뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

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Bioengineering
 

Summary

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와 결합

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James, A. W., Zara, J. N., Corselli, M., Chiang, M., Yuan, W., Nguyen, V., Askarinam, A., Goyal, R., Siu, R. K., Scott, V., Lee, M., Ting, K., Péault, B., Soo, C. Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (63), e2952, doi:10.3791/2952 (2012).

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Abstract

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) 골격 조직 공학 1-3의 목적에 대해 여러 조직에서 충분한 숫자 격리 수 있습니다. PSCs는 'pericytes'의 FACS - 정렬 인구 (CD146 + CD34-CD45-) 그리고 우리가 이전에 mesenchymal 줄기 세포의 속성을 가지고보고에 따르면 각각 'adventitial 세포'(CD146-CD34 + CD45-)입니다. PSCs는 MSCS처럼 osteogenic 차별화뿐만 아니라 분비 프로 osteogenic 크린 시토킨 1,2를 받아야 할 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 우리는 SCID의 근육 주머니 주입 포함한 여러 동물 모델에서 PSCs의 osteogenicity을 설명 (심한 복합 immunodeficient) 마우스, SCID 마우스 calvarial 결함 및 athymic 쥐에 대퇴 segmental 결함 (FSD)를. 허벅지 근육 주머니 모델은 자궁외 뼈 형성을 평가하는 데 사용됩니다. Calvarial 결함 정수리 뼈를 중심으로, 직경 standardly 4mm (비판적 크기) 8 있습니다. FSDs는 bicortical하고 함께 안정된다폴리에틸렌 바, K - 와이어 4. 설명 FSD는 크게 자체 4 일 치료를하지 않는 임계 크기의 결함입니다. 줄기 세포 또는 성장 요소가 결함 사이트에 추가하는 경우에는 반대로, 큰 뼈 재생을 감상할 수 있습니다. PSC의 xenografting의 전반적인 목표는 자궁외 및 orthotopic 모두 뼈 재생 모델에서 세포 유형의 osteogenic 능력을 입증하는 것입니다.

Protocol

1. Perivascular 줄기 세포 격리

이것은 M. Corselli 의해 인접 기사 "인간 백색 지방 조직에서 Perivascular 줄기 세포의 정화"에 자세히 설명되어 있습니다.

2. 발판 만들기

  1. 공사장 공중 발판은 폴리 (락트 - 공동 glycolic 산) (PLGA, Burmingham 폴리머) 히드록 시아파 타이트 코팅 4-6로의 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜에 따라 맞춤 만들어집니다. 인회석 코팅 PLGA의 공사장 공중 발판은 용매 캐스팅과 미립자 침출 과정에서 PLGA 15분의 85에서 가공된다. 공사장 공중 발판은 근육 주머니 주입, 대퇴 segmental 결함에 대한 원반 모양 calvarial 주입에 대한 형상 (직경 4 ㎜), 또는 원통형 (직경 4mm, 길이 6 ㎜)에 대한 구면 형상 (2-mm 직경)에 만들어집니다.
  2. 간단히, PLGA / 클로로포름 솔루션은 맞춤 죄수를 만드는 200 300 μm의 직경 테플론 몰드 속에 던져지는 자당 (폴리머 / 자당 비율 95분의 5, W / W)과 혼합truct. 하룻밤 냉동 건조 후 공사장 공중 발판은 테플론 몰드에서 제거되며 자당을 분해하는 ddH 2 O에 열중. 공사장 공중 발판은 ddH 2 O를 세 물에 빨고 그 다음, 30 분 동안 70 %의 에탄올에 침지하여 소독하고
  3. 인회석 코팅의 경우 모의 바디 오일 (SBF) 솔루션은 순차적으로 ddH 2 O.에 CaCl 2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3, K 2 HPO 4 • 3H 2 O를 해소하여 준비가되어 있습니다 솔루션 산도는 용해도를 증가 1M 염산을 추가하여 6으로 저하됩니다. 나 2 SO 4, KCl 및 NaCl이 추가되어 최종 산도는 6.5 (SBF 1)로 조정됩니다.
  4. Mg2 +와 HCO 3 - 무료 SBF (SBF 2) CaCl 2와 ddH 2 O의 K 2 HPO 4 • 3H 2 O를 추가하고 산도가 6 져서 의해 준비가되어 있습니다. KCl과 NaCl이 추가되어 최종 산도가 6.8로 조정됩니다. 모든 솔루션은 0.22 μm의 PES membr 통해 여과 멸균 있습니다ane (Nalgene). 코팅 공정에 바로 전에, 말린 PLGA의 공사장 공중 발판은 wetting 및 코팅 균일성 향상을 위해 글로우 방전 아르곤 플라즈마 에칭 (Harrick 과학)를 받게됩니다.
  5. 에칭처리된 공사장 공중 발판 그러면 12 H에 대해 SBF 1 incubated와 Mg2 +와 HCO 3으로 변경 - 37 호는 12 H 무료 SBF 2 ° C에서 부드럽게 저어 이하. 코팅 공사장 공중 발판을 초과 이온을 제거하는 ddH 2 O로 씻어 사전에 더욱 공부에 동결 건조된됩니다.

3. 근육 주머니 모델 주입

  1. PBS의 PSC 서스펜션의 100 μl은 (인산염은 염분 버퍼) 부드럽게 주입은 즉시 이전 구면 PLGA 기반 보형물에 삭제됩니다. 셀 너무 생체내 추적 게시물 주입에 허용하는 것처럼 반딧불 루시페라제의 lentiviral 삽입에 의해 미리 분류되었습니다. 세포 밀도는 이식 당 2.5 × 10 5.
  2. SCID (중증 복합 immunodeficient) 생쥐는 생후 6 주가되면 사용됩니다. 동물 anes 있습니다isoflurane 흡입에 의한 thetized 및 buprenorphine (베드 포드 연구소)와 premedicated. 표준 Betadine 준비 후 hindlimbs의 양자 incisions가 (길이가 세로 2 ㎜) 만들어집니다.
  3. 주머니는 근육 섬유 긴 축에 무딘 절개를 병행하여 팔뚝 femoris 근육에 절단됩니다. 각 마우스의 경우 PSCs와 PLGA 기반 보형물이 삽입되고, 근육 overlying 근막은 5-0 Vicryl (Ethicon)와 함께 봉합합니다.
  4. 피부는 다음 subcuticular 패턴에서 5-0 Vicryl로 닫힙니다. 10 일 동안, 동물은 48 시간 및 TMP / SMX (Qualitest 트리 메소 / 설파 메 톡 사 졸)에 대해 buprenorphine로 postoperatively 처리됩니다.

4. Calvarial 결함 모델 주입

  1. SCID 마우스 (12~14주 오래된)의 isoflurane 마취 후 머리가 잘린 후 피부는 프로토콜 당 betadine로 소독한다.
  2. 8-mm 피부 절개가 마우스 두개관의 중반 화살 봉합 함께 이루어집니다. 다음으로, calv이 Arial 골막이 부드럽게 Q-팁 응용 프로그램에 의해 제거됩니다.
  3. 다음으로, 고속 치과용 드릴에서 다이아몬드 코팅 trephine 비트를 사용하여, 4-mm 정수리 뼈 결함이 만들어집니다. 결함은 전체 두께입니다 - 그러나주의가 기본 경질의 mater을 다치게하지 가져옵니다.
  4. engrafted PSCs있는 맞춤 PLGA 기반 임플란트 그런 다음 결함 사이트에 부드럽게 위치합니다. 세포 밀도는 이식 당 2.5 × 10 5. 마지막으로, 피부는 6-0 Vicryl로 봉합한다. 동물은 48 시간 및 10 일 동안 TMP / SMX에 대한 buprenorphine와 postoperatively 처리됩니다.

5. 대퇴 Segmental 결함 모델 주입

  1. Athymic 쥐 (12-14주 오래된)는 isoflurane 흡입 아래 anesthetized 있습니다. 대퇴골 하찮은 및 betadine 표준 프로토콜 (그림 1) 당 준비가되어 있습니다.
  2. 27-30-mm 세로 절개는 대퇴골의 anterolateral 측면을 통해 이루어집니다. 대퇴부 샤프트는 다음 vastus 위도를 분리하여 노출되어eralis와 팔뚝 femoris 근육 (그림 2).
  3. 뼈 중생의 일관성을 최대화하기 위해 대퇴 결함을 overlying 골막이 완전히 resected 대퇴 세그먼트로 제거됩니다.
  4. 폴리에틸렌 플레이트는 (길이 23mm, 폭 4mm, 높이 4 ㎜) 대퇴골의 anterolateral 표면에 위치합니다. 플레이트가 0.9 밀리미터 직경의 스레드 Kirschner 와이어 (짐머)를 수용하려면 여섯 사전 뚫고 구멍이 포함되어 있습니다. 템플릿으로 접시를 타고 여섯 스레드 Kirschner 와이어는 접시 두 cortices (그림 3)를 통해 뚫고있다.
  5. 다음, 작은 진동 톱 블레이드 (스트라이커, MI)로, 6 mm 중반 diaphyseal 결함이 만들어집니다. Segmental 결함 그때마다 프로토콜과 같은 세포 (그림 4)와 라덴되었습니다 PLGA 기반 임플란트의 삽입에 의해 처리됩니다.
  6. overlying 근육과 근막이 제자리에 이식을 확보하기 위해 4-0 Vicryl 흡수성 봉합으로 폐쇄되며, 피부 봉합합니다.

    6. VIVO 평가에서

    1. Radiographic 평가는 고해상도 XR 및 고해상도 μCT (마이크로 계산된 tomography) 분석 모두에서 세로 방식으로 수행됩니다. μCT 분석 (Skyscan 1172F)의 경우, 이미지가 19.73 μm의 (100 kV, 100 석사 방사선 소스, 0.5 mm 알루미늄 필터를 사용)의 해상도로 스캔합니다. 이미지 DataViewer, 정찰기, CTAn 및 CTVol 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다.
    2. Bioluminescence 이미징은 또한 세포 engraftment, 생존, 증식을 평가하고 보형물 사이트의 마이 그 레이션을 제외할 직렬 방식으로 이루어집니다. Bioluminescence 이미징은 IVIS Lumina II 장치 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 수행됩니다. 조명 출력은 생활 이미지 소프트웨어 (Xenogen)을 사용하여 계량한다. 총 광 출력은 광자 / 평방 / 초 cm / steradian에 기록됩니다.
    3. Histological 및 histomorphometric 분석은 사후에 수행됩니다. 고용 정기 얼룩 Masson의 trichrome, 아닐린 블루, P를 포함entachrome 및 Picrosirius 빨간색. Histomorphometric 분석 뼈 같은가 각각 파란색과 노란색 어두운 나타나는, 아닐린 블루 pentachrome 얼룩 하나 쉽게 수행됩니다. 높은 동력 분야마다 픽셀은 어도비 포토샵의 마법 지팡이 도구를 사용하여 계산됩니다.

    7. 대표 결과

    calvarial과 대퇴 결함이 모두 중요 크기 때문에, 더 중요한 치료는 성장 요인이나 외인성 줄기 세포로 치료없이 기대 해서도 안됩니다.

    국지 전술의 측면에서 근육 주머니의 해부는 fascial 비행기를 따라해야하기 때문에 최소한의 출혈이 발생한다. 근육 파우치 모델이 양자 수행하더라도, 마우스는 수술 후 1 일째에 쉽게 걸어해야합니다. calvarial 결함의 경우 출혈이 발생하지만 Q-팁 흥건히 묻어 수 있습니다. 익스 트림주의 기본 경질의 mater을 다치게하지 복용해야 -이게 방해하므로정상적인 치유와. FSD 모델의 경우주의가 neurologic 손상을 방지하기 위해 과도한 출혈이나 대퇴 신경을 일으킬하지 않는만큼 주요 혈관을 다치게하지 가져옵니다. Kirschner 와이어가 있으므로 같은 과정에서 대뇌 피질 골을 손상하지 않는 부드러운 압력으로 뚫고있다.

    1 그림.
    1 그림. Athymic 쥐에 대퇴 Segmental 결함에 대한 수술 전 준비 (FSD). 남성 쥐 (12~14주 오래된)는 isoflurane 흡입 아래 anesthetized 있습니다. 대퇴골 하찮은이며 betadine있는 표준 프로토콜에 따라 준비.

    그림 2.
    그림 2. 대퇴부 Segmental 결함 (FSD) 제작을위한 외과 노출. 27-30mm 세로 절개는 대퇴골의 anterolateral 측면을 통해 이루어집니다. 대퇴 축의 측면 그러면 vastus lateralis를 분리하여 노출되어그리고 팔뚝 femoris 근육.

    그림 3.
    그림 3. 대퇴부 Segmental 결함 (FSD) 제작을위한 고정. 폴리에틸렌 플레이트는 (길이 23mm, 폭 4mm, 높이 4 ㎜) 대퇴골의 anterolateral 표면에 위치합니다. 플레이트가 0.9 밀리미터 직경의 스레드 Kirschner 와이어를 수용이 6 미리 뚫고 구멍이 포함되어 있습니다. 템플릿으로 접시를 타고 여섯 스레드 Kirschner 와이어는 접시 두 cortices 통해 뚫고있다. 다음으로, 6mm 중간 diaphyseal 결함이 만들어집니다. 이것이 수행되면 사용자 정의 - 만든 비계에서 직접 어느 정확하게 (보이지 않음) 결함 사이트를 맞는 삽입됩니다.

    4 그림.
    4 그림. 수술후 Calvarial 결함의 예. 4mm, 원형 calvarial 결함이 athymic 생쥐의 오른쪽 정수리 뼈에 만들어집니다. 몇 군데는 여기로 이식 결함 사이트입니다수술후 8주에서 PSCs. 결함 사이트 내에서 새로운 뼈의 존재를 확인합니다.

Discussion

PSCs의 분리가 잘 특별히 PSC 격리 프로토콜과 방법을 해결 별도로 제출한 주피터의 간행물을 포함하여 다른 1-3 설명되어 있습니다. 이 문서의 구체적인 목적은 뼈 형성 / 재생을위한 생체내 응용 프로그램에서 PSC 3 프로토콜을 설명하고 입증하는 것입니다. SCID 마우스 근육 주머니는 자궁외 인간의 뼈 형성 7에 대한 일반적 설명하는 모델입니다. 중요한 차이는 paracrine 호스트 뼈 - 형성 세포 8 상호 작용뿐만 아니라 골격 결함 microenvironment에 존재 osteogenic 신호 요소의 풍부한 포함한 뼈에 자궁외 및 orthotopic (결함) 모델 사이에 존재합니다. 두 결함은 여기 calvarial defect8과 대퇴 segmental 결함 4 제공됩니다. 모두 (즉 스스로 치유되지 않음) 크기의 중요한 것으로 잘 설명되어 있습니다.

재미있는 차이 calvarial 및 대퇴 결함 사이에 존재합니다. 첫째,셀 : xenografted PSCs과 내생 세포 사이의 세포 상호 작용은 매우 다릅니다. calvarial 결함의 측면에서 PSCs은 기본 경질의 mater (meninges의 가장 바깥쪽 레이어)뿐만 아니라 결함 사이트를 circumscribing 그 osteoblasts와 periosteal 세포와 상호 작용. 중요한 것은, 이식 세포 및 주변 osteoblasts 8 또는 이식 세포 밑에 경질 (레비 외., 언론) 간의 상호 작용이 진행 osteogenesis를 매개 정상적인 줄기 세포에 대한 중요합니다. 대퇴 segmental 결함 (FSD)의 측면에서 xenografted PSCs는 매우 다른 세포와 시토킨 환경에 노출됩니다. 예를 들어, FSD 사이트는 골수 및 동봉 mesenchymal 줄기 세포뿐만 아니라 endosteum, 골막과 긴 뼈 osteoblasts 구성되어 있습니다. 이론적으로, 각 세포 상해에 대한 자체적인 반응을 가지고 있으며, 각각 세포가있을 수 있습니다 PSC의 xenografts와 세포의 상호 작용.

다른 분명한 차이는 calvarial 사이에 존재그리고 대퇴부 결함. 긴 뼈가 연골 중간 (endochondral의 골화)를 통해 형성하면서 calvarial 뼈가 초기 intramembranous 골화을 형성하고 있습니다. 또한, reparative 프로세스는 이후 부상에도 이러한 발달적 기원을 모방한 것이었 지요. 아무 연골 중간은 정수리 뼈 결함 내에 형성되지 않습니다 반면, 포스트 FSD, 연골의 굳은살 형성은 관찰된다. 마지막으로, 두개골의 배아 기원은 긴 뼈의 차이가있을 수 있습니다. 두개골 (- pericytes - perivascular 세포를 포함한 전체 헤드 지역)의 대부분은 appendicular의 골격은 paraxial mesoderm의 파생 9 시간 동안 신경 문장 (mesectoderm)에서 파생됩니다. 이러한 모든 차이 PSC-매​​개 뼈 수리 측면에서 큰 차이가 발생할 수 있습니다.

PSCs의 사용은 전통적인 지방 파생 stromal 세포 (ASCs) 이상 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. PSCs 문화를 필요로하고 정화 세포 인구 whi하지 않는다고그리고 심지어 부정적인 규제 없어 - - osteogenic 차별화 등 10 내피 세포와 같은 채널은 참여하지 않는 다른 stromal 세포를 포함하지 않습니다. 반대로 예를 들면, ASCs의 clonal 분석은 subpopulation가 체외 11 osteogenic 분화를 겪고 능력이있다 는걸 보여줍니다. 결국, 골격 조직 엔지니어링 노력은 가능성이 가장 좋은 골격 결함을 치유하는만큼 외인성 성장 요인과 osteocompetent 줄기 세포 (예 PSCs) 및 osteoconductive 비계 (예 : HA-PLGA와 같은 현재의 방법에서 사용) 통합됩니다.

Disclosures

KT, 혈압 및 CS은 UCLA에서 제기된 perivascular 줄기 세포 관련 특허의 발명가입니다. Drs. KT와 CS는 UC Regents에서 perivascular 줄기 세포 관련 특허를 sublicenses Scarless 연구소 Inc의 창립자입니다. 박사 Chia 지수도 Scarless 연구소, 주식 회사의 임원이다

Acknowledgments

이 작품은 CIRM 조기 Translational II 연구 수상 TR2-01821, NIH / NIDCR (보조금 R21 DE0177711 및 RO1 DE01607), UC 디스커버리 그랜트 07-10677, AWJ 및 RKS에 의해 지원되었습니다 T32 연수 장학금 수상 (5T32DE007296-14), JNZ CIRM 훈련 교제 (TG2-01169)이 있습니다.

References

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