התאם את נפח סופי 500 מ"ל עם dd H 2 O. פתרון סינון עם יחידת ואקום 0.2uM הסינון. לוותר לתוך 5 מ"ל aliquots 8 בורג מכסה צינורות מ"ל. חנות ב 4 ° C.

8. נציג תוצאות

תשעה שונים של וירוסים של 4 משפחות טקסונומיות נמצאו היתושים שנאספו במהלך מעקב רציף ארצית בקונטיקט 1997-2010 (לוח 1). חמישה נגיפים אלה ידועים כגורמים למחלות האדם, פתוגנים הכי חשוב להיות וירוס הנילוס המערבי והמזרחי וירוס דלקת המוח סוסים. הגילויים החדשים כוללים: הבידוד הראשון של WNV מפני יתושים שנאספובצפון אמריקה ב -1999 2, הבידוד הראשון של וירוס פוטוסי בצפון מזרח ארה"ב ב -2000 3, ואת הבידוד הראשון של La Crosse וירוס בניו אינגלנד ב -2005 4.

וירוס משפחה לא מבודד מספר מקומות שנים לא זוהה האדם מחלות השופטים.
וירוס הנילוס המערבי Flaviviridae 1002 94 12 בינוני עד חמור דלקת קרום המוח, קדחת, 2,5
מזרח סוסים וירוס דלקת קרום המוח Togaviridae 292 41 10 דלקת קרום המוח חמור, 6,7
בהר J וירוס Togaviridae 178 39 11 לא ידוע 6
ג'יימסטאון קניון וירוס Bunyaviridae 305 74 14 קל עד בינוני, חום, דלקת קרום המוח 8
פוטוסי וירוס Bunyaviridae 259 76 4 לא ידוע 3
מטמון עמק וירוס Bunyaviridae 114 51 8 מתון עד חמור מחלה, חום, נוירולוגית בשני מקרים מתועדים
Trivittatus וירוס Bunyaviridae 83 21 11 לא ידוע
La Crosse וירוס Bunyaviridae 1 1 1 בינוני עד דלקת קרום המוח, חמור 4
פלנדריה וירוס Rhabdoviridae 4 4 2 לא ידוע

וירוסים טבלה 1. זוהה שדה שנאספו על ידי יתושים assay תרבות Vero התא. יתושים נאספו במהלך מעקב ארצית בקונטיקט 1997-2010.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תרבות Vero assay תא משמשת שיטה יעילה יתושים מסך השדה שנאספו עבור מגוון של וירוסים. זאת בניגוד לשיטות מולקולריות שמתמקדים אחד או כמה וירוסים של עניין. יתר על כן, מצאנו כי assay Vero תרבות התא הוא שווה אם לא יותר רגישה RT-PCR 7 ומספק לנו מבודד וירוס המאוחסנים באוסף התייחסות שלנו למחקרים עתידיים. עם זאת, התרבות מערכות התא לא יכול להיות מתאים במקרים רבים. גישה זו כרוך בהוצאות נוספות, הכשרה הנדרשת לצמוח וירוסים במעבדת BSL-3, אך עלויות אלה עשויים להתקזז על ידי אספקה ​​זולה יחסית עבור תרבית תאים. זה גם ראוי לציין כי רוב אך לא כל יתושים לייצר וירוסים CPE בתרבות התא Vero 9,10. וירוס דנגה הוא אחד יוצא דופן שאמור להיות מוקרן על ידי מבחן אחר אבחון. באופן אידיאלי, שילוב של שיטות התרבות הן מולקולרית של התא משמשים לבדיקת זיהום ויראלי. כרגע אנחנו משתמשים קונבנציונאלי RT-PCR כמותי מבחני 4,11,12, לפעמים בשילוב עם רצף, לזהות וירוסים מבודדים תרבית תאים, כדי לאשרר זיהום בבריכה יתושים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

אנו בתודה להכיר תרומות חשובות של בני הזוג. ג'ון אנדרסון, אנדרו ראשי ושירלי Tirrell למחקר זה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (U50/CCU116806-01-1) לבין משרד החקלאות האמריקני (58-6615-1-218, CONH00768 ו CONH00773).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16140
Anti-biotic/mycotic GIBCO, by Life Technologies 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. GIBCO, by Life Technologies 25080
L-Glutamine 200mM 100x GIBCO, by Life Technologies 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 11700
10X Dulbecco’s PBS GIBCO, by Life Technologies 14080
Trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 15400
Rabbit serum GIBCO, by Life Technologies 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon BD 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon BD 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
  2. Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
  3. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
  4. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
  5. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
  6. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
  7. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
  8. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
  9. Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. American Public Health Association. 189-212 (1995).
  10. Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
  11. Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
  12. Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics