蛋白膜覆盖含量:一个协议测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用在体外

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Summary

测试是必不可少的蛋白质 - 蛋白质相互作用蛋白质功能的夹层。在这里,我们引入

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Ueki, S., Lacroix, B., Citovsky, V. Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (54), e2961, doi:10.3791/2961 (2011).

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Abstract

验证不同的蛋白质之间的相互作用是至关重要的,为在分子水平上的生物学功能的调查。有几种方法, 在体外体内 ,以评估蛋白结合,并应进行至少有两种方法,相互补充的缺点,以获得可靠的见解。

对于一个在体内实验中,双分子荧光互补(附设)检测最流行 ​​的,至少侵入的方法,使检测活细胞内蛋白质相互作用,以及识别细胞内相互作用的蛋白质1,2的本地化。在这个实验中,测试蛋白质融合GFP或它的变种N -和C -末端非荧光半,两个融合蛋白汇聚由于测试的蛋白质“相互作用时,荧光信号是重组 3-6 。因为它的信号很容易epifluorescence或共聚焦显微镜检测,附设已经成为一个强大的工具,在细胞3中蛋白质相互作用的研究细胞生物学家之间的选择。然而,这个实验中,有时会产生假阳性结果。例如,荧光信号可以安排尽可能远离对方因7纳米包装在一个小的亚细胞车厢关闭两个GFP片段重组,而由于特定的相互作用 7 。

由于这些限制,从活细胞成像技术所取得的成果,应确认由一个独立的方法的基础上,检测蛋白质相互作用的原理不同。免疫共(联合IP)或谷胱甘肽转移酶(GST)的代表等,通常用于分析蛋白质相互作用,在体外Pull - down实验的替代方法。然而,IIN这些实验,然而,测试的蛋白质一定要容易溶于supportsused结合反应的缓冲区。因此,具体涉及一种不溶性蛋白质的相互作用,不能由这些技术进行评估。

在这里,我们说明了蛋白质膜覆盖结合试验,从而绕过这个困难的协议。在这种技术中,可以可靠地测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用,因为固定在膜基质的蛋白质之一。这种方法, 在体内实验,如附设结合,提供了一个可靠的方法,调查和定性可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用忠实。在这篇文章中,烟草花叶病毒(TMV)之间具有约束力的运动蛋白(MP),发挥多种功能,在病毒的细胞与细胞之间的运输8-14,以及最近发现植物细胞interactor,烟草含有锚蛋白重复蛋白(ANK 15),证明使用这种技术。

Protocol

1。表达和提取的蛋白质

  1. 差异标记要为他们的检测测试的蛋白质。标签膜(ProIM)被固定在一个尺寸较大的标签(例如,消费税),非融合标签可以使用一个固定的阴性对照组(ProIMnc)的蛋白质。标签用于大型或一个小标签作为一种可溶性的探头(ProSOL)的蛋白质。保险丝相同的标记,以一个合适的阴性对照的可溶性蛋白(ProSOLnc),包括在互动中检测,以确认检测约束力的特异性。
  2. 选择蛋白表达系统表达标记蛋白,即大肠杆菌大肠杆菌 ,杆状病毒等,根据潜在的翻译后修饰和蛋白质的产量的要求。
  3. 从选择的有机体,使用SDS - PAGE电泳上样缓冲液(20%的甘油,4%SDS,20毫米的Tris - HCl,pH6.8)含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(步骤1.2)中提取 ProIM和ProIM NC。在室温为15分钟的保留细胞悬液,加入0.5%2 - 巯基乙醇和煮沸5分钟。
  4. 从选择的有机体,使用标准协议16(步骤1.2)中提取ProSOL和ProSOL NC。这些蛋白质应该很容易在结合缓冲液中的可溶性(2毫米EDTA,140毫米,10毫米氯化钠,pH值7.4的Tris - HCl,2毫米的数码地面电视服务,1%BSA,0.1%吐温20)的步骤4.1中使用。
  5. 确定重组的蛋白质,如Bio - Rad公司蛋白测定试剂盒,使用一种标准的方法的浓度。 Bio - Rad公司蛋白检测试剂盒等。如果原油中提取,纯化的蛋白质,而不是,是用来检测,估计相应频段的光密度扫描SDS -聚丙烯酰胺凝胶染色用考马斯亮蓝R - 250和使用已知浓度的蛋白质,这种提取物的兴趣BSA的浓度作为参考。

2。固定在膜ProIM和ProIMnc

  1. 解决两套提取,每个SDS -聚丙烯酰胺凝胶含有1微克ProIM和ProIM NC根据标准协议16。
  2. 电泳后,转移地方凝胶在转移缓冲液100毫升(60毫米甘氨酸,10毫米三,0.0006%SDS,20%甲醇)中,轻轻摇动孵育在室温为20分钟。
  3. Electrotransfer包含在凝胶中根据标准协议 16至硝酸纤维素膜上的蛋白质。

3。膜结合的蛋白质重新折叠

  1. electrotransfer后,孵育15分钟在15毫升的缓冲膜(30毫米的Tris - HCl pH7.4的0.05%吐温20),轻轻摇动,以去除残留的SDS。
  2. 经过仔细排水,转移膜的变性缓冲(7米盐酸胍,2毫米EDTA,50毫米数码地面电视,50毫米的Tris - HCl pH值8.3)至25毫升。孵育2小时,在室温下轻轻摇动。 (注:在变性缓冲液孵育时,硝酸纤维素膜变得不透明)。孵育2小时,在室温下轻轻摇动。
  3. 膜转移至25 ml的TBS(10毫米的Tris - HCl,150 mM氯化钠,pH值7.4),轻轻摇动孵育5分钟(注意:在此步骤中,膜恢复原有的白色)。
  4. 膜转移至25毫升的结合缓冲液(见第1.2步),并在4℃,轻轻摇动孵育过夜另。

4。通过ProSOL探测的ProIM

  1. 切成条状,既包含ProIM和ProIM NC膜。
  2. 稀释1-10微克或10毫升新鲜的结合缓冲液中,无论是ProSOL ProSOLnc准备的ProSOL和ProSOLnc杂交解决方案。膜转移到每个ProSOL或ProSOLnc杂交液和孵育1.5 h在室温轻轻摇动。
  3. 取出膜杂交的解决方案,并在TBS电视台每15分钟冲洗三次。

5。可视化免疫印迹蛋白质相互作用

  1. 座膜在室温下1小时与2.5%的脱脂奶粉TBST(10毫米的Tris - HCl,140 mM氯化钠,0.05%吐温20,pH值7.4)。在制造商建议的浓度在0.5%的脱脂奶粉TBST稀释的主要抗体(抗- strepII多克隆兔抗体)。
  2. 堵塞膜放置在抗体溶液,在室温下1小时或一夜之间孵育4℃,轻轻摇动。
  3. 在15分钟20毫升TBST冲洗膜,并两次在室温下轻轻摇动5分钟。
  4. 稀释与辣根过氧化物酶(HRP)的制造商建议的浓度在0.5%的脱脂奶粉TBST标记的第二抗体(抗兔IgG抗体)。将在二级抗体的膜解决方案,并在室温下轻轻摇动1小时孵化。
  5. 在15分钟20毫升TBST冲洗膜,并两次在室温下轻轻摇动5分钟。最后的TBS冲洗后,可视使用HRP化学发光底物(例如,Millipore公司的Immobilon西部发光辣根过氧化物酶底物)的蛋白 - 蛋白相互作用。
  6. 探头与融合ProIM,通过适当的辅助步骤5.1至5.4的抗体标记抗体相同的膜。可视化ProIM和ProIMnc中所述的步骤5.5来验证身份的蛋白膜覆盖法(步骤5.5)中获得的频段。在大多数情况下,剥离是没有必要,因为这一步得到的信号是比从步骤5.5中获得的剩余信号强多了。

6。代表性的成果:

附设在烟草表皮细胞(图1A)ANK - MP的相互作用。由于MP是一种高度不溶性蛋白质,在细菌或植物中的表达时,蛋白膜覆盖法通过,以验证这种在体外的相互作用(图1B )。蛋白提取物中含有1微克的GST - MP(ProIM)或者未熔化的商品及服务税(ProIM NC)的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸纤维素膜,由electrotransfer解决。当这些ProIMs探讨可溶性ANK strepII(ProSOL),GST - MP,但不是非融合商品及服务税,展出具有约束力(图1B,泳道1,2,比较泳道5,6)。此外,当同一组的ProIMs无关ProSOLnc,即标签strepII(NADH3 strepII) 拟南芥胞质 NADH激酶,没有约束力不遵守,探讨进一步证明ANK - MP相互作用的特异性(图1B,车道3,4)。

图1
图1。烟草ANK特异性结合烟草花叶病毒在体内体外的MP 。 (一)ANK - MP在生活附设检测烟草表皮细胞的相互作用。强YFP的信号重建时,MP和ANK,C端和N -端半YFP的,分别融合,在烟草表皮microbombardment其编码基因共表达。这附设信号在puncta积累在细胞外围,这是15胞间连丝的诊断。 (二)ANK - MP 在体外的相互作用检测蛋白膜覆盖检测。 15%SDS聚丙烯酰胺凝胶electrotransfer随后到硝酸纤维素膜,蛋白提取物中含有1微克的GST - MP(ProIM),或者未熔化的商品及服务税(ProIMnc)解决。 GST - MPProIM和GSTProIMnc孵育0.5微克/毫升ANK strepII(ProSOL),ANK约束力是通过探测与反strepII多克隆抗体的膜,抗兔IgG + M二级抗体偶联检测辣根过氧化物酶(泳道1和2)。无论是GST - MPProIM也不GSTProIMnc互动与融合strepII标签(ProSOLnc,泳道3和4),一个不相关的蛋白拟南芥胞质NADH激酶。在这个实验中观察到的乐队的身份被确认通过探测与抗GST抗体(5和6车道)膜。变性缓冲处理,而不会被用缓冲液A洗涤,当膜的GST - MP绑定ANK丢失,而不明身份的GST - MP和消费税contining蛋白提取物中的蛋白质与ANK - strepII反应,表现出的重要性步骤3.1之前的变性过程(7和8)。

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Discussion

这种方法适用于检测蛋白质相互作用的蛋白质之间的组合,当至少有一个,其中的蛋白质很容易结合缓冲液中的可溶性,并成功地应用到其他结合蛋白17,18。不能测试都是在这些条件下的不溶性蛋白质之间的iInteractions本议定书。

此外,ProIM成功复性检测的关键。漂洗后的electrotransfer在TBS的膜是关键的一步,因为残留的SDS损害变性/复性过程。

最后,为了避免非特异性结合,对ProSOL的结合缓冲液中的浓度不得超过1微克/毫升。 ProSOL这是过于集中,可能会出现非特异性结合ProIM。此外,为了阻止在步骤4.2中使用的杂交缓冲液中的固定膜蛋白的非特异性结合ProSOL,BSA的可替代脱脂牛奶。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

在我们的实验室的工作是从国立卫生研究院,美国农业部国家粮食和农业研究所,国家科学基金会,巴德,能源部和BSF拨款到VC支持

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein assay kit Bio-Rad 500-0001
Proteinase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich S8820
Mini-PROTEAN system Bio-Rad 165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system Bio-Rad 170-3940
Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase GenScript A00098
Anti-GST rabbit polyclonal antibody GenScript A00097
Anti-strepII GenScript A00626
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane Pall Corporation 27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate EMD Millipore WBKL S0 050

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Comments

1 Comment

  1. how i can make experiment about proteins ?
    what are the proteins reactions?the reactants and products and tools and the methods od the experiments ?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 1:06 PM

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