Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te bereiken

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

James, A. W., Zara, J. N., Corselli, M., Chiang, M., Yuan, W., Nguyen, V., Askarinam, A., Goyal, R., Siu, R. K., Scott, V., Lee, M., Ting, K., Péault, B., Soo, C. Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (63), e2952, doi:10.3791/2952 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) kunnen worden geïsoleerd in voldoende aantallen van verschillende weefsels ten behoeve van skeletale tissue engineering 1-3. PSC een FACS gesorteerd populatie "pericyten (CD146 + CD34-CD45-) en 'adventitia cellen (CD146 CD34 +-CD45-), die elk wij eerder gemeld eigenschappen van mesenchymale stamcellen. PSC zoals MSC's kunnen osteogene differentiatie, als pro-scheiden osteogene cytokines 1,2 ondergaan. In het huidige protocol, tonen we de osteogenicity van de PSC's in verschillende diermodellen, inclusief een spier zakje implantatie bij SCID (ernstige gecombineerde immunodeficiëntie) muizen, een SCID muis calvarial defect en een femorale segmentaal defect (FSD) in athymische ratten. De dijspier zakje model wordt gebruikt om ectopische botvorming te beoordelen. Calvarial defecten zijn gericht op de pariëtale bot en zijn standaard 4 mm in diameter (kritische grootte) 8. FSDs zijn bicortical en worden gestabiliseerd meteen polyethyleen bar en K-draden 4. De beschreven FSD is een kritische omvang gebrek, dat niet significant geneest 4. Als daarentegen stamcellen of groeifactoren toegevoegd aan het defect kunnen aanzienlijke botherstel gewaardeerd. De algemene doelstelling van PSC xenografting is om de osteogene mogelijkheden van dit type cel aan te tonen in zowel ectopische en orthotope botregeneratie modellen.

Protocol

1. Perivasculaire Stem Cell Isolatie

Dit wordt in detail beschreven in de aangrenzende artikel "Zuivering van perivasculaire stamcellen van menselijke vetweefsel", door M. Corselli et al..

2. Steiger Creation

  1. Steigers zijn op maat gemaakt per eerder gepubliceerde protocol van poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA, Burmingham Polymer) met hydroxyapatiet coating 4-6. Apatiet gecoate PLGA steigers zijn vervaardigd uit 85/15 PLGA Met behulp van oplosmiddelen gieten en een fijn uitloging proces. Steigers zijn gemaakt in een bolvorm (2 mm) voor spierzakje implantatie een schijfvormige vorm (4 mm) voor calvarial implantatie of cilindrisch (4 mm diameter 6 mm lengte) voor femorale segmentale defecten.
  2. In het kort, PLGA / chloroform oplossingen gemengd met sucrose (polymeer / sucrose verhouding 5/95, w / w) zijn gegoten in een 200-300-um een ​​diameter van Teflon mal om de custom-made cons makentruct. Na het vriesdrogen 's nachts, zijn steigers verwijderd uit de Teflon mal en ondergedompeld in DDH 2 O om de sucrose te ontbinden. Steigers worden gedesinfecteerd door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 min, gevolgd door drie spoelingen van DDH 2 O.
  3. Voor apatiet coating, wordt een gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF) oplossing bereid door achtereenvolgens het oplossen van CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 en K 2 HPO 4 • 3H 2 O in DDH 2 O. PH wordt verlaagd tot 6 door toevoeging van 1 M zoutzuur om de oplosbaarheid te verbeteren. Na 2 SO 4, KCl, NaCl en toegevoegd en de uiteindelijke pH op 6,5 (SBF 1).
  4. Mg2 + en HCO 3 - vrije SBF (SBF 2) wordt bereid door toevoeging CaCl2 en K2 HPO 4 • 3H 2 O 2 O in DDH en pH verlaagd wordt tot 6. KCl en NaCl toegevoegd en de uiteindelijke pH op 6,8. Alle oplossingen zijn steriel gefiltreerd door een 0,22 pm PES membrane (Nalgene). Direct voorafgaand aan de coating proces worden de gedroogde PLGA steigers onderworpen aan glimontlading argon plasma-etsen (Harrick Scientific) te bevochtigen en coaten uniformiteit te verbeteren.
  5. Geëtst steigers vervolgens geïncubeerd in SBF 1 voor 12 uur en veranderd Mg2 + en HCO 3 - vrij SBF 2 met 12 uur bij 37 ° C onder voorzichtig roeren. Coated steigers worden gewassen met DDH 2 O om het overtollige ionen te verwijderen en voorafgaand aan verdere studies gevriesdroogd.

3. De Muscle Pouch Model Implantatie

  1. 100 ul van een PVC suspensie in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) worden voorzichtig vallen op het bolvormige PLGA gebaseerde implantaat onmiddellijk voorafgaand aan implantatie. Cellen werden gelabelde door lentivirus inbrengen van vuurvlieg luciferase, om mogelijk in vivo volgen na implantatie. Cel dichtheid is 2,5 x 10 5 per implantaat.
  2. SCID (ernstige gecombineerde immunodeficiëntie) muizen worden gebruikt op 6 weken oud. Dieren zijn Anesthetized door isofluraan inademing en premedicatie met buprenorfine (Bedford Labs). Na standaard Betadine bereiding worden bilaterale insnijdingen in de achterpoten gemaakt (lengte en 2 mm lengte).
  3. Zakken worden gesneden in de biceps femoris spieren door stompe dissectie parallel aan de spiervezels lange as. Voor elke muis, wordt de PLGA-gebaseerde implantaat met PSC's geplaatst en de fascia bovenop de spier wordt gehecht met 5-0 Vicryl (Ethicon).
  4. De huid wordt volgende gesloten met 5-0 Vicryl in een subcutane patroon. De dieren worden na de operatie behandeld met buprenorfine voor 48 uur en TMP / SMX (trimethoprim / sulfamethoxazol, Qualitest) gedurende 10 dagen.

4. De Calvarial Defect Model Implantatie

  1. Na isofluraananesthesie van SCID muizen (12-14 weken oud), wordt het haar geknipt en de huid ontsmet met betadine per protocol.
  2. Een 8-mm incisie in de huid gebeurt langs het midden van de pijlnaad van de muis calvarium. Vervolgens wordt de Calvarial periost wordt voorzichtig verwijderd door Q-tip applicatie.
  3. Vervolgens wordt met behulp gediamanteerd trephine bits in een snelle tandartsboor wordt een 4 mm wandbeen defect gemaakt. Het defect is de volledige dikte - hoe zorg wordt genomen niet aan de onderliggende dura mater verwonden.
  4. De op maat gemaakte PLGA-gebaseerde implantaat met geënt PSC's wordt vervolgens voorzichtig geplaatst in het defect site. Cel dichtheid is 2,5 x 10 5 per implantaat. Ten slotte wordt de huid gehecht met 6-0 Vicryl. De dieren worden na de operatie behandeld met buprenorfine voor 48 uur en TMP / SMX gedurende 10 dagen.

5. De Femorale segmentaal defect Model Implantatie

  1. Athymische ratten (12-14 weken oud) zijn verdoofd onder isofluraan inademing. Het dijbeen is geschrobd en bereide per standaard protocol met betadine (figuur 1).
  2. Een 27-30-mm longitudinale incisie wordt gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De femurschacht wordt vervolgens blootgesteld door het scheiden van de vastus lateralis en biceps femoris spieren (figuur 2).
  3. Om de consistentie van botregeneratie te maximaliseren, wordt het periost bovenop de femorale defect volledig verwijderd met de verwijderde femorale segment.
  4. Een polyetheen plaat (lengte 23 mm, breedte, 4 mm, hoogte, 4 mm) wordt op de anterolaterale oppervlak van de femur. De plaat bevat zes voorgeboorde gaten om tegemoet 0,9 mm diameter schroefdraad Kirschner draden (Zimmer). Inname van de plaat als een sjabloon, worden zes schroefdraad Kirschner draden geboord door de plaat en beide cortex (Figuur 3).
  5. Vervolgens een kleine oscillerende zaagblad (Stryker, MI), wordt een 6 mm midden diaphyseal defect gemaakt. Gesegmenteerde defecten worden behandeld door het inbrengen van PLGA gebaseerde implantaten die zijn beladen met cellen volgens het protocol (figuur 4).
  6. De bovenliggende spier-en fascia zijn gesloten met 4-0 Vicryl resorbeerbare hechtingen om het implantaat vast te zetten, en de huid wordt gehecht.

    6. In vivo beoordelingen

    1. Radiografische evaluaties worden uitgevoerd in een longitudinale manier door zowel een hoge resolutie XR en een hoge resolutie μCT (micro CT) analyse. Voor μCT analyse (Skyscan 1172F), worden de beelden gescand met een resolutie van 19,73 urn (100 kV en 100 mA stralingsbron met een 0,5 mm aluminium filter). Afbeeldingen worden geanalyseerd met behulp van Dataviewer, Recon, CTAN en CTVol software.
    2. Bioluminescentie beeldvorming gebeurt ook in een seriële manier naar cel engraftment, levensvatbaarheid, de proliferatie te beoordelen en uit te sluiten uit de migratie van het implantaat site. Bioluminescentie beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een IVIS Lumina II apparaat (Remklauw Life Sciences). Licht uitgangen worden gekwantificeerd met behulp van Living Image software (Xenogen). Totaal lichtopbrengst is opgenomen in fotonen / seconde / cm ² / steradiaal.
    3. Histologische en histomorfometrische analyse wordt uitgevoerd postmortem. Werkzaam Routine vlekken zijn Masson trichroom, aniline blauw, pentachrome en Picrosirius rood. Histomorfometrische analyse is eenvoudig uitgevoerd met ofwel aniline blauw of pentachrome vlekken, waarin osteoid er donker blauw en geel, respectievelijk. Pixels per high powered veld worden berekend met behulp van de toverstaf in Adobe Photoshop.

    7. Representatieve resultaten

    Omdat zowel de calvarial en femorale gebreken zijn kritische grootte, geen grote genezing worden verwacht zonder behandeling met groeifactoren of exogene stamcellen.

    Op het gebied van chirurgische manoeuvres, moet het spierzakje dissectie zijn langs de fascia vliegtuigen en dus een minimale bloeding moet worden aangetroffen. Hoewel het spierzakje model wordt bilateraal uitgevoerd, moet de muis te lopen met gemak op postoperatieve dag 1. Voor de calvarial gebrek, wordt bloedingen aangetroffen, maar kan worden geweekt met een Q-tip. Uiterst voorzichtig moeten worden genomen niet aan de onderliggende dura mater verwonden - want dit zal interfererenmet normale heling. Voor de FSD-model, wordt erop toegezien dat niet te verwonden van de grote bloedvaten geen te zware bloedingen of de femorale zenuw veroorzaken neurologische schade te voorkomen. Kirschner draden worden geboord met een lichte druk om niet het corticale bot in het te beschadigen.

    Figuur 1.
    Figuur 1. Preoperatieve voorbereiding op Femorale segmentaal defect (FSD) in athymische ratten. Mannelijke ratten (12-14 weken oud) zijn verdoofd onder isofluraan inademing. Het dijbeen is geschrobd en voorbereid per standaard protocol met betadine.

    Figuur 2.
    Figuur 2. Chirurgische blootstelling voor Femorale segmentaal defect (FSD) creatie. Een 27-30 mm longitudinale incisie wordt gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De buitenzijde van de femurschacht wordt vervolgens belicht door het scheiden van vastus lateralisen biceps femoris spieren.

    Figuur 3.
    Figuur 3. Fixatie voor Femorale segmentaal defect (FSD) creatie. Een polyetheen plaat (lengte 23 mm, breedte, 4 mm, hoogte, 4 mm) wordt op de anterolaterale oppervlak van de femur. De plaat bevat zes voorgeboorde gaten tot 0,9 mm diameter schroefdraad Kirschner draden tegemoet te komen. Inname van de plaat als een sjabloon, worden zes schroefdraad Kirschner draden geboord door de plaat en beide cortex. Vervolgens wordt een 6 mm midden diaphyseal defect gemaakt. Als dit eenmaal is uitgevoerd, wordt een op maat gemaakte steiger direct geplaatst en dat is precies het defect website past (niet afgebeeld).

    Figuur 4.
    Figuur 4. Voorbeeld van Calvarial Defect na de operatie. Een 4 mm, cirkelvormige calvarial defect wordt in de juiste wandbeen in muizen zonder thymus. Afgebeeld is hier een defectlocatie geïmplanteerdPSC's na 8 weken na de operatie. Let op de aanwezigheid van nieuw bot in het defect.

Discussion

De isolatie van PSC wordt goed beschreven elders 1-3, met inbegrip van een afzonderlijke indiening van Jove publicatie die specifiek gericht zijn PVC isolatie protocollen en methoden. Het specifieke doel van dit artikel is het beschrijven en 3 protocollen voor de PSC aan te tonen in vivo toepassing voor de botvorming / regeneratie. De SCID muis spier zakje is een veel beschreven model voor de menselijke ectopische botvorming 7. Belangrijke verschillen tussen ectopische en orthotope (defect) modellen voor het bot, met inbegrip van paracriene interactie met bot van de gastheer-vormende cellen 8, alsmede een overvloed aan osteogene signalering factoren aanwezig zijn in het skelet defect micro-omgeving. Twee defecten worden hier gepresenteerd, een calvarial defect8 en femorale segmentaal defect 4. Beide zijn goed gedocumenteerd om kritisch te zijn grootte (dat wil zeggen niet genezen op hun eigen).

Interessante verschillen bestaan ​​tussen calvarial en femorale gebreken. Ten eerste, decel: cel interactie tussen xenografted PSC's en endogene cellen is heel anders. In termen van een calvarial defect ODC interactie met de onderliggende dura mater (de buitenste laag van de vliezen), evenals de Osteoblasten en periosteale cellen die om het defect. Belangrijk is dat de interactie tussen geïmplanteerde cellen omringende osteoblasten 8 of geïmplanteerde cellen en de onderliggende duur (Levi et al.., In druk) zijn van cruciaal belang voor de normale stamcellen gemedieerd osteogenesis te gaan. In termen van de femorale segmentaal defect (FSD), worden xenografted PSC's blootgesteld aan een heel andere cel en cytokine omgeving. Zo is het FSD plaats uit het beenmerg en bijbehorende mesenchymale stamcellen en de endosteum, periosteum en lange been Osteoblasten. Theoretisch, elke cel heeft zijn eigen reactie op de verwonding, en ieder mag zijn cel: cel interacties met PSC xenotransplantaten.

Andere duidelijke verschillen bestaan ​​tussen calvarialen femorale gebreken. De calvarial botten in eerste instantie te vormen door middel van intramembraneuze ossificatie, terwijl de lange botten te vormen door middel van een kraakbeen tussenproduct (endochondrale ossificatie). Bovendien is de herstellende proces na het letsel ook bootst deze ontwikkeling ontstaan. Post-FSD, wordt het kraakbeen eeltvorming waargenomen, terwijl er geen kraakbeen intermediair wordt gevormd binnen een pariëtale botdefect. Tenslotte kan de embryonale oorsprong van de schedel verschillen van die van de lange botten. De meeste van de schedel (inclusief perivasculaire cellen - pericyten - in de gehele kop gebied) is afgeleid van het neurale (mesectoderm), terwijl de appendiculair skelet van paraxiale mesoderm afleiding 9. Al deze verschillen kunnen leiden tot significante verschillen in termen van PSC-gemedieerde botherstel.

Het gebruik van PSC's heeft een aantal voordelen ten opzichte van traditionele vet-afgeleide stromale cellen (ASC). PSC's hebben geen cultuur en zijn een gezuiverde celpopulatie which omvat geen andere stromale cellen die niet deelnemen aan - en kan zelfs negatief te reguleren - osteogene differentiatie, zoals endotheelcellen 10. In tegenstelling tot bijvoorbeeld, klonale analyses van ASC dat slechts een subpopulatie kunnen ondergaan osteogene differentiatie in vitro 11. Uiteindelijk zal skeletweefsel engineering inspanningen waarschijnlijk ook voorzien zijn van een osteocompetent stamcel (zoals PSC) met exogene groeifactoren en osteoconductief steiger (zoals HA-PLGA in de onderhavige werkwijzen) als de beste botdefecten genezen.

Disclosures

KT, BP, en CS zijn uitvinders van perivasculaire stamcel-gerelateerde octrooien van de UCLA. Drs. KT, en CS zijn oprichters van Scarless Laboratories Inc, die perivasculaire stamcel-gerelateerde patenten sublicenties van de UC Regenten. Dr Chia Soo is ook een officier van Scarless Laboratories, Inc

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de CIRM Vroege Translationeel II Research Award TR2-01821, NIH / NIDCR (subsidies R21 DE0177711 en RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ en RKS hebben T32 opleidingsbeurzen awards (5T32DE007296-14), JNZ heeft een CIRM opleiding gemeenschap (TG2-01169).

References

  1. Crisan, M. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).
  2. Chen, C. W. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).
  3. Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).
  4. Zara, J. Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model. Plast. Reconstr. Surg. Forthcoming (2010).
  5. James, A. W. Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo. Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).
  6. Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds. Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).
  7. Aghaloo, T. A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation. Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).
  8. Levi, B. Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts. Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).
  9. Leucht, P. Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135, 2845-2854 (2008).
  10. Rajashekhar, G. IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling. Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).
  11. Zuk, P. A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics