에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균

Biology

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Summary

우리의 곰팡이 endoglucanase 활동을위한 화면으로 저렴한 비용, 높은 처리량 방법을 설명

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Farrow, M. F., Arnold, F. H. High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (54), e2942, doi:10.3791/2942 (2011).

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Abstract

Cellulase 효소 (endoglucanases, cellobiohydrolases 및 β - glucosidases) 차례로 연료 알콜 1로 변환할 수 있습니다 구성 요소 당분로 hydrolyze의 셀룰로오스. 신재생 에너지를 제공하기 위해 cellulosic 바이오 매스의 효소 가수 분해에 대한 잠재력은 경제적인 연료 생산 2 cellulases을 엔지니어 노력을 강화하고있다. 특히 관심이 이미 식품, 섬유 처리에 대한 산업상 사용되는 곰팡이 cellulases 3-8은 다음과 같습니다.

돌연변이 cellulases의 라이브러리 간의 적극적인 변종을 식별하는 것은 기술 프로세스에 중요합니다, 적극적인 돌연변이가 더욱 향상된 특성 및 / 또는 추가 테스트 돌연변이 유발을 받게 될 수 있습니다. 곰팡이 cellulases의 효율적인 엔지니어링은 기본 생물에 대한 유전자 도구의 부족으로하고 heterologous 호스트에있는 효소를 표현의 어려움에 의해 방해되었다. 최근 모리카와 동료 E.의 표현 방법을 개발 대장균 H. jecorina 3,9, 대량으로 cellulases을 분비하는 능력과 함께 중요한 산업 곰팡이에서 endoglucanases의 촉매 도메인. 기능성 E. 대장균 표현도 Macrophomina phaseolina 10 Phanerochaete chrysosporium 11-12 포함한 다른 곰팡이에서 cellulases에 대한보고되었습니다.

우리는 E.에 곰팡이 endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사에 대한 방법을 제시 대장균. (그림 1)이 방법은 고체 매체에 성장 세포에 의해 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC)의 효소 저하를 시각화하는 일반적인 미생물의 염색 콩고 레드 (CR)를 사용합니다. 활동 분석은 저렴한 시약, 최소한의 조작을 필요로하고, 식민지 사이트에서 열화의 지역 ( "halos")로 모호하지 않은 결과를 제공합니다. 효소 활동의 양적 측정이 방법에 의해 결정되지 않을 수 있지만, 우리는 헤일로 크기가 셀에 총 효소 활동을 상호 것으로 나타났습니다. 개인 긍정적인 클론의 추가 특성은 상대적으로 단백질 적합성을 결정합니다.

전통적인 박테리아 전체 셀 CMC / CR 활동 assays 13 교차 오염, 또는 대규모 실험을 덜받을 수있는 것입니다 CMC 한천 우물에서 잠복기 문화의 적용을받습니다 식민지, 한천에 포함된 CMC를 따르고 포함됩니다. 여기 cellulase 활동 14 기존의 세척 방법을 수정 향상된 프로토콜을보고 : CMC 한천 플레이트에 성장 세포는 이전에 CR의 얼룩을 제거됩니다. 우리 프로토콜은 크게 교차 오염을 줄이고 클론 수천의 급속한 심사를 허용, 확장성이 높은 것입니다. H. 이외에 jecorina 효소, 우리가 표현하고이 프로토콜은 생물의 범위에서 효소에 적용할 수 있다고 제안, Thermoascus aurantiacusPenicillium decumbens (그림 2 참조)에서 endoglucanase 변종을 검사.

Protocol

1. 심사 플레이트 준비

  1. 25g LB 성장 매체, 15g 한천과 증류수 1L에 1.5g 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) 기판 및 소독에 압력솥을 추가합니다.
  2. autoclaving 후 적절한 항생제를 냉각하고 추가할 수 있도록 중간, 그리고 100μM의 최종 농도 IPTG.
  3. 각 5 큰 사각형 배양 접시 / bioassay 트레이 (240 X 240 X 20mm 또는 더 큰)에 200mL 매체를 하거라. 접시가 완전히 건조하도록 허용합니다.

2. Endoglucanase 라이브러리 생성 및 화면

  1. endoglucanase 촉매 도메인 (들)의 라이브러리를 생성합니다. 이것은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다 (예 : 사이트 이동 또는 임의의 돌연변이 유발, 재조합 등)는 연구자에 의해 결정됩니다.
  2. 그들은 락 연산자와 T7 프로 모터의 제어하에있는 것으로 같은 벡터로 라이브러리를 복제하고, periplasm 타겟팅을위한 pelB 신호 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. 적당한 벡터의 예입니다 Novagen에서 pET22b (+)입니다.
  3. E.에 endoglucanase 라이브러리를 변환 대장균은 BL21 (DE3)과 하나의 식민지에 대한 판 변형.
  4. 37 박 변환을 품어 ° C.
  5. 무균 이쑤시개를 사용하여 적절한 항생제로 보충 400μL LB 매체를 포함하는 96 잘 깊은 잘 접시에 클론의 예방. 37 품어 ° C 250 rpm으로 잡고 하룻밤.
  6. -80에서 장기 저장을 위해 10 %의 최종 농도 96 ° C.에 잘 하룻밤 문화 살균 글리세롤 추가 이것은 마스터 판 것입니다.
  7. 96 핀 스탬프를 사용하여, IPTG와 CMC를 포함한 심사 접시에 접시 야간 문화를 복제합니다. 최대 숙박 문화의 5 세트는 각 심사 플레이트에 찍혀 있습니다.
  8. 각 96 잘 접시의 정체성과 방향이 알려져 있도록 심사 번호판을 레이블.
  9. 실내 온도 (17-25 ° C) 숙박 또는 볼 식민지가 형성 때까지에서 스탬프 라이브러리를 품어.
  10. 식민지의 모든 흔적을 제거 때까지 증류수로 접시를 씻어.
  11. 세탁 판에; 붓고 콩고 레드 (물 속에 0.5 % CR). 접시를 충당하기 위해 충분 CR 추가되었는지 확인하십시오.
  12. 실온에서 15 분 알을 품다. CR 보육을위한 15 분 초과하지 마십시오. 긴 배양 시간이 덜 뚜렷한 halos집니다.
  13. CR을 붓고 및 1M NaCl의 풍부한 양의 (이상 충분히 번호판을 충당하기 위해) 추가합니다.
  14. 실온에서 15 분 알을 품다.
  15. CMC 열화 halos을 나타내기 위해 NaCl을 하거라. halos보다 해상도 들어, NaCl 또는 여러 NaCl 세척과 함께 더 이상 부화 시간이 필요할 수 있습니다.
  16. 멸균 이쑤시개를 사용하여 더욱 특성화를위한 마스터 플레이트에서 활성 효소의 클론을 선택하십시오.

3. 대표 결과 :

이 높은 처리량 화면 판독의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 클론은 저하 영역의 크기에 따라 비활성, 약하게 활성, 그리고 높은 활성 상태로 확인할 수 있습니다. 알려진 활동의 효소가 참고로 라이브러리에 포함되어있는 경우 특히 유용합니다. 여기에 그림과 같이, 활성 효소의 식별은 강력하고 재현할 수 있습니다. 그러나, 심사 플레이트의 적절한 라벨이 매우 중요하다는 것을 양해해 주시기 바랍니다. 연구원 ° C 자세한 특성화를위한 -80에서 저장된 마스터 플레이트에서를 선택하기 위해, 멀리 식민지를 세척 후 Active 변종을 식별할 수 있어야합니다. 마지막으로, 그것은 선험에게 인공 대 자연의 기판에 활동 사이의 관계를 평가하기 어렵습니다. 따라서 연구자들은 단백질 적합성을 결정하는 산업상 관련 자료에있는 모든 긍정적인 클론을 테스트해야합니다.

그림 1
그림 1. 심사 절차의 ​​도식 개요. 세포 endoglucanase 라이브러리로 변환 및 단일 식민지에 대한 선택 도금입니다. 클론 -80 (1) 저장 ° C와 endoglucanase 표현을 유도하기 위해 CMC와 IPTG를 포함하는 접시에 (2) 복제 도금에 대한 96 자 딥 웰 플레이트에 야간 들어서 성장. 활성 클론은 -80 ° C.에 저장된 마스터 플레이트에서 선택되고

그림 2
그림 2. E.에 곰팡이 촉매 도메인의 복제와 표현 대장균. (A) Endoglucanase 표현 벡터가. 유전자는 T7 프로 모터의 제어하에 pET22b (+) (Novagen)에 복제되었습니다. (B) 오른쪽 패널 : endoglucanase - 표현 BL21 (DE3) 식민지. 왼쪽 패널 : 콩고 레드와 세탁 및 개발 후 CMC 열화 halos.

그림 3
그림 3. CMC / 콩고 레드 화면에서 샘플 결과입니다. 사진은 세탁과 콩고 레드 개발 후 심사 번호판을 찍어. S에있는 모든 식민지creening 번호판과 비슷한 크기의되었습니다.

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Discussion

여기에서 설명한 프로토콜은 최소한의 조작으로 활성 효소의 신속하고 높은 처리량 신분증을 수 있습니다. 활동 검출은 매우 민감하고, 질적으로 세포 내에서 활동의 양을 나타냅니다. 사용의 용이성은 E.의 기능적 표현에 의해 제한 효소 라이브러리의 광범위한이 방법은 적합 대장균. 또한 이런 종류의 활동 심사는 곰팡이 cellulases에 국한되지 않고 있지만 endoglucanase의 활동에 적용할 수 있습니다, 또는 cellulase 활동하는 가용성 기판 (CMC와 같은)가 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 고든 무어와 베티 재단에 의해 및 UNCF / 머크 과학 이니셔티브에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG Sigma-Aldrich I1284
Congo Red Sigma-Aldrich C6277
Carboxymethyl Cellulose Sigma-Aldrich 360384
NaCl Sigma-Aldrich S1679
Bacto-agar BD Biosciences 214030
Bioassay plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 240845

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References

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