Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы представляем подробный протокол для агробактериальной вирус-индуцированных генов (VIGS) анализа в хлопка. Вирус табачной погремушкой (ТРВ)-производные векторов VIGS были развернуты, чтобы побудить глушителей РНК хлопка GrCLA1, Cloroplastos alterados один ген. Альбиноса фенотип вызванных глушителей GrCLA1 ​​наблюдался на всходов в течение 2 недель после прививки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gao, X., Britt Jr., R. C., Shan, L., He, P. Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton. J. Vis. Exp. (54), e2938, doi:10.3791/2938 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Саженцы выращивают хлопок

  1. Сейте семена возвышенности хлопка (Gossypium hirsutum) многообразие Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR и Deltapine 90 в горшках (7 см в диаметре), содержащий Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, штат Вашингтон).
  2. Имейте в горшках поднос, покрытый пластиковым куполом при 23 ° С, 120 мкЕ м -2 с -1 света, с 12 час light/12 час светового дня в темном роста комнате.
  3. Удалить купол, когда две семядоли появились.
  4. Примерно две недели спустя, использование растений с двумя полностью расширена семядоли для анализа VIGS. На данном этапе, настоящие листья еще не вышли (рис. 1).

2. Построить VIGS вектора, несущего ген GrCLA1

  1. Amplify 1 Cloroplastos alterados ген хлопок (GrCLA1) с помощью ПЦР с праймерами GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'и GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3 "из библиотеки кДНК Г. raimondii тканях листа.
  2. Дайджест ПЦР продуктов GrCLA1 ​​с EcoRI и KpnI и вставьте в pYL156 (pTRV-RNA2) вектора на перевязки.
  3. Экран клонов на LB агаром, содержащей 50 мкг / мл канамицина. Проверка конструкции ограничением пищеварения фермента и последовательности.
  4. Преобразование плазмиды Agrobacterium в tumefaciens GV3101 электропорацией и восстановить в жидкой среде LB при 28 ° C. Выберите трансформантов на пластинах с LB + канамицину (50 мкг / мл) + гентамицин (25 мкг / мл). Бактерии могут быть сохранены в 25% глицерине при -80 ° С для длительного использования.

3. Выполните VIGS прививки

  1. За три дня до прививки, полоса замороженные запасы глицерина tumefaciens Agrobacterium проведения pYL192 (ТРВ): RNA1, pYL156 (ТРВ): RNA2 (вектор в одиночку) и pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 ​​на LB агаром, содержащей 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте пластин при 28 ° С в течение 24 часов.
  2. За два дня до проникновения VIGS, выбрать одну колонию для каждой конструкции из выше пластин и привить его в 5 мл LB среде, дополненной 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина; Grow бактериальной культуры при 28 ° С в течение ночи в каток со скоростью 50 оборотов в минуту.
  3. Передача выше культуры в колбу с 50 мл LB среде, дополненной 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина, плюс 10 мМ MES (2 - (4 морфолино)-этан сульфокислоты) и 20 мкМ acetosyringone. Рост культуры при 28 ° С в течение ночи в шейкере со скоростью 50 оборотов в минуту.
  4. На следующий день, спином вниз агропромышленного бактериальных клеток при 4000 оборотов в минуту в течение 5 минут, повторно приостанавливать культуры в инфильтрации буфера, содержащего 10 мМ MgCl 2, 10 мМ MES и 200 мкМ acetosyringone. Отрегулируйте OD 600 из культуры до 1,5.
  5. Оставить культуру на скамейке при комнатной температуре в течение 3 часов.
  6. До агробактериальной инфильтрация, удар нижней семядолей хлопчатника с 25 G иглу без пирсинга через семядоли. Один или два отверстия (в зависимости от мягкости ткани) были кулаками по каждому разделу семядолей (рис. 2).
  7. Смешайте агробактериальной суспензионной культуре pYL192 (ТРВ): RNA1 и pYL156 (ТРВ): RNA2 или pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 ​​в соотношении 1:1; рука проникнуть смесь из нижней семядолях через ранив сайтов с помощью 1 needleless мл шприца (рис. 3).
  8. Обложка растения с пластиковым куполом и оставить проникли растений при комнатной температуре, при тусклом освещении на ночь.
  9. Передача растений к росту комнате с температурой 23 ° С, 120 мкЕ м -2 с -1 света с 12-часовой световой / 12 часа темно цикла.

Примечание: VIGS работает, когда растения находятся в стадии либо 23 ° С или теплице (25-28 ° С). Когда температура относительно невысока (от 23 до 25 ° С), легче для прививки и фенотип является более равномерным по сравнению с более высокими (28-30 ° С) или колебались температуры. Покрытие растений с куполом и делает VIGS более эффективным.

  1. Изучить глушителей фенотипа в 7 ~ 8 дней после проникновения. Настоящих листьев из замолчать растений pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 ​​начал отображать альбиноса фенотип (рис. 4). Растения проникли с агробактерий проведения pYL156 (ТРВ): RNA2 служить в качестве контроля.
  2. Проверьте эффективность генов путем изучения уровня экспрессии эндогенных генов с использованием обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) с РНК, выделенной из-под контроля и заставил замолчать растения хлопка.

Примечание: VIGS-е изд растения должны находиться под карантином, содержащихся условиях и растения должны быть надлежащим образом автоклавного и утилизировать после анализов, как ТРВ имеет широкий круг хозяев и уведомлению возбудителя.

4.Представитель Результаты:

Примерно через две недели после ручной инфильтрация с агробактериальной смеси, альбиноса фенотип вызванных GrCLA1 ​​глушителей явно наблюдается на настоящих листьев. Глушителей КПД достигает почти 100% в нескольких экспериментов с более чем 50 заводах. Замолчать растений дисплей равномерно распределенных и очень сильный альбиноса фенотипа на новых развивающихся листьев с мозаикой на листья бузины (рис. 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. Хлопка рассады на примерно две недели старой сцены с двумя полностью развернут семядоли для агробактериальной инфильтрации.

Рисунок 2
Рисунок 2. Штамповка крошечные отверстия на нижней стороне семядолей хлопчатника использованием 25 G иглы для облегчения агробактериальной инфильтрации.

Рисунок 3
Рисунок 3. Рук инфильтрации агробактериальной смесь в семядоли хлопок через ранив сайтов с помощью шприца needleless

Рисунок 4
Рисунок 4. Альбино фенотипа появилась на VIGS замолчать хлопчатника. Четыре сорта показано на рисунке. ) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; С) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VIGS был доказан, чтобы быть мощным инструментом в области функциональной геномики анализа временно сбить экспрессии эндогенных генов. В этом исследовании, мы разработали агробактериальной VIGS за счет использования TRV основе двоичного вектора. Хлопок CLA1 (GrCLA1) ген был разработан как визуальным маркером для мониторинга эффективности глушителей. Мы последовательно приобрела 100% генов эффективности глушителей, свидетельствует альбиноса фенотип, появляющиеся на настоящих листьев во всех разновидностях испытания, начиная с около двух недель после проникновения. Тем не менее, CLA1-замолчать растения хлопка почти превратился в волокно или посевной стадии, который, вероятно, из-за сильных дефектов на хлоропласта развития. Успешное развитие хлопкового VIGS предоставляет альтернативу легко молчание генов, представляющих интерес для потерей функции анализов и закладывает основу для хлопка функциональной генетики / геномики в быстро приближается постгеномной эпохи 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора. SP-Динеш Кумар и Юла Лю для ТРВ-VIGS векторов, и д-ра. Чак Kenerley, Терри Уилер, Джим Старр и Bayer CropScience за предоставление семян хлопчатника. Эта работа финансировалась NSF для LS и NIH для PH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roller drum Glas-Col 099A TC108 Agro-bacterium culture
Incubator Sheldon Manufacturing, Inc. 01046209 Agro-bacterium culture
UV/Vis spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Model: DU530 Measuring OD
Gene Pulser Bio-Rad Model: 1652076; Serial: 154BR3880 Electroporation
Pulser Controller Bio-Rad Model: 1652098; Serial: 232BR4833 Electroporation
Micropulser Electroporation cuvette Bio-Rad 165-2081 Electroporation
1 ml Syringe BD Biosciences 30962 Inoculation of agro-bacterium
Metro Mix 700 SUNGR SKU# 553001 Growing seedling
Terra Cotta pot T.O.Plastics GPS 3001B2 Growing seedling
MES monohydrate USB Corp., Affymetrix 18886 Infiltration buffer
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Infiltration buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
  2. Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
  3. Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  4. Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
  5. Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
  6. Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
  7. Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
  8. Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics