Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Neuroscience
 

Summary

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache, praktische Technik für zerebrovaskuläre Casting, das einfach durchzuführen ist und kann zur Abbildung des Gefäßbaumes der erwachsenen Gehirn der Maus eingesetzt werden.

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Walker, E. J., Shen, F., Young, W. L., Su, H. Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis. J. Vis. Exp. (57), e2958, doi:10.3791/2958 (2011).

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Abstract

Vascular Imaging ist von entscheidender Bedeutung in der klinischen Diagnose und Behandlung von zerebrovaskuläre Erkrankungen, wie z. B. Gehirn arteriovenöse Malformationen (BAVMs). Tiermodelle sind notwendig für das Studium der Krankheitsverlauf und mögliche Therapien für zerebrovaskuläre Erkrankungen. Imaging das Gefäßsystem in großen Tiere ist relativ einfach. Allerdings ist die Entwicklung Schiff bildgebenden Verfahren der murine Gehirnerkrankung Modelle wünschenswert, aufgrund der Kosten und der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mauslinien. Imaging der Maus zerebrale vaskuläre Baum ist eine Herausforderung. Bei Menschen und größere Tiere, der Goldstandard für die Beurteilung der Angioarchitektur am makrovaskuläre (Leitwert) Ebene ist x-ray Katheter Kontrastmittel-basierte Angiographie, eine Methode nicht für kleine Nager geeignet.

In diesem Artikel präsentieren wir eine Methode für zerebrovaskuläre Casting, dass eine dauerhafte Skelett des gesamten Gefäßbett produziert, einschließlich Arterien, Venen und Kapillaren, die analysiert werden kann mit vielen dUNTERSCHIEDLICHE Modalitäten. Komplette Besetzung der Mikrogefäßen der Maus cerebrovasculature kann schwierig sein, aber diese Herausforderungen sind in diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll ansprechbar. Durch intrakardiale Perfusion des Gefäßsystems Gießmasse, sind alle Gefäße des Körpers gegossen. Das Gehirn kann dann entfernt und geklärt werden mit dem organischen Lösungsmittel Methylsalicylat. Dreidimensionale Bildgebung des Gehirns Blutgefäße können einfach und kostengünstig visualisiert werden mit jedem herkömmlichen Hellfeld-Mikroskop oder Binokular. Die gegossenen cerebrovasculature können auch abgebildet und quantifiziert werden mit Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) 1. Darüber hinaus, nachdem er abgebildet, kann das Gehirn in Paraffin gegossen für die histologische Analyse eingebettet werden.

Der Vorteil dieser vaskulären Gießverfahren als mit anderen Techniken verglichen wird seine breite Anpassung an verschiedene Analyse-Tools, einschließlich Hellfeld mikroskopische Analyse-, Scan-CT aufgrund der röntgendichten Zeichenteristic des Materials, sowie histologische und immunhistochemische Analyse. Diese effiziente Nutzung von Gewebe zu speichern Tier-Nutzung und die Kosten zu senken. Wir haben vor kurzem Anwendung dieser Methode auf die unregelmäßigen Blutgefäße in einem Mausmodell der erwachsenen BAVM auf einer mikroskopischen Ebene 2 sichtbar zu machen, und liefern zusätzliche Bilder des fehlerhaften Schiffe, die von Mikro-CT-Scan abgebildet demonstriert. Obwohl diese Methode hat Nachteile und ist möglicherweise nicht ideal für alle Arten von Analysen, ist es eine einfache, praktische Technik, die leicht erlernt werden können und weit zu vaskulären Gießen von Blutgefäßen im ganzen Körper aufgetragen.

Protocol

1. Clearing Blut aus Gefäßsystem

  1. Anesthetize Maus durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Ketamin mit 10 mg / kg Xylazin in 0,25 ml Kochsalzlösung verdünnt.
  2. Nach Betäubung durch keine Reaktion auf eine Pfote Prise bestätigt worden, mit einer Schere einen Schnitt quer über die Brust zu machen mit einer Schere knapp unter dem Schwertfortsatz, durch die Membran geschnitten, und zerschnitten zwischen dorsalen und ventralen Segment der Brustkorb zu Brusthöhle aussetzen. Expose Herzen durch Hochklappen Brustbeins und der angrenzenden Brustwand und sicher mit hemostat. Öffnen Sie den Herzbeutel mit einer Pinzette in das Herz freizulegen.
  3. Schalten Sie Perfusionspumpe (100 mmHg Druck), verbunden mit PBS plus Heparin (5 Einheiten / ml)-Lösung in heißen Wasserbad bei 37 ° C und Schläuche mit einem stumpfen 22-Gauge-Nadel auf den Abfluss. Warmer
  4. Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer, in der Nähe der Herzspitze. Unmittelbar schnitt den rechten Vorhof zur systemischen Blut Abfluss zu ermöglichen und spülen, bis das Blut is aus dem Verkehr gezogen.

2. Perfusion von Casting-Agenten in das Gefäßsystem

  1. Bereiten Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) Gießlösung pro Protokoll des Herstellers: Mix 5 ml MV Verdünnungsmittel mit 4 ml des gefilterten MV-Verbindung. Fügen Sie 450μl (5%) des Katalysators (MV Härter). Lösung Arbeitszeit beträgt 20 Minuten, sondern mischen unmittelbar vor der Anwendung die richtige Viskosität gewährleisten.
  2. Ziehen Casting-Agent-Lösung in eine 10ml Spritze, legen einen stumpfen 20-Gauge-Nadel auf die Spritze und füllen Nadel mit Lösung.
  3. Setzen Sie die Nadel in die linke Herzkammer durch das gleiche Loch für die Spülung des Blutes eingesetzt. Sichere Nadel in Stelle mit hemostat Klemme am Herzen.
  4. Inject Casting-Agent-Lösung langsam in den linken Ventrikel bei ca. 3 ml / min. Überdruck kann zu falschen Fluss der Casting-Agenten oder potentielle Schiff Bruch führen.
  5. Achten Sie auf Anzeichen für eine erfolgreiche Perfusion, darunter: Visualisierung von castIng.-Agent in Darm und Leber Gefäßsystem, distalen Gliedmaßen Verfärbung und Nase und Zunge verfärbt. Nachstellen Nadel ggf. richtige Durchblutung zu erreichen.

3. Erhebung und Verarbeitung von Tissue

  1. Entfernen Gehirn und in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C.
  2. Entwässern des Gehirns, indem sie aus Paraformaldehyd direkt in zunehmendem Maße konzentriert EtOH bei Raumtemperatur: 25% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 2 Tage, und 100% EtOH, 2 Tage .
  3. Klären Hirngewebe um die Blutgefäße durch Eintauchen der perfundierten Gehirn in Methylsalicylat für 2 Tage bei Raumtemperatur.
  4. Gefäßsystem des gesamten ungeschnittenen geklärt Gehirn mit Gehirn in Methylsalicylat unter einem Binokular (Abb. 1) (Leica MZFL III Mikroskop Leica Microsystems, Bannockburn, IL) oder Hellfeld-Mikroskop (Abb. 2) (Leica DM / eingetaucht abgebildet werden LS, Leica Microsystems).
  5. Reclarificationkann getan werden, wenn Gewebe ist nicht vollständig geklärt werden. Von Methylsalicylat, Transfer Gehirn zu 95% EtOH für 2 Tage, 100% EtOH für 2 Tage, und Methylsalicylat für 2 Tage.

4. Micro-CT-Bildgebung oder histologische Application-Tissue Vorbereitung

  1. Das Gehirn kann abgebildet mit Mikro-CT unmittelbar nach Klärung oder nach Rehydrierung (Abb. 4).
  2. Zur Vorbereitung Hirngewebe für die histologische Analyse, rehydrieren das Gehirn durch serielle Verdünnung EtOH: 100% EtOH, 1 Tag, 95% EtOH, 1 Tag, 75% EtOH, 1 Tag, 50% EtOH, 2 Tage, 25% EtOH, 2 Tage , und speichern in PBS. Das Gehirn kann dann in Paraffin mit einem Standard-Verfahren eingebettet werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

Nach Kreislauf-Casting, können die cerebrovasculature makroskopisch an der Hirnoberfläche (Abb. 1a) zu sehen. Die Gefäßbaumes im Parenchym visualisiert folgende Klarstellung werden (Abb. 1B). Die detaillierten Gefäßstrukturkönnen abgebildet und analysiert werden unter einem Mikroskop Hellfeld (Abb. 2), Binokular (Abb. 3), und mit Mikro-CT-Scan (Abb. 4). Mit Hellfeldmikroskopie, können die Gefäße in verschiedenen Fokusebenen ohne Schneiden des Gehirns (Abb. 2A) sowie individuelle Mikrogefäßen bei höherer Vergrößerung (Abb. 2B) eingesehen werden. Unter einem Binokular, kann man das gesamte vaskuläre Struktur in einer Brennebene zu sehen, die eine bessere Visualisierung der dreidimensionalen Struktur des cerebrovasculature (Abb. 3). Bilder unter einem Binokular genommen werden zeigen großes Schiff Morphologie und ganze Gehirn Gefäßsystem, aber nicht über die Details in Bildern mit Hellfeld-Mikroskopie (Abb. 2B) übernommen gezeigt. Diese Technik hat uns erlaubt, unregelmäßige Schiffe in unserer experimentellen BAVM erwachsenen Maus-Modell 2 zu erfassen. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel aus dem gleichen unregelmäßige Gefäße durch Mikro-CT-Scan (Abb. 5A) und Hellfeld (Abb. 5B) erkannt. Gemeinsam, zeigt diese Daten, können wir t analysierener dieselbe Probe mit mehreren bildgebenden Verfahren nach vaskulären Gießen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Whole Gehirn der Maus nach einer Gefäßverletzung Gießen. Vor (A) und nach (B) Klärung durch Methylsalicylat Lösungsmittel. Schiffe werden übersichtlich visualisiert auf der Hirnoberfläche (A) und in Parenchym folgende Klarstellung Verfahren (B).

Abbildung 2
Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskop Bilder von geklärt vaskulären gegossen Gehirn. Gehirn kann auf verschiedenen Ebenen und in verschiedenen Vergrößerungen abgebildet werden. Maßstabsbalken 200 um (A) und 50 um (B).

Abbildung 3
Abbildung 3. Präpariermikroskop Bild mit 1x zeigen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus cerebrovasculature aus einer Dorsalansicht.

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Abbildung 4. Micro-CT-Scan-Bild der gleichen gesamten erwachsenen Gehirn der Maus in Abbildung 3 aus einer dorsalen Ansicht dargestellt.

Abbildung 5
Abbildung 5. Einsatz von vaskulären Gießverfahren ein Gehirn arteriovenöse Missbildung zu erkennen. A) Micro-CT-Scan der vaskulären gegossen Gehirn zeigt Region vergrößert, unregelmäßig AVM-wie Schiffe in der rechten Hemisphäre von einer Ventralansicht. Größeres Bild der Region (white box) ist auf der rechten Seite angezeigt. B) Gleiche unregelmäßige Gefäße sichtbar unter Hellfeld-Mikroskop bei 50facher Vergrößerung. Maßstabsleiste 50 um.

Discussion

Wir berichten hier ein Verfahren zum Gießen von erwachsenen Maus cerebrovasculature, die mit verschiedenen Modalitäten abgebildet werden können. Die Anwendung dieser Methode, um die Krankheit Modell BAVM ermöglicht 3D-Analyse von unregelmäßigen Gefäßen. Mögliche zukünftige Studien umfassen die Quantifizierung der Mikro-CT-Aufnahmen, histologische Analyse der Gewebe und Diagnose von Gefäßerkrankungen Progression.

Häufigsten auftretenden Probleme und Anregungen

Komplette Durchblutung des Gehirns Gefäßsystem ist nicht immer erreicht. Nachdem genügend Druck auf die distalen Blutgefäße, ohne aufzureißen den linken Vorhof oder Aorta zu erreichen ist eine Herausforderung. Um dies zu überwinden, um für einheitliche Druck von ungefähr 100 mmHg. Stellen Sie auch Nadelposition geeignete Abfluss von Casting-Agenten in die Aorta zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Halsschlagadern sind nicht beschränkt, so dass die Casting-Agenten der Hirngefäße erreichen können. Kritische Verfahren, die mit verbesserter kleinen Schiff und korrelierenFusion sind: (1) ordnungsgemäße Abwicklung von Blut aus dem Gefäßsystem, (2) Filtration der Casting-Agent, und (3) Nadel Platzierung bei Casting-Agenten Injektion. Es ist darauf zu Injektion von Casting-Agenten in den linken Vorhof und der Lunge zu vermeiden. Andere Forscher haben erfolgreich Maus 3 und 4 Ratten cerebrovasculature ohne den Einsatz zusätzlicher Verfahren perfundiert. Manuelle Analyse Microfil perfundierten Gefäße gegengefärbt mit Hämatoxilin zeigten 93% Gefäßlumen Perfusion 5. Immer verwerfen oder völlig sauber jedes Werkzeug, das in Kontakt mit dem Casting-Agenten kommt es schnell wird polymerisieren und Werkzeuge können nicht für mehrere Personen verwendet werden. Die Klärung der umgebenden Gehirngewebe der Maus kann eine Herausforderung sein. Nach dem Eintauchen in Methylsalicylat, kann das Gewebe noch undurchsichtig erscheinen, so dass Schiff Bildgebung schwierig. Sicherstellung der ordnungsgemäßen Entwässerung und Klarstellung sollte dieses Problem lösen. Platzieren Hirngewebe auf einer Wippe in Alkohol und Methyl-salicylate Behandlung verbessern kann Gewebe Klärung.

Nachteile dieser Technik

Die Grenzen dieser Technik sind: (1) ist es notwendig, die Casting-Agent-Lösung unmittelbar nach dem Mischen, wie es schnell wird dicker, nachdem der Katalysator zugegeben injizieren, (2) die Casting-Agenten füllt große Leitfähigkeit Schiffe leicht, aber es funktioniert nicht zuverlässig füllen kleinere Schiffe, wie Arteriolen (Widerstandsgefäße) und Kapillaren (nutritive Gefäße) und (3) es ist nicht die beste Röntgenkontrastmittel für die Mikro-CT-Bildgebung, obwohl einige Gruppen Microfil lieber für die Mikro-CT-Bildgebung 1,6. Im Anschluss an die Vorschläge oben vorgeschlagen, darunter richtige Nadel Platzierung, Position des Schiffs und Perfusionsdruck, Ergänzen Gießen von kleineren Schiffen erreicht werden. Die Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Analyse-Tools macht dieses Anbieters zu einem wertvollen Werkzeug für die Analyse von zerebrovaskulären Struktur, einschließlich arteriellen und venösen Kreislauf, mit verschiedenenPerspektiven.

Anwendungen dieser Technik

Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner breiten Anwendungspotenzial. Die Besetzung füllt alle Schiffe, einschließlich Arterien, Venen und Kapillaren aller Gewebe im Körper, so vaskulären Strukturen in mehreren Organen verschiedener Spezies analysiert werden kann. Zuvor haben andere Gruppen dieser Perfusion für große 7 und kleine 8 Schiffe in Mensch, Affe 9, Schafe 10, Ratte 4,11,12 und Maus 3,13 verwendet. Wir zeigen nun, Beweise für die Verwendung dieser Technik in die Analyse der Struktur von Mikrogefäßen im Gehirn der Maus, sowohl in gesunden und kranken Zustand 2. Darüber hinaus gibt es Microfil Lösungen mit verschiedenen Viskositäten erhältlich, um Schiffe in verschiedenen Größen und verschiedenen Farben perfuse, um die Visualisierung der Gefäße in verschiedenen Organen zu verbessern. Zum Beispiel kann rot werden einfach visualisiert in den blassen Hirnparenchym und Gelb kontrastiert gut mitdunkelrote Myokard. Außerdem ist, wie das Material radiopaque, können Gefäße mit Mikro-CT-Scannen zu einem 3D-Bild zu erhalten drehbare abgebildet werden. Das Gewebe kann auch für Paraffinschnitte und histologische Analyse, nachdem er abgebildet werden.

Abschluss

Wir zeigen hier ein Protokoll zu einem Gefäßpräparat der Blutgefäße der erwachsenen Gehirn der Maus, die angepasst mit einer Vielzahl von Analyse-Techniken, um die morphologische Struktur der cerebrovasculature Studie kann zu machen. Wir haben auch Beweise für die Anwendung dieser Methode auf ein Modell der BAVM Krankheitszustand vorgesehen, vertreten durch vergrößert, unregelmäßig geformte Gefäße, Shunt-Blut von arteriellen und venösen Kreisläufe. Es gibt eine Vielzahl von vaskulären Gießverfahren zur Verfügung. Das einfache Protokoll bieten wir hier für eine Gefäßpräparat kann als Werkzeug genutzt werden, um das Gefäßsystem des erwachsenen Gehirn der Maus mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu untersuchen.

Disclosures

Experimentelle Verfahren für den Einsatz im Labor Tiere wurden durch das Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California, San Francisco (UCSF) zugelassen.

Acknowledgements

Die Autoren danken Voltaire Gungab für die Unterstützung bei Manuskripts. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus unterstützt: die National Institutes of Health (T32 GM008440 zu EJ Walker, R01 NS27713 zu WL Young, P01 NS44155 zu WL Jung und H. Su) und R21 NS070153 H. Su, und die amerikanische Heart Association (AHA 10GRNT3130004 H. Su).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microfil FlowTech MV130 4 month shelf life
Methyl Salicylate Fisher Scientific O3695-500 to clarify tissue

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