Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Immunology and Infection

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Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.

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Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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Abstract

Mücken übertragen eine Reihe von unterschiedlichen Viren, einschließlich wichtiger menschlicher Krankheitserreger wie West-Nil-Virus, Dengue-Virus, und chickungunya Virus. Viele dieser Viren haben in ihrer endemischen Bereichen intensiviert und ausgebaut, um neue Gebiete, erfordern eine effiziente Überwachung und Steuerung Programme, um diese Bedrohungen zu reagieren. Eine Strategie zur Virus-Aktivität zu überwachen ist das Sammeln von einer großen Anzahl von Moskitos aus endemischen Standorte und testen sie für die virale Infektion. In diesem Artikel beschreiben wir, wie in der Handhabung, Verarbeitung und Display Mücken auf infektiöses Virus von Vero-Zellkultur-Assay-Feld-gesammelt. Mücken werden durch trap Lage und Arten sortiert, gruppiert und in Pools mit ≤ 50 Personen. Pooled Proben werden in Kochsalzlösung mit einem Mixer-Mühle und die wässrige Phase auf konfluente Vero-Zellkulturen (Clone E6) inokuliert homogenisiert. Die Zellkulturen werden für zytopathischen Wirkung vom Tage 3-7 post-Impfung und keine Viren in der Zellkultur gezüchtet durch die entsprechenden diagnostischen Tests identifiziert werden überwacht. Durch die Verwendung dieses Ansatzes haben wir 9 verschiedene Viren aus Moskitos in Connecticut, USA gesammelt isoliert, und unter diesen, 5 ist bekannt, dass Menschen eine Krankheit verursachen. Drei von diesen Viren (West-Nil-Virus, Potosi Virus und La Crosse-Virus) stellen neue Rekorde für Nordamerika oder der New England Region seit 1999. Die Fähigkeit, eine breite Vielfalt von Viren zu erkennen ist entscheidend für die Überwachung sowohl etablierte als auch neu auftretende Viren in der Mücke Bevölkerung.

Protocol

1. Mosquito Sortierung und Identifikation

  1. Die folgenden Verfahren basieren auf einer offenen Labortisch in einem dedizierten Biosicherheitsstufe-2 (BSL-2) im Labor von Mitarbeitern, die geschult, damit zu leben Mücken Arbeit durchgeführt werden. A "Kühlkette" ist während des gesamten Verfahrens beibehalten.
  2. Anesthetize leben Stechmücken, indem Mücke Auffangbeutel in einem -20 ° Gefrierschrank für 5 Minuten. Transfer-Auffangbeutel mit einem isolierten Behälter mit Trockeneis. Schließen Sie den Deckel und setzen Mücken zu Kohlendioxid für 1-3 Minuten, um sicherzustellen, komplette knock-down.
  3. Tippen Sie auf narkotisierten Mücken auf eine vorgekühlte Pfanne auf einem Bett aus Trockeneis gelegt. Trennen Sie einzelne weiblichen Mücken mit feinen Pinzetten und in Kunststoff Portionsbecher. Deckel mit Deckel und legen Tassen auf nassem Eis.
  4. Identifizieren Mücken-Spezies unter Verwendung beschreibender taxonomische Tasten auf externen Mücke Morphologie mit Hilfe eines Stereo-Binokular (10-60fach Zoom) basieren, montiert auf einer elektronischen Chill Tisch.
  5. Kombinieren Sie identifiziert Mückenarten in Pools von ≤ 50 Personen in 2 mL Schnappdeckelgläser mit einer Kupfer-BB. Vials sind mit einer eindeutigen Kennung versehen.
  6. Nach der Identifizierung aller Mücken sind Fläschchen in beschrifteten Tüten gelegt und in einem Styropor-Kühler mit Trockeneis.
  7. Shop Moskito-Pools in einem -80 ° C Gefrierschrank bis Virustestverfahren.

2. Biosafety Überlegungen Virus von Stechmücken zu isolieren

  1. Die folgenden Verfahren werden in einer Biosicherheitsstufe-3 (BSL-3) im Labor von Personal, das geschult, um auf dieser Ebene der Eindämmung 1 Arbeitsplatz durchgeführt werden. Laboreinrichtungen, Anlagen, Verfahren und Praktiken unterliegen institutionellen, Landes-und Bundesebene die Beaufsichtigung und Inspektion. Suchen Sie die entsprechende Ausbildung und Genehmigung, bevor die folgenden Protokolle.
  2. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) für jedes Verfahren wie Einweg-Kittel, Handschuhe, Gesichtsmasken und Atemschutzmasken.
  3. Desinfizieren Sie Arbeitsflächen mit 70% igem Alkohol vor und nach Abschluss Verfahren.
  4. Zellkulturen und potenziell infektiösem Material sind in der Klasse II Biosicherheitswerkbank (BSC) behandelt.
  5. Mosquito-Pools sind in einem Mixer-Mühle, die innerhalb einer BSC gelegt wird homogenisiert.
  6. Mosquito Homogenate werden in einem aerosoldicht Mikrozentrifuge zentrifugiert. Wenn dieses Verfahren nicht innerhalb einer BSC durchgeführt werden, sollte der Betreiber ein Atemschutzgerät getragen werden, wenn Betriebs-und Abrufen von Proben aus der Zentrifuge.
  7. Pipetten und Pipettenspitzen Umgang mit Material in der BSC (Biosicherheitswerkbank) sind in 10% Bleiche vor dem Autoklavieren getränkt. Alle Labor-Abfälle werden durch Autoklavieren vor der Entsorgung dekontaminiert werden.

3. Vorbereitung von Vero-Zellen

  1. Dekantieren Kulturmedien von einer großen Zellkulturflasche (175 cm 2) der konfluenten Vero-Zellen (Klon E6) in das Abwasser Becherglas mit Bleichmittel.
  2. Wash Vero-Zellen durch Zugabe einer 5 mL Aliquot PBS und wirbeln über Schicht von Zellen und entlang der Seiten des Kolbens achten Sie darauf, gründlich abdecken gesamten Monoschicht.
  3. Dekantieren PBS in das Abwasser Becher.
  4. Fügen Sie 2,5 ml Trypsin-EDTA und wirbeln über Schicht von Zellen und achten Sie darauf gründlich abdecken gesamten Monoschicht.
  5. Inkubieren Kolben in Inkubator für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2.
  6. Schütteln und wirbeln Kolben, um Zellen von unten Oberfläche zu entfernen. Die Zellen sollten abrutschen leicht; inkubieren eine zusätzliche 1-5 Minuten, wenn die Zellen nicht leicht gleiten Sie aus.
  7. 5 ml Minimal Essential Media (MEM), 5% fötalem Rinderserum (FBS), mit einer serologischen Pipette und pipettieren up-and-down 10-20 mal zum Aufbrechen der Klumpen von Zellen.
  8. Hinzufügen eines zusätzlichen 15 mL MEM, 5% FBS mit einem Gesamtvolumen von 22,5 ml und gut mischen.
  9. Platz 40 kleine Zellkulturflaschen (25 cm 2) aufrecht in zwei Racks (20 Flaschen / Rack).
  10. Legen Sie die Racks mit Flaschen in der Biosicherheitswerkbank und entfernen Kolben Mützen, Kappen Platzierung direkt vor der Flaschen.
  11. Dispense 4 ml MEM, 5% FBS in jeder Flasche mit einer serologischen Pipette.
  12. Dispense 0,5 ml suspendierten Zellen in jedem Kolben (~ 1.06 Teilungsverhältnis) Ersetzen Kolben caps.
  13. 50 ml MEM, 5% FBS wieder auf den ursprünglichen großen Zellkulturflasche mit den restlichen Zellsuspension (~ 2,5 ml) und zurück Kolben in den Inkubator. Das gleiche große Zellkulturflasche kann bis zu 5 Passagen wieder verwendet und dann eine neue Flasche sollte so eingestellt, dass sie zu ersetzen.
  14. Legen Sie kleine Zellkulturflaschen in Stapeln auf Tablett. Swirl das Fach, um sicherzustellen, dass die Medien gleichmäßig bedeckt den Boden des Flaks.
  15. Legen Sie kleine Flaschen in den Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und wachsen, bis 80-90% konfluent Nacht.

4. Vorbereitung der Moskito-Pools

  1. Keep Moskito-Pools kalt während Testverfahren. Verwenden Sie vorgekühlteGefriergestelle und Mixer-Mühle Kassetten, eiskalten Reagenzien und einer Kühlzentrifuge bei der Verarbeitung von Moskito-Pools.
  2. Die Röhrchen mit Moskitos in eine vorgekühlte Gefrierschrank Rack und fügen 1 bis 1,5 mL PBS-G in jedes Röhrchen von Mücken.
  3. Abrufen Mixer-Mühle Kassetten aus der Tiefkühltruhe. Platz 24 Röhren in jeder Kassette und dann sicher in der Mixer-Mühle.
  4. Homogenisieren die Proben für 4 min bei 25 Zyklen / Sekunde. Die Schwingmühle schüttelt die Rohre mit hoher Geschwindigkeit und einem Metall BB Inneren jeder Röhre stört die Mücke Gewebe.
  5. Zentrifugenröhrchen für 6 Minuten bei 7.000 Umdrehungen pro Minute.
  6. Die Röhrchen wieder in Gefriergestelle bis in Vero-Zellen geimpft.

5. Inokulation von Vero-Zellen mit Moskito-Pool Homogenaten

  1. Prüfen Sie mindestens eine Zellkulturflasche aus jeder Serie unter inversen Mikroskop angemessene Konfluenz und Zell-Gesundheit zu gewährleisten; erwarten etwa 80-90% Deckung.
  2. Line up 20 kleine Zellkulturflaschen in einem Rack-und Label-Kolben mit entsprechenden Zugangsnummern aus jeder Mücke Pool.
  3. Lösen Kappen und dekantieren die meisten Medien aus Zellkulturflaschen in Abfällen Becher. Lassen Sie genügend Medien in den Kolben vollständig Mantel Zellmonolayer.
  4. Aliquot 100 &mgr; Überstand aus jeder verarbeiteten Moskito-Pool in die entsprechende Zellkulturflasche.
  5. Ersetzen Sie und ziehen Sie Kulturflasche Kappe.
  6. Lay Kulturflaschen flach auf Schüttler für 5 Minuten (Raumtemperatur) bei 35-40 min.
  7. Rendite 20 Zellkulturflaschen in die aufrechte Position im Rack und in die BSC.
  8. Entdecklungsmesser 3 Zellkulturflaschen zu einer Zeit, zu verzichten 4 mL Wachstum Medien in jeder Flasche mit einer serologischen Pipette ersetzen caps.
  9. Achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze nicht in Kontakt mit der Kulturflasche Nacken oder auf die Lippe. Ändern Pipettenspitzen als notwendig, wenn Kontakt mit dem Kolben hergestellt wird.
  10. Inkubieren Zellkulturflaschen bei 37 ° C, 5% CO 2.

6. Screening Vero-Zellen für Viruswachstum

  1. Bildschirm geimpft Zellkulturflaschen Anzeichen für eine virale Infektion, zytopathischen Effekts (CPE), 3 bis 7 Tage nach der Impfung.
  2. Sichtprüfung Zellkulturen für CPE und / oder Verschmutzung durch Kippen des Flakons und der Prüfung der Medien, die Pools im Boden des Kolbens. Die Medien erscheint trüb wie die Zellen während der CPE verschlechtern oder durch das Wachstum von Hefe-, Pilz-oder Bakterienbefall.
  3. Erneut zu prüfen, Zellkulturen, die trüb Medien zeigen unter einem inversen Mikroskop. Viren verursacht Zellen zu verformen und wird losbrechen von den Kulturflaschen. Zellkulturen mit sichtbaren Verunreinigungen, z. B. Hefe, andere Bakterien, Pilze oder schwere Mücke Trümmer sind, indem die ursprüngliche Moskito-Pool durch einen 0,22 &mgr; m Spritzenfilter erneut getestet.
  4. Aseptischen Bedingungen verzichten 1-2 ml Medium aus virus-positiven Zellkulturen in etikettierte Kryoröhrchen mit einer serologischen Pipette.
  5. Virus Kulturen werden bei -80 ° C bis identifiziert mit den entsprechenden diagnostischen Tests.

7. Vorbereitung der Reagenzien

  1. MEM, 5% FBS. Lösen 37,6 g Pulver MEM in einem Gesamtvolumen von 4 l dd H 2 0. Dispense-Lösung in 500 mL Aliquots in Medien Flaschen und Autoklaven. Als Lösung abgekühlt ist, aseptisch hinzufügen 26 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 5,2 mL L-Glutamin, 5,2 mL anti-biotic/mycotic, und 10,4 ml 7,5% Natriumbicarbonat auf jeder Flasche. Lagerung bei 4 ° C.
  2. PBS-G. Lösen Sie 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4 und 4 ml 0,5% Phenolrot in 1000 mL dd H 2 0. Der pH-Wert auf 7,1-7,4 mit 2 N NaOH (falls erforderlich). In einem separaten Becherglas, Wärme 600 ml H 2 0 zum Kochen bringen. Remove from hot-Platte, 10 g Gelatine, und lösen. Add gelöste Gelatine Lösung für die PBS-Lösung und passen Endvolumen bis 2 L mit dd H 2 O. Jeweils 100 mL der Lösung in Flaschen und Autoklaven. Als Lösung abgekühlt ist, aseptisch hinzufügen 42,8 ml hitzeinaktiviertem Kaninchenserum und 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Lagerung bei 4 ° C.
  3. PBS Zelle zu waschen. Dann werden 50 ml 10x Dulbecco PBS auf 400 ml dd H 2 O. Der pH-Wert auf 7,1 mit 2 N NaOH. Passen Endvolumen von 500 mL mit dd H 2 O. Filter-Lösung mit 0.2uM Vakuum Filtereinheit. Dispense in 5 ml Aliquots in 8 ml mit Schraubverschluss Röhrchen. Lagerung bei 4 ° C.

8. Repräsentative Ergebnisse

Neun verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien wurden von Mücken im laufenden landesweiten Überwachung in Connecticut 1997-2010 (Tabelle 1) gesammelt und verwertet. Fünf dieser Viren sind bekannt für die menschliche Krankheit, die wichtigsten Krankheitserreger West-Nil-Virus und östlichen Pferde-Enzephalitis-Virus verursacht. Neue Entdeckungen sind: die erste Isolierung von WNV aus Stechmücken gesammelt inNordamerika in 1999 2, die erste Trennung von Potosi Virus in Nordosten der USA im Jahr 2000 3, und die erste Trennung von La Crosse Virus in New England im Jahr 2005 4.

Virus Familie No-Isolate Nr. Standorten Nein Jahren gemessen Krankheit beim Menschen Refs.
West-Nil-Virus Flaviviridae 1.002 94 12 Mittelschwere bis schwere, Fieber, Enzephalitis 2,5
Eastern equine-Enzephalitis-Virus Togaviridae 292 41 10 Schwere, Enzephalitis 6,7
Highlands J-Virus Togaviridae 178 39 11 Nicht bekannt 6
Jamestown Canyon-Virus Bunyaviridae 305 74 14 Leichte bis moderate, Fieber, Meningitis 8
Potosi Virus Bunyaviridae 259 76 4 Nicht bekannt 3
Cache Valley-Virus Bunyaviridae 114 51 8 Leichte bis schwere, Fieber, neurologische Erkrankung in zwei dokumentierte Fälle
Trivittatus Virus Bunyaviridae 83 21 11 Nicht bekannt
La Crosse Virus Bunyaviridae 1 1 1 Mittelschwere bis schwere, Enzephalitis 4
Flandern-Virus Rhabdoviridae 4 4 2 Nicht bekannt

Tabelle 1. Viren in Feld-gesammelt Mücken durch Vero-Zellkultur-Test nachgewiesen. Moskitos waren während der landesweiten Überwachung in Connecticut from 1997-2010 gesammelt.

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Discussion

Vero-Zellkultur-Assay dient als eine effektive Methode zur Dynprofeld-Mücken gesammelt für eine Vielzahl von Viren. Dies steht im Gegensatz zu molekularen Methoden, die gezielt eine oder einige wenige Viren von Interesse. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Vero-Zellkultur-Assay gleich ist, wenn nicht empfindlicher als RT-PCR 7 und versorgt uns mit Virusisolate, dass in unserer Referenz-Sammlung für zukünftige Studien gespeichert werden. Dennoch kann Zellkultur-Systeme nicht angemessen in vielen Fällen. Dieser Ansatz entstehen zusätzliche Kosten und Ausbildung erforderlich, um Viren in einem BSL-3 Labor wachsen, aber diese Kosten können durch relativ kostengünstige Versorgung für die Zellkultur ausgeglichen werden. Es ist auch erwähnenswert, dass die meisten, aber nicht alle Moskitos übertragene Viren CPE produzieren in Vero-Zellkultur 9,10. Dengue-Virus ist eine bemerkenswerte Ausnahme, die von anderen diagnostischen Test gescreent werden sollten. Im Idealfall sind eine Kombination aus beiden molekularen und Zellkultur-Methoden verwendet werden, um für die virale Infektion zu testen. Wir sind derzeit mit konventionellen und quantitative RT-PCR-Assays 4,11,12, manchmal in Verbindung mit Sequenzierung, um Viren in der Zellkultur isoliert zu identifizieren und Infektionen in der Mücke Pool erneut zu bestätigen.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir danken für die wichtigen Beiträge der Drs. John Anderson, Andrew Main und Shirley Tirrell zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) und dem US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 und CONH00773) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16140
Anti-biotic/mycotic GIBCO, by Life Technologies 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. GIBCO, by Life Technologies 25080
L-Glutamine 200mM 100x GIBCO, by Life Technologies 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 11700
10X Dulbecco’s PBS GIBCO, by Life Technologies 14080
Trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 15400
Rabbit serum GIBCO, by Life Technologies 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon BD 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon BD 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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