अस्थि पुनर्जनन के लिए मानव Perivascular स्टेम सेल का उपयोग

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Bioengineering
 

Summary

मानव perivascular स्टेम सेल (PSCs) mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) के लिए इसी तरह कंकाल ऊतक उत्थान के लिए एक उपन्यास स्टेम सेल वर्ग हैं. PSCs मानक liposuction प्रक्रियाओं के दौरान खरीद वसा ऊतक से FACS (प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई) के द्वारा अलग किया जा सकता है, तो एक osteoinductive पाड़ साथ संयुक्त हड्डी गठन को प्राप्त करने के

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James, A. W., Zara, J. N., Corselli, M., Chiang, M., Yuan, W., Nguyen, V., Askarinam, A., Goyal, R., Siu, R. K., Scott, V., Lee, M., Ting, K., Péault, B., Soo, C. Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (63), e2952, doi:10.3791/2952 (2012).

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Abstract

मानव perivascular स्टेम सेल (PSCs) कंकाल ऊतक इंजीनियरिंग 1-3 के प्रयोजनों के लिए कई ऊतकों से पर्याप्त संख्या में अलग किया जा सकता है. PSCs 'pericytes' FACS हल जनसंख्या (CD146 + CD34-CD45) और 'बाह्यास्तर अथवा किसी अंग की बनावट के बाहरी आवरण संबंधित कोशिकाओं' (CD146-CD34 + CD45), जिनमें से प्रत्येक हम पहले से mesenchymal स्टेम सेल के गुण है की सूचना दी है. PSCs MSCs तरह osteogenic भेदभाव, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छिपाना समर्थक osteogenic साइटोकिन्स 1,2 से गुजरना करने के लिए कर रहे हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम, SCID में मांसपेशी थैली आरोपण सहित कई पशु मॉडल में PSCs का osteogenicity का प्रदर्शन (गंभीर संयुक्त immunodeficient) चूहों SCID माउस calvarial दोष और athymic चूहों में एक और्विक कमानी दोष है (FSD). जांघ की मांसपेशी थैली मॉडल अस्थानिक हड्डी गठन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Calvarial दोष पार्श्विका हड्डी पर केन्द्रित कर रहे हैं और standardly व्यास में 4 मिमी (समीक्षकों आकार) 8. FSDs bicortical कर रहे हैं और साथ स्थिरpolyethylene के एक बार और 4 कश्मीर तारों. वर्णित FSD भी एक महत्वपूर्ण आकार दोष है, जो काफी अपने स्वयं के 4 पर ठीक नहीं है. इसके विपरीत, यदि स्टेम सेल या वृद्धि कारकों को दोष साइट के लिए जोड़ रहे हैं, महत्वपूर्ण हड्डी पुनर्जनन की सराहना की जा सकता है. पीएससी xenografting के समग्र लक्ष्य के लिए अस्थानिक और orthotopic दोनों हड्डी पुनर्जनन मॉडल में इस सेल प्रकार के osteogenic क्षमता का प्रदर्शन है.

Protocol

1. Perivascular स्टेम सेल अलगाव

इस विवरण में आसन्न लेख "मानव सफेद वसा ऊतकों के से Perivascular स्टेम सेल के शुद्धिकरण" में वर्णित है से एम. Corselli एट अल द्वारा.

2. पाड़ निर्माण

  1. Scaffolds (लैक्टिक - सह एसिड glycolic) hydroxyapatite 4-6 कोटिंग के साथ पाली (PLGA, Burmingham पॉलिमर). से पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के प्रति कस्टम बनाया. एपेटाइट में लिपटे PLGA scaffolds के 85/15 से PLGA हैं विलायक कास्टिंग और एक कण leaching प्रक्रिया के द्वारा गढ़े हैं. Scaffolds मांसपेशी थैली आरोपण, एक थाली के आकार का calvarial आरोपण के लिए आकार (व्यास में 4 मिमी), या और्विक कमानी दोष के लिए बेलनाकार (व्यास में 4 मिमी, लंबाई में 6 मिमी) (2 मिमी व्यास) के लिए एक गोलाकार आकार में बनाया जाता है.
  2. संक्षेप में, PLGA / क्लोरोफॉर्म समाधान (बहुलक / sucrose के अनुपात 5/95, w / w) sucrose के साथ मिश्रित कर रहे हैं एक 200-300 माइक्रोन व्यास Teflon कस्टम विपक्ष बनाने मोल्ड में डालीtruct. रातोंरात फ्रीज सुखाने के बाद, scaffolds के Teflon मोल्ड से हटा रहे हैं और DDH 2 हे में डूब sucrose के भंग. Scaffolds 70% इथेनॉल में विसर्जन से कीटाणुरहित 30 मिनट के लिए, DDH 2 ओ के तीन rinses द्वारा पीछा
  3. एपेटाइट कोटिंग के लिए, एक नकली शरीर के तरल पदार्थ (एसबीएफ) समाधान sequentially DDH ओ 2 में 2 CaCl, MgCl2 • 6 2 हे, 3 NaHCO, और कश्मीर 2 HPO 4 • 3H 2 हे घुला देनेवाला द्वारा तैयार की है समाधान पीएच 1M हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ने के लिए विलेयता वृद्धि 6 से कम है. 2 ना अतः 4, KCl, और NaCl जोड़ रहे हैं और अंतिम पीएच 6.5 (1 एसबीएफ) निकाला जाता है.
  4. Mg2 + और ​​HCO 3 - मुक्त एसबीएफ (2 एसबीएफ) 2 CaCl और कश्मीर दो HPO 4 DDH 2 हे 3H 2 हे जोड़ने और पीएच 6 से कम है के द्वारा तैयार की है. KCl और NaCl जोड़ रहे हैं और अंतिम पीएच 6.8 से निकाला जाता है. सभी समाधान एक .22 माइक्रोन पी.इ.एस. membr के माध्यम से फ़िल्टर्ड बाँझ कर रहे हैंane (Nalgene). तुरंत कोटिंग की प्रक्रिया से पहले, सूखे PLGA scaffolds चमक निर्वहन आर्गन प्लाज्मा नक़्क़ाशी (Harrick वैज्ञानिक) के अधीन हैं गीला और कोटिंग एकरूपता में सुधार.
  5. Etched scaffolds के 12 घंटे के लिए तो को 1 एसबीएफ में incubated और Mg2 + और ​​3 HCO बदल और 12 घंटे के लिए नि: शुल्क 2 एसबीएफ 37 ° सी कोमल सरगर्मी के तहत. DDH 2 हे के साथ लेपित scaffolds के अतिरिक्त आयनों को दूर धो रहे हैं और आगे के अध्ययन से पहले lyophilized.

3. स्नायु पाउच मॉडल आरोपण

  1. पीबीएस में पीएससी निलंबन के 100 μl (फॉस्फेट खारा बफर) धीरे गोलाकार PLGA आधारित तुरंत दाखिल करने से पहले प्रत्यारोपण पर गिरा दिया जाता है. जुगनू luciferase lentiviral प्रविष्टि के द्वारा कोशिकाओं किया गया है पूर्व लेबल है, तो के रूप में vivo में ट्रैकिंग के बाद आरोपण में अनुमति है. सेल घनत्व 2.5 x 5 प्रत्यारोपण प्रति 10 है.
  2. SCID चूहों (गंभीर संयुक्त immunodeficient) उम्र के 6 सप्ताह में किया जाता है. पशु anes हैंisoflurane साँस लेना द्वारा thetized और buprenorphine साथ premedicated (Bedford लैब्स). मानक Betadine तैयारी के बाद, hindlimbs में द्विपक्षीय चीरों (अनुदैर्ध्य और लंबाई में 2 मिमी) बना रहे हैं.
  3. जेब का मछलियां नितम्बास्थि मांसपेशियों में कुंद विच्छेदन मांसपेशी फाइबर लंबे समय धुरी के समानांतर से काट रहे हैं. प्रत्येक माउस के लिए, PSCs साथ PLGA आधारित प्रत्यारोपण डाला जाता है, और मांसपेशी overlying प्रावरणी में 5-0 Vicryl (Ethicon) के साथ sutured है.
  4. त्वचा अगले एक subcuticular पैटर्न में 5-0 Vicryl के साथ बंद कर दिया है. 10 दिनों के लिए, पशु postoperatively के buprenorphine साथ 48 घंटे और tmp / SMX (Qualitest / Trimethoprim Sulfamethoxazole) के लिए इलाज कर रहे हैं.

4. Calvarial दोष मॉडल आरोपण

  1. SCID चूहों 12-14 सप्ताह (पुराने) isoflurane संज्ञाहरण के बाद, बाल काटा और त्वचा प्रोटोकॉल प्रति betadine साथ कीटाणुरहित.
  2. त्वचा 8 मिमी चीरा के मध्य लिए माउस calvarium की सीवन बाण के समान के साथ किया जाता है. अगला, calvArial periosteum धीरे क्यू टिप आवेदन के द्वारा हटा दिया जाता है.
  3. अगले, एक उच्च गति दंत ड्रिल में हीरे में लिपटे ईस यंत्र के व्दारा शल्यक्रिया करना बिट का उपयोग कर, एक 4 मिमी पार्श्विका हड्डी दोष बनाया जाता है. दोष पूर्ण मोटाई है लेकिन देखभाल करने के लिए अंतर्निहित ड्यूरा मेटर घायल नहीं लिया जाता है.
  4. कस्टम engrafted PSCs के साथ PLGA आधारित प्रत्यारोपण तो दोष साइट में धीरे रखा. सेल घनत्व 2.5 x 5 प्रत्यारोपण प्रति 10 है. अंत में, त्वचा 6-0 Vicryl के साथ sutured है. पशु postoperatively के buprenorphine साथ 48 घंटे और 10 दिनों के लिए / TMP एसएमएक्स के लिए इलाज कर रहे हैं.

5. ऊरु कमानी दोष मॉडल आरोपण

  1. Athymic चूहों (12-14 सप्ताह पुराना) isoflurane साँस लेना के तहत संवेदनाहृत हैं. जांध की हड्डी झाड़ी और betadine साथ मानक प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के प्रति तैयार है.
  2. 27 30 मिमी अनुदैर्ध्य चीरा फीमर के अग्रपाश्विक पहलू के अधिक किया जाता है. और्विक शाफ्ट तो vastus अक्षां अलग से अवगत कराया हैeralis मछलियां और जाँघ की हड्डी की मांसपेशियों (चित्रा 2).
  3. हड्डी पुनर्जनन की स्थिरता को अधिकतम करने के लिए, ऊरु दोष overlying periosteum resected और्विक खंड के साथ पूरी तरह से हटा दिया जाता है.
  4. एक पॉलीथीन प्लेट (लंबाई, 23 मिमी, चौड़ाई, 4 मिमी, ऊंचाई, 4 मिमी) फीमर के अग्रपाश्विक सतह पर रखा गया है. थाली में छह पूर्व drilled छेद करने के लिए 0.9 मिमी व्यास पिरोया Kirschner तारों (Zimmer) को समायोजित. एक टेम्पलेट के रूप में प्लेट उठाते हुए, छह पिरोया Kirschner तार थाली और दोनों cortices (चित्रा 3) के माध्यम से drilled रहे हैं.
  5. अगले, एक छोटे से oscillating देखा ब्लेड (स्ट्राइकर, एमआई) के साथ, एक 6 मिमी के मध्य diaphyseal दोष बनाया जाता है. कमानी दोष तो PLGA आधारित प्रत्यारोपण किया गया है जो प्रोटोकॉल प्रति के रूप में कक्षों (चित्रा 4) के साथ लादेन की प्रविष्टि द्वारा इलाज कर रहे हैं.
  6. overlying मांसपेशियों और प्रावरणी 4-0 Vicryl absorbable sutures के साथ बंद जगह में समाविष्ट सुरक्षित करने के लिए, और त्वचा sutured है.

    6. Vivo आकलन में

    1. Radiographic आकलन एक अनुदैर्ध्य तरीके में दोनों उच्च संकल्प XR और उच्च संकल्प (सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी) μCT विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं. ΜCT विश्लेषण (1172F Skyscan) के लिए, छवियों 19.73 माइक्रोन (100 केवी और 100 मा विकिरण स्रोत, एक 0.5 मिमी एल्युमिनियम फिल्टर का उपयोग करते हुए) के एक प्रस्ताव पर स्कैन कर रहे हैं. छवियाँ DataViewer, टोह, CTAn, और CTVol सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं.
    2. Bioluminescence इमेजिंग भी एक सीरियल engraftment, सेल व्यवहार्यता प्रसार, आकलन और प्रवास प्रत्यारोपण साइट के बाहर बाहर तरीके में किया जाता है. Bioluminescence इमेजिंग एक IVIS Lumina द्वितीय डिवाइस (कैलिपर लाइफ साइंसेज) का उपयोग किया जाता है. प्रकाश outputs जहाँ रहते हैं छवि सॉफ्टवेयर (Xenogen) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. कुल प्रकाश उत्पादन फोटॉनों / / दूसरा वर्ग सेमी / steradian में दर्ज की गई है.
    3. Histological और histomorphometric विश्लेषण शवपरीक्षा किया जाता है. दिनचर्या कार्यरत दाग Masson trichrome, एनिलिन नीले, पी शामिल हैंलाल entachrome, और Picrosirius. Histomorphometric विश्लेषण आसानी से या तो एनिलिन नीला या pentachrome दाग के साथ किया जाता है, जिस में osteoid नीले और पीले, काले, क्रमशः प्रकट होता है. उच्च शक्ति क्षेत्र के प्रति पिक्सल Adobe Photoshop में जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं.

    7. प्रतिनिधि परिणाम

    के रूप में दोनों calvarial और और्विक दोष महत्वपूर्ण आकार हैं, कोई महत्वपूर्ण चिकित्सा वृद्धि कारक या exogenous स्टेम कोशिकाओं के साथ इलाज के बिना उम्मीद की जानी चाहिए.

    शल्य युद्धाभ्यास के संदर्भ में, मांसपेशियों थैली विच्छेदन प्रावरणीय विमानों के साथ और इस प्रकार कम से कम खून बह रहा का सामना किया जाना चाहिए चाहिए. हालांकि मांसपेशी थैली मॉडल द्विपक्षीय किया जाता है, माउस पश्चात 1 दिन पर आराम के साथ चलने की जानी चाहिए. Calvarial दोष के लिए, खून बह रहा का सामना करना पड़ा है लेकिन एक क्यू की नोक के साथ भिगो जा सकता है. चरम देखभाल के लिए अंतर्निहित ड्यूरा मेटर घायल नहीं लिया जाना चाहिए के रूप में इस हस्तक्षेप करेगासामान्य उपचार के साथ. FSD मॉडल के लिए, देखभाल करने के लिए नहीं प्रमुख रक्त वाहिकाओं घायल कारण नहीं है अत्यधिक रक्तस्राव या और्विक तंत्रिका neurologic क्षति को रोकने के लिए लिया जाता है. इतनी के रूप में क्षति के लिए नहीं प्रक्रिया में cortical हड्डी Kirschner तारों कोमल दबाव के साथ drilled हैं.

    आकृति 1.
    आकृति 1. में ऊरु कमानी दोष के लिए preoperative Athymic चूहे में (FSD) तैयारी. नर चूहों (12-14 सप्ताह पुराना) isoflurane साँस लेना के तहत संवेदनाहृत हैं. फीमर झाड़ी है और betadine साथ मानक प्रोटोकॉल के प्रति तैयार की.

    चित्रा 2.
    चित्रा 2. ऊरु कमानी दोष सृजन (FSD) के लिए शल्य चिकित्सा जोखिम. एक 27-30 मिमी अनुदैर्ध्य चीरा फीमर के अग्रपाश्विक पहलू पर किया जाता है. और्विक शाफ्ट के पार्श्व पहलू तो vastus lateralis अलग से अवगत कराया हैमछलियां और जाँघ की हड्डी की मांसपेशियों.

    चित्रा 3.
    चित्रा 3. ऊरु कमानी दोष सृजन (FSD) के लिए निर्धारित है. एक पॉलीथीन प्लेट (लंबाई, 23 मिमी, चौड़ाई, 4 मिमी, ऊंचाई, 4 मिमी) फीमर के अग्रपाश्विक सतह पर रखा गया है. थाली में छह पूर्व करने के लिए 0.9 मिमी व्यास पिरोया Kirschner तारों को समायोजित करने के लिए drilled छेद शामिल हैं. एक टेम्पलेट के रूप में प्लेट उठाते हुए, छह पिरोया Kirschner तार थाली और दोनों cortices के माध्यम से drilled रहे हैं. अगले, एक 6 मिमी के मध्य diaphyseal दोष बनाया है. एक बार यह किया जाता है, एक कस्टम पाड़ सीधे डाला जाता है जो बिल्कुल दोष साइट फिट बैठता है (नहीं दिखाया गया है).

    चित्रा 4.
    चित्रा 4. Calvarial पश्चात दोष का उदाहरण. एक 4 मिमी, परिपत्र calvarial दोष athymic चूहों में सही पार्श्विका हड्डी में बनाया जाता है. Imaged यहाँ एक दोष के साथ प्रत्यारोपित साइट8 पश्चात सप्ताह में PSCs. दोष साइट के भीतर नई हड्डी की उपस्थिति ध्यान दें.

Discussion

PSCs के अलगाव को अच्छी तरह से कहीं और 1-3 में वर्णित है, एक अलग से प्रस्तुत जौव विशेष रूप से पीएससी अलगाव प्रोटोकॉल और विधियों को संबोधित प्रकाशन सहित,. इस लेख के विशिष्ट उद्देश्य का वर्णन करने के लिए और हड्डी गठन / उत्थान के लिए आवेदन में vivo में पीएससी के लिए 3 प्रोटोकॉल का प्रदर्शन है. SCID माउस मांसपेशी थैली के अस्थानिक मानव हड्डी गठन के लिए 7 आमतौर पर वर्णित मॉडल है. महत्वपूर्ण मतभेद अस्थानिक और orthotopic हड्डी के लिए (दोष) मॉडल मेजबान बोन बनाने 8 कोशिकाओं के साथ पैराक्राइन बातचीत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से osteogenic संकेत कंकाल दोष microenvironment में मौजूद कारकों में से एक बहुतायत सहित, के बीच मौजूद है. दो दोष यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं, एक calvarial defect8 और ऊरु कमानी 4 दोष. दोनों आकार (यानी अपने दम पर ठीक नहीं होगा) महत्वपूर्ण हो रहे हैं अच्छी तरह से प्रलेखित.

दिलचस्प मतभेद calvarial और और्विक दोष के बीच मौजूद है. सबसे पहले,सेल: सेल xenografted PSCs और अंतर्जात कोशिकाओं के बीच बातचीत बहुत अलग है. एक calvarial दोष के मामले में, PSCs अंतर्निहित ड्यूरा मेटर (meninges की सबसे बाहरी परत), के रूप में अच्छी तरह से उन अस्थिकोरक और Periosteal कोशिकाओं circumscribing दोष साइट के साथ बातचीत. महत्वपूर्ण बात, प्रत्यारोपित कोशिकाओं और आसपास के अस्थिकोरक 8, या प्रत्यारोपित कोशिकाओं और अंतर्निहित ड्यूरा (लेवी एट अल., प्रेस में) के बीच बातचीत के सामान्य स्टेम सेल के लिए महत्वपूर्ण हैं अस्थिजनन मध्यस्थता के लिए आगे बढ़ना. और्विक कमानी दोष (FSD) के संदर्भ में, xenografted PSCs एक बहुत अलग सेल और साइटोकाइन पर्यावरण को उजागर कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, FSD साइट के मज्जा और साथ mesenchymal स्टेम कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्तर्स्थिकला, periosteum और लंबी हड्डी अस्थिकोरक से बना है. सैद्धांतिक रूप से, प्रत्येक कोशिका चोट करने के लिए अपनी प्रतिक्रिया है, और प्रत्येक कोशिका हो सकता है: पीएससी xenografts के साथ सेल बातचीत.

अन्य calvarial के बीच स्पष्ट मतभेद मौजूद हैंऔर और्विक दोष. calvarial हड्डियों शुरू में intramembranous हड्डी बन जाना के माध्यम से फार्म, जबकि लंबी हड्डियों उपास्थि मध्यवर्ती (endochondral हड्डी बन जाना) के माध्यम से फार्म. इसके अलावा, विरोहक प्रक्रिया के बाद चोट भी इन विकास मूल mimics है. बाद, FSD, उपास्थि घट्टा गठन मनाया है, जबकि कोई उपास्थि मध्यवर्ती पार्श्विका हड्डी दोष के भीतर का गठन किया है. अंत में, खोपड़ी के भ्रूण मूल की है कि लंबी हड्डियों से अलग हो सकता है. खोपड़ी (- pericytes perivascular कोशिकाओं सहित पूरे सिर क्षेत्र में) का बहुमत तंत्रिका शिखा mesectoderm () से ली गई है, जबकि उपांत्रीय कंकाल paraxial mesoderm 9 व्युत्पत्ति की है. इन सभी मतभेद पीएससी की मध्यस्थता हड्डी की मरम्मत के संदर्भ में महत्वपूर्ण अंतर में परिणाम कर सकते हैं.

PSCs का उपयोग पारंपरिक वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं (ASCs) पर कई लाभ है. PSCs संस्कृति आवश्यकता नहीं है और एक शुद्ध सेल आबादी whi हैंऔर भी नकारात्मक को नियंत्रित कर सकते हैं - endothelial कोशिकाओं के रूप में 10 osteogenic भेदभाव, Ch अन्य stromal कोशिकाओं कि में भाग नहीं शामिल नहीं करता है. इसके विपरीत में, उदाहरण के लिए, ASCs का प्रतिरूप विश्लेषण से पता चलता है कि केवल एक subpopulation इन विट्रो में 11 osteogenic भेदभाव के दौर से गुजर में सक्षम हैं. अंत में, कंकाल ऊतक इंजीनियरिंग के प्रयासों की संभावना बहिर्जात वृद्धि कारकों के साथ osteocompetent स्टेम सेल (जैसे PSCs के रूप में) और एक osteoconductive पाड़ (जैसे हा - PLGA के रूप में वर्तमान तरीकों में प्रयुक्त) को शामिल करेंगे के रूप में सबसे अच्छा कंकाल दोष को ठीक करने के लिए.

Disclosures

के.टी., बीपी, और सीएस perivascular स्टेम सेल से संबंधित UCLA से दायर पेटेंट के आविष्कारक हैं. डीआरएस. के.टी., और सीएस scarless लेबोरेटरीज इंक है जो यूसी रीजेण्ट से perivascular स्टेम सेल से संबंधित पेटेंट sublicenses के संस्थापक हैं. डॉ. चिया सू भी scarless प्रयोगशालाओं, Inc का एक अधिकारी है

Acknowledgments

यह काम सीआईआरएम जल्दी translational अनुसंधान पुरस्कार द्वितीय TR2-एनआईएच 01,821 / NIDCR (अनुदान DE0177711 R21 और DE01607 RO1), यूसी डिस्कवरी 07-10,677 अनुदान, AWJ और RKS द्वारा समर्थित किया गया है T32 प्रशिक्षण फैलोशिप (5T32DE007296-14) के पुरस्कार, JNZ सीआईआरएम प्रशिक्षण फैलोशिप (TG2 01,169) है.

References

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